Микроволновое восстановление хитосан-покрытого оксида графена для адресной доставки адриамаicina и усиленной терапии рака груди

Аннотация

Для достижения лучшей антиопухолевой эффективности срочно необходимо улучшить эффективность доставки антираковых препаратов в раковые клетки. В работе хитосан-функционализированный оксид графена (ChrGO) нанолисты изготовлены микроволновым восстановлением, применялись как внутриклеточная наносистема доставки антиракового агента в клетках рака груди. Исследование загрузки и выпуска препарата показало, что адриамаицин эффективно загружается на ChrGO нанолисты и высвобождается из них. Меньший выпуск препарата при доставке и лучшая биосовместимость ChrGO/адриамаицин значительно повышают безопасность и терапевтическую эффективность в HER2-гиперекспрессирующих клетках BT-474. Кроме того, ChrGO/адриамаицин в комбинации с трастузумабом демонстрировал синергистическую антиопухолевую активность в клетках BT-474, превосходящую каждый препарат по отдельности. Клетки, обработанные трастузумабом (5 мкг/мл) или эквивалентным ChrGO/адриамаицином (5 мкг/мл), давали 54,5% и 59,5% гибели клеток соответственно, тогда как комбинированное лечение трастузумабом и ChrGO/адриамаицином привело к драматическим 88,5% гибели клеток. Двойная адресная терапия показала более высокое апоптоз, указывая на превосходную терапевтическую эффективность благодаря разным механизмам действия. Комбинированное лечение ChrGO/адриамаицином и трастузумабом в клетках BT-474 индуцировало остановку клеточного цикла и апоптоз, в конечном счете приводя к гибели усиленного числа раковых клеток. Работа предоставила простой микроволновой метод изготовления ChrGO как контролируемой и адресной внутриклеточной наносистемы доставки препаратов, которая ожидается как перспективная терапия для лечения HER2-гиперекспрессирующих клеток рака груди.

Введение

HER2 рецептор — член семейства EGFR рецепторов, медиационирующий рост и дифференциацию раковых клеток, высоко гиперекспрессирован в 20–30% человеческих раков груди, ведущий к метастатическому фенотипу и плохой прогнозе [1]. HER2 также гиперекспрессирован примерно в 20% человеческих раков желудка [2]. Трастузумаб, гуманизированная мононаclonal терапевтическая антител, демонстрирует перспективные терапевтические преимущества как первая линия терапии у пациентов с HER2-гиперекспрессией рака груди [3]. Однако общий уровень ответа на трастузумаб остается умеренным: 15–30% при монотерапии и 50–75% в комбинированном лечении с химиотерапевтическими препаратами [4]. Среди отвечающих пациентов большинство в конечном счете прогрессируют после первоначального ответа и приобретают резистентность после непрерывного лечения [5]. Таким образом, необходимо и нужно разрабатывать дополнительные новые терапии для HER2-гиперекспрессирующих пациентов для улучшения общих показателей выживаемости.

Антрациклины остаются основой лечения рака. Среди антрациклинов ингибитор топизамеразы II адриамаицин широко применяется для лечения многих раков: груди, легких, лимфоидных [6]. Адриамаицин эффективен при HER2-гиперекспрессирующем раке груди из-за близости гена HER2 и гена топизамеразы II [7]. Несмотря на клиническую пользу антрациклиновых терапий при раке груди, сердечная дисфункция ограничивает более широкое применение. В клинических испытаниях трастузумаб в комбинации с адриамаицином демонстрировал значительную эффективность, но высокозависимая кардиотоксичность была проблемой [8]. Устойчивый выпуск химиотерапевтических агентов в ткани мишени признан хорошим решением для снижения доз, необходимых для терапевтической эффективности, и улучшения профилей безопасности [9]. Для лучшей антиопухолевой эффективности при меньших побочных эффектах срочно нужно улучшить эффективность доставки антираковых препаратов в раковые клетки.

На основе оксида графена (GO) наноматериалы проявили большой потенциал в контролируемой доставке химиотерапевтических агентов [10]. Многочисленные исследования показали, что токсичность GO ассоциирована с его поверхностной функционализацией [11]. Недавно экологически дружественные агенты, такие как хитосан и PEG, сообщали о функционализации GO менее токсичными поверхностными группами [12,13]. Коллоидная стабильность наночастиц в биологических средах критична для разработки эффективных и безопасных систем доставки препаратов для клинического использования [14]. Функционализированные GO нанолисты привлекли внимание в биомедицинских приложениях благодаря биосовместимости и стабильности. Как отличный кандидат для графеновых биоматериалов, коллоидная стабильность GO или rGO важна для контроля характеристик препаратов-носителей. PEG-функционализированный GO показал улучшенные коллоидные свойства в средах клеточных культур [15]. П. Кханра сообщил новый метод одновременного восстановления и биофункционализации GO дрожжевыми клетками как редуктивными биокатализаторами [16,17]. Авинав Г представил одноконтейнерный биосинтез GO с использованием дрожжевого экстракта в автоклавном процессе [18]. Соникационное лечение микрометровых GO листов часами давало GO нанолисты с более высокой коллоидной стабильностью по сравнению с обычными микрометровыми GO [19]. Хотя предыдущие работы демонстрировали высокий потенциал GO для биоматериалов, биофункционализированные GO нанолисты с хитосаном микроволновым восстановлением с использованием безклеточного дрожжевого экстракта не изучались доселе. В этой цели новая хитосан-функционализированная структура оксида графена (ChrGO) построена простой микроволновой системой синтеза, использующей дрожжевой экстракт как редуктант. Более того, эффективная функционализация GO биосовместимым хитосаном предоставляет потенциальную платформу для эффективной загрузки и доставки препаратов. Исследования загрузки и выпуска показали, что адриамаицин эффективно загружается на ChrGO нанолисты и высвобождается из них. ChrGO/адриамаицин композиты показали значительную антиопухолевую активность в дозозависимом режиме. Особенно комбинированное лечение ChrGO/адриамаицином и трастузумабом дало усиленный эффект ингибирования роста в клетках BT-474 по сравнению с монотерапией. Синергетическая антиопухолевая эффективность этих агентов раскрыта как посредствованная через остановку клеточного цикла и апоптоз, в конечном счете приводящая к гибели раковых клеток. Работа сообщила перспективный путь для быстрого и стоимостно-эффективного производства ChrGO композитов, доставляющих химиотерапевтические агенты в пространственно-временном контролируемом режиме для эффективного лечения рака (Схема 1).

Материалы и методы

Материалы

Графитовый порошок — Qingdao Huatai Tech (Qingdao, Китай). Хитосан и адриамаицин — Aladdin Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Трастузумаб — Hoffmann-La Roche Ltd (Базель, Швейцария). RPMI-1640, DMEM, fetal bovine serum (FBS) — Invitrogen Corporation (Камарилло, США). Amicon® Ultra центрифужные фильтры — Merck Millipore. CellTiter 96® водный раствор один анализ пролиферации клеток и Caspase-Glo® 3/7 анализ системы — Promega Corporation (Мэдисон, США). Сухие дрожжи пекаря — AB/Mauri Co., Ltd. Клеточные линии BT-474 и Cos-7 — Клеточный банк Китайской академии наук (Шанхай, Китай). Luria–Bertani среда — Sangon Biotech Co., Ltd. Все химикаты аналитического чистоты, коммерчески доступны без дополнительной очистки.

Микроволновое восстановление хитосан-функционализированного GO

Оксид графена (GO) приготовлен из нативных графитовых хлопьев модифицированным методом Хуммера [14]. Для получения однослойного наноразмерного GO, GO эксфолировали ультразвуковым зондом (Scientz, Китай) 800 Вт 8 ч. Эксфолированный GO диспергировали в деионизированной воде. Частично восстановленный хитосан-GO (ChrGO) нанолисты синтезированы микроволновым восстановлением GO с водным раствором хитосана в микроволновой системе синтеза. Безклеточный дрожжевой экстракт использовался для биосинтеза ChrGO микроволновым восстановлением. Сначала заготовленные дрожжевые клетки активировали посевом в среду Luria–Bertani и взбалтыванием 135 об/мин 18 ч при 25 °C. Активированные дрожжевые клетки перенесли в 2% сахарозный раствор, взбалтывали 135 об/мин еще 6 ч при 25 °C. Затем 6 мл безклеточного дрожжевого экстракта получен центрифугированием 2000 об/мин 5 мин. 50 мг хитосана растворили в 25 мл 2% (об/об) ацетинового раствора и смешали с дрожжевым экстрактом [20]. 5 мг GO раствора добавили при интенсивном магнитном помешивании. Полученный раствор перенесли в микроволновое синтетическое оборудование NOVA-2S (PreeKem Scientific Instruments, Китай) для микроволновой реакции. Схема нагрева: нагрев до 80 °C за 5 мин, удержание температуры еще 5 мин. Полученный ChrGO очистили фильтром 100 кДа MWCO (Millipore, США) и сублимировали для дальнейшего использования.

Характеризация

TEM изображения наноразмерного GO получены на JEM-2100 трансляционной электронной микроскопе с ускоряющим напряжением 200 кВ (JEOL, Япония). UV-Vis спектры — UV/Vis/NIR спектрофотометр Lambda 950 (Perkin-Elmer, США). FTIR спектры — Vertex 70 FTIR спектрометр сканирования 4000–400 см⁻¹ с образцами в виде KBr таблеток (Bruker, Германия). Раман-спектры — Senterra R200-L Раман микроскоп с длиной волны возбуждения 532 нм (Bruker Optics, Германия). XRD паттерны — Bruker D8 Advance дифрактометр (Bruker, Германия). Поверхностные элементы — XPS Kratos AXIS Ultra DLD с монохроматическим Al Ka излучением (1486,6 эВ) (Shimadzu, Япония). Термогравиметрический анализ (TGA) — PerkinElmer Pyris 1 TGA при нагреве 5 °C/мин от 30 до 800 °C в азотной атмосфере (PerkinElmer, США). Поверхностный заряд композитов — Malvern Zeta Nano ZS-90 прибор (Malvern, Великобритания).

Загрузка и выпуск препарата

4 мг ChrGO наночастиц взвесили в 20 мл водного раствора адриамаицина (0,4 мг/мл). После соникации 0,5 ч помешивали в темноте 24 ч, избегая света. Незагруженный адриамаицин удалили центрифугной фильтрацией через 50 кДа MWCO Amicon фильтры (Millipore, США) и промывали фосфатно-буферным раствором (PBS, pH 8,0) до бесцветного супернатата. Концентрация адриамаицина определена стандартной кривой концентрации адриамаицина UV-Vis спектрометрией при 490 нм на SpectraMax® M5 микропластинке (Molecular Devices, США). Количество адриамаицина, загруженного на ChrGO, определено UV-Vis абсорбцией измерением потери концентрации адриамаицина в супернатате Amicon® Ultra-15 мл центрифужного фильтра.

Характеристики выпуска адриамаицина из ChrGO изучали. Загруженный адриамаицин ChrGO погружали в 10 мл PBS буферного раствора. В заданных интервалах 2 мл выпущенного адриамаицина, отделившегося от ChrGO, собирали центрифугной фильтрацией через 50 кДа MWCO Amicon фильтры. Объем ChrGO/адриамаицина раствора поддерживали постоянным добавлением 2 мл свежего PBS после каждого отбора. Количество выпущенного адриамаицина измеряли UV-Vis абсорбцией при 490 нм на SpectraMax® M5. Выпуск изучали в разных pH растворах (pH 5 и 7,4).

Анализ биосовместимости и терапевтической эффективности

Клетки BT-474 и Cos-7 содержали в RPMI-1640 с 10% FBS или DMEM с 10% FBS соответственно, в увлажненной атмосфере 5% CO₂ при 37 °C. Биосовместимость GO и ChrGO исследули цитотоксичностным анализом на BT-474 или Cos-7. Клетки посеяли в 96-колодчатые пластинки плотностью 3×10⁴ клеток/колодку, предварительно инкубировали 18 ч перед обработкой GO и ChrGO. Затем разбавления испытуемых агентов добавляли к клеткам и инкубировали еще 24 ч. Жизнеспособность клеток определили CellTiter 96® водным раствором. Абсорбция измерялась при 490 нм на SpectraMax® M5.

Эффективность ChrGO/адриамаицин комплексов в одиночестве или в комбинации с трастузумабом на пролиферации в клетках BT-474 изучали анализом ингибирования пролиферации [16]. Клетки BT-474 посеяли в 96-колодчатые пластинки 1×10⁴ клеток/колодку, инкубировали 24 ч. Затем ChrGO/адриамаицин комплексы в одиночестве или в комбинации с трастузумабом вводили в клетки BT-474 в кулитурной среде. После 96-ч инкубации жизнеспособные клетки определяли CellTiter 96®. Абсорбция измерялась SpectraMax® M5 при 490 нм. Данные анализировали односторонним ANOVA. p < 0,05 считалось статистически значимым.

Анализ клеточного цикла и апоптоза

Для анализа клеточного цикла клетки BT-474 посеяли в 6-колодчатые пластинки 5×10⁵ клеток/колодку, прикрепляли 16 ч. Клетки обрабатывали ChrGO/адриамаицин комплексами в одиночестве или в комбинации с трастузумабом 24 ч. Клетки собирали, фиксировали 70% (об/об) этанолом при 4 °C 24 ч. Фиксированные клетки окрашивали пропидиевым йодидом (15 мкг/мл) с рибонуклеазой А (10 мкг/мл) при 25 °C 1 ч. Затем анализировали потоковым цитометром (BD Biosciences, США). Для анализа апоптоза клетки BT-474 посеяли в белые 96-колодчатые пластинки 2×10⁴ клеток/колодку, прикрепляли 18 ч. Клетки обрабатывали ChrGO/адриамаицин комплексами, трастузумабом в одиночестве или в комбинации 24 ч. Культурную среду удаляли, добавляли 100 мкл Caspase-Glo® 3/7 реактива в каждую колодку, инкубировали при комнатной температуре 2 ч. Люминесценцию измеряли SpectraMax® M5. Результаты анализировали односторонним ANOVA. p < 0,05 статистически значимо. Все исследования проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и регуляциями.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика

Морфология синтезированных GO листов характеристикована TEM. Рис. 1a показывает равномерное распределение размеров GO нанолистов ниже 100 нм, средний размер ~45 нм. Высокая электронная плотность GO дает лучший контраст по сравнению с хитосаном, едва видимым из-за низкой электронной плотности и гидратированной природы [21]. Благодаря большой площади наноразмерные GO или восстановленные GO листы широко используются как носители препаратов [22]. SAED паттерн на рис. 1c показывает концентрические кольца, демонстрирующие поликристаллическую природу оксида графена [23].

Для стабилизации GO нанолистов в физиологическом растворе приготовили хитосан-функционализированные GO нанолисты микроволновым восстановлением в микроволновой системе [24]. Полученный восстановленный GO-хитосан (ChrGO) анализировали UV-Vis спектрометрией. Рис. 2a — UV-Vis спектры GO и ChrGO. GO имеет резкий пик абсорбции при 230 нм и плечо при 300 нм, приписываемые π–π* переходу ароматических C=C связей и n–π* переходу C=O связей [25,26]. После прививки хитосана к GO пик 230 нм красным сдвигом перешел к 270 нм для ChrGO, плечо 300 нм явно исчезло, что приписывается частичному восстановлению электронной конъюгации среди ароматических атомов углерода [27]. Черный раствор синтезированного ChrGO на рис. 2b указывает на формирование частично восстановленного оксида графена (p-rGO). И GO нанолисты, и ChrGO хорошо диспергированы в деионизированной воде. Коллоидная стабильность GO или производных GO в водном растворе очень важна для биомедицинских применений. Результаты показывают, что хитосан был конъюгирован с GO после восстановления.

FTIR спектроскопия для характеристики структуры GO, хитосана и ChrGO (рис. 3a). Характерные пики GO при 3440 и 1376 см⁻¹ — O–H и C–OH связи. Пик 1072 см⁻¹ — растягивающая вибрация C–N–C. Заметно, пики хитосана при 2912 и 2848 см⁻¹ — растягивающие вибрации CH₃– и –CH₂– [28,29]. Функционализированное p-rGO хитосаном дало новые связи, новые пики в спектре ChrGO. Значительное снижение интенсивности полосы C=O при 1636 см⁻¹ в ChrGO по сравнению с GO указывает на удаление кислородсодержащих групп GO процессом восстановления [30]. FTIR ChrGO подтвердил успешную конъюгацию хитосана на GO. Раман-спектроскопия для электронных свойств и структуры графена. G-полоса — E_2g фононы sp² углеродных доменов, D-полоса — вибрация sp³ углеродных доменов и дефицитных углеродных атомов. Интенсивность D-полосы указывает на дефекты и беспорядок в углеродных листах [31]. Восстановление GO нанолистов анализировалось соотношением интенсивностей D/G [32]. Репрезентативный Раман-спектр GO показывает D-полосу (1341 см⁻¹) и G-полосу (1591 см⁻¹) на рис. 3b. Изменение относительной интенсивности I_D/I_G иллюстрирует изменение состояния электронной конъюгации GO в процессе восстановления [33]. Сдвиг D-полосы показывает успешную функционализацию восстановленного GO. Значение I_D/I_G увеличивается с 0,99 (GO) до 1,12 (ChrGO), что приписывается внедрению sp³ дефектов после функционализации и неполному восстановлению характерной структуры графена [34]. Наблюдение согласуется с предыдущими отчетами и указывает на формирование хитосан-функционализированного графена [16].

Поверхностный состав ChrGO подтвержден XPS. Полный скан XPS спектра ChrGO показывает три пика при 284, 399, 533 эВ — C1s, N1s, O1s (рис. 4a). Относительный элементный анализ показал рост кислорода и азота в ChrGO с ассоциированным снижением углерода по сравнению с GO. Высокое разрешение C1s спектров ChrGO (рис. 4b) показывает четыре разделенных пика: C–C или C=C (sp², 284,7 эВ), C-O (эпоксид/гидроксили, 286,4 эВ), C=O (sp³, 288,2 эВ), O=C–O (карбоксилаты, 289,1 эВ). Появление амидного пика в ChrGO подтверждает функционализацию хитосана на GO [35]. Обилие гидрофильных функциональных групп на поверхности делает ChrGO высоко растворимым в водном растворе, согласуется с FTIR. Биомолекулы: редуктивные аминокислоты и альфа-линоленовая кислота в дрожжевом экстракте могут играть значительную роль в микроволновой фabrikации ChrGO [20].

XRD паттерны GO и ChrGO на рис. 5a. В XRD GO основной пик 11,0° и слабый 20,7° четко показывают графитовую структуру. Характерный дифракционный пик 11,0° соответствует плоскости (001) GO, подтверждающий успешный синтез GO [36]. Небольшой бугорок между 20° и 24° — графитовые фрагменты, приписываемые неоксидированному pristine графиту [37]. При функционализации хитосаном пик (001) GO исчезает, тогда как широкая дифракционная вершина 21,4° становится заметной. Сдвиг приписывается восстановлению GO, где восстановление делает rGO более плотно упакованным, чем GO. (002) рефлексия ChrGO очень широкая, указывая на плохой порядок вдоль направления накопления, что может быть связано с неполным восстановлением GO [33]. Декомпозиционное поведение GO, хитосана и ChrGO изучено термогравиметрическим анализом (TGA) [38]. TGA кривые ChrGO, GO, хитосана на рис. 5b в азотной атмосфере. GO начинал терять вес ниже 100 °С — удаление адсорбированной свободной воды в накопленной структуре [39]. GO терял 42% веса в диапазоне 191–231 °С — декомпозиция лабильных кислородсодержащих групп. Скорость потери веса ChrGO при 100–250 °С значительно ниже GO, ChrGO показывает другой паттерн декомпозиции. Термическое устранение ChrGO и чистого хитосана происходило 250–440 °С — деполимеризация и пиролиз более стабильных функциональных групп: гликозидных единиц хитосана и карбоксиловых групп [40]. По сравнению с GO, ChrGO термически стабилен и дает основную потерю веса 36% в первой стадии декомпозиции 250–440 °С, тогда как GO показывает мало потерю веса. Значительная потеря веса в высокотемпературной области 450–800 °С — термическая деградация углеродного скелета, приписываемая остаткам хитосана и биомолекулам из дрожжевого экстракта: аминокислоты [41].

Поверхностный заряд GO и ChrGO измерен Malvern Zeta Nano ZS-90 — важный параметр коллоидной стабильности. Более высокая плотность поверхностного заряда на GO нанолистах создает более стабильную коллоидную дисперсию [42]. На доп. файле 1: рис. S1 дзета-потенциал GO монотонно снижался от −10,7 мВ при pH 3 до −35,5 мВ при pH 11, подтверждая отрицательный заряд поверхности GO нанолистов. Зета-потенциал ChrGO был сравнительно меньше потенциала GO при любом pH 3–11. ChrGO нанолисты демонстрировали стабильность во всем диапазоне pH, тогда как восстановленные GO коллоиды сообщались менее стабильными в деионизированной воде из-за увеличенного π–π накопления в деоксидинированных поверхностях [43]. Хотя некоторые свободные аминные группы присутствовали на поверхности хитосана [44], более высокий дзета-потенциал ChrGO не достигнут. Нижнее значение дзета-потенциала ChrGO может быть приписано обильным отрицательно заряженным аминокислотным молекулам из дрожжевого экстракта, повышающим коллоидную стабильность в физиологическом растворе [20]. Отрицательно заряженная поверхность ChrGO делает их потенциально применимыми для загрузки и доставки препарата.

Биосовместимость синтезированного ChrGO

Биосовместимость синтезированного ChrGO важна для применения в доставке препаратов. Цитотоксичность ChrGO и GO изучена цитотоксичностным анализом. Клетки Cos-7 и BT-474 инкубировали в присутствии ChrGO или GO 24 ч. Результаты на рис. 6. ChrGO не проявлял очевидной цитотоксичности к Cos-7 и BT-474. Даже при 100 мкг/мл жизнеспособность клеток была выше 90%. GO проявлял значительную цитотоксичность в дозозависимом режиме: выживание 73,0±0,5% и 71,0±0,5% для Cos-7 и BT-474 при 100 мкг/мл. Результаты демонстрируют, что хитосан на поверхности GO сильно снижает цитотоксичность и улучшает биосовместимость. Поверхностная функционализация GO макромолекулами сообщала о значительном ослаблении цитотоксических эффектов [45]. Ху и соавт. сообщили, что фетальная корова сыворотка в среде клеток заметно снижала цитотоксичность GO в немалоклеточном раке легких A549 [46].

Загрузка и выпуск препарата

Потенциальное биомедицинское применение ChrGO как носителя препарата измеряется поведением загрузки и выпуска. Структурные характеристики графеновых производных высокоэффективны для ароматических препаратов благодаря очень большой удельной поверхности. Адриамаицин — один из основных химиотерапевтиков против гематологических злокачествств и солидных опухолей, часто используется как модель препарат для оценки систем доставки на основе графеновых производных [47]. Загрузочная способность адриамаицина на ChrGO нанолистах верифицирована характерным UV-Vis абсорбционным пиком адриамаицина при 490 нм. Максимальная эффективность загрузки адриамаицина на ChrGO нанолистах достигала 169,8%, частично благодаря большой площади ChrGO нанолистов. Загруженные адриамаицин ChrGO/адриамаицин нанокомпозиты легко диспергировались в физиологическом буфере, давая прозрачный раствор с легкой красноватой окраской.

Для изучения профиля выпуска адриамаицина из ChrGO/адриамаицин комплексов вводили разные pH PBS для имитации среды опухолевых клеток. Доп. файл 1: рис. S2 показывает кумулятивные профили выпуска адриамаицина из ChrGO/адриамаицин при pH 5 и 7,4. Выпуск адриамаицина из ChrGO/адриамаицин характеризовался начальной быстрой фазой, затем более медленной при pH 5,0 PBS. Кумулятивный выпуск 6,5% за первые 3 ч, затем медленный рост до 26,7% за 96 ч при pH 5,0. В отличие, при pH 7,4 выпуск был медленнее и ниже: от 2,5% за первые 3 ч до 7,4% за 96 ч. Предыдущие работы показывали очень медленный выпуск препаратов от функционализированного GO при pH 7,4 [48]. Протонирование карбоксильных групп на ChrGO снижает π–π накопление, H-связи и электростатические взаимодействия между адриамаицином и ChrGO, облегчая выпуск адриамаицина в кислой среде [49]. pH-чувствительность дает ChrGO/адриамаицин потенциал для адресной доставки препарата, что увеличивает цитотоксичность в опухолевых клетках.

Терапевтическая эффективность ChrGO/Адриамаицин комплексов

Терапевтическая эффективность ChrGO/адриамаицин комплексов в HER2-гиперекспрессирующих клетках рака груди BT-474 изучена анализом ингибирования пролиферации. Гиперекспрессия HER2 рецептора играет ключевую роль в трансформации клеток BT-474. Лечение трастузумабом в одиночестве, анти-HER2 мононаclonal антител, дает значительное ингибирование роста BT-474 [50]. На рис. 7a после лечения ChrGO/адриамаицин комплексами жизнеспособность BT-474 значительно снижалась, демонстрируя дозозависимый токсический эффект. По сравнению с свободным адриамаицином, ChrGO/адриамаицин комплексы показали менее эффективную работу в убийстве BT-474, что приписывается постепенной диффузии загруженного адриамаицина вместо прямого лечения свободным адриамаицином [51]. Однако терапевтическая эффективность комплексов приближалась к свободному адриамаицину при увеличении концентрации, что объясняется устойчивым выпуском адриамаицина из носителя ChrGO.

Для изучения, может ли трастузумаб улучшить антиопухолевую активность эквивалентных количеств адриамаицина на ChrGO, клетки BT-474 обрабатывали трастузумабом в одиночестве или в комбинации с ChrGO/адриамаицином. Лечение трастузумабом в одиночестве дало значительное ингибирование пролиферации BT-474, согласуясь с предыдущим отчетом [52]. Комбинированная терапия трастузумабом и ChrGO/адриамаицином привела к усиленному ингибированию роста клеток, снижение 88,5% по сравнению с 54,5% трастузумабом (5 мкг/мл) и 59,5% эквивалентным ChrGO/адриамаицином (5 мкг/мл) против негативного контроля (рис. 7b). Результаты указывают, что ChrGO система может эффективно использоваться для разработы композитов для комбинированных терапий, и комбинированное лечение дало умеренное, но значимое снижение жизнеспособности по сравнению с каждым препаратом в одиночестве.

Анализ клеточного цикла и апоптоза

Для определения влияния ChrGO/адриамаицин комплексов на прогрессию клеточного цикла выполнили анализ клеточного цикла комплексов в одиночестве или в комбинации с трастузумабом на клетках BT-474. На рис. 8a потоковая цитометрия показала, что трастузумаб в одиночестве увеличил популяцию клеток в фазе G0/G1. Лечение ChrGO/адриамаицином в одиночестве посредствовало значительное снижение числа клеток G0/G1 и накопление в S-фазе и G2/M-фазе по сравнению с контролем. Кроме того, ChrGO/адриамаицин с трастузумабом посредствовал арест S-фазы, сопровождаемый значительным снижением клеток в G0/G1. В то время как ChrGO/адриамаицин наиболее активен в S-фазе, добавление трастузумаба вызывает рост G0/G1 по сравнению с ChrGO/адриамаицином в одиночестве. Предыдущие отчеты показывали, что трастузумаб вызывает арест в G1-фазе [53]. Адриамаицин ингибирует пролиферацию и ДНК-репликацию, в конечном счете приводя к аресту клеточного цикла [54].

Для оценки влияния ChrGO/адриамаицина на апоптотические молекулы клетки BT-474 обрабатывали 48 ч ChrGO/адриамаицином, трастузумабом или их комбинацией. Для визуализации апоптоза активность каспазы 3/7 широко использовалась как апоптотический маркер из-за активности в процессе апоптоза [55]. На рис. 8b по сравнению с негативным контролем лечение ChrGO/адриамаицином (5 мкг/мл) в одиночестве значительно увеличило активность каспазы 3/7. Однако трастузумаб (5 мкг/мл) в одиночестве не значимо увеличил экспрессию каспазы 3/7, что указывает, что трастузумаб не индуцирует апоптоз. В отличие, лечение ChrGO/адриамаицином (5 мкг/мл) плюс трастузумаб (5 мкг/мл) значительно увеличило активность каспазы 3/7 по сравнению с каждым препаратом в одиночестве. Двойная адресная терапия показала более высокий апоптоз, указывая на превосходную терапевтическую эффективность благодаря разным механизмам действия. Аналогично другим исследованиям, адриамаицин усиливает апоптотический ответ в HER2-гиперекспрессирующих раковых клетках [56]. В заключение, ChrGO/адриамаицин в комбинации с трастузумабом индуцирует остановку клеточного цикла и апоптоз, в конечном счете приводя к усиленной гибели клеток.

Заключение

В работе хитосан-функционализированные оксид графена нанолисты структурированы микроволновым восстановлением, демонстрируя биосовместимость и хорошую дисперсионную стабильность. Приготовленные нанокомпозиты показали высокую эффективность инкапсуляции и доставки препарата. ChrGO/адриамаицин нанолисты демонстрировали значительное ингибирование роста BT-474 в дозозависимом режиме. Комбинированное лечение ChrGO/адриамаицином и трастузумабом дало превосходную терапевтическую эффективность в клетках BT-474 по сравнению с каждым агентом в одиночестве. Результаты благоприятны для развития внутриклеточных наноносителей для доставки препаратов в контролируемом режиме, что ожидается улучшить терапевтический эффект на терапии HER2-гиперекспрессирующих раков.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, поддерживающие выводы текущего исследования, доступны у соответствующих авторов по обоснованному запросу.

Аббревиатуры

ChrGO:

Хитосан-функционализированный оксид графена (Chitosan-functionalized graphene oxide)

EGFR:

Эпидермальный фактор роста рецептор (Epidermal growth factor receptor)

HER2:

Человеческий эпидермальный фактор роста рецептор-2 (Human epidermal growth factor receptor-2)

GO:

Оксид графена (Graphene oxide)

DMEM:

Модифицированная среда Эйгла Дюльбекко (Dulbecco's modified Eagle medium)

FBS:

Фетальная корова сыворотка (Fetal bovine serum)

TEM:

Трансляционная электронная микроскопия (Transmission electron microscopy)

UV-Vis:

Ультрафиолетово-видимый (Ultraviolet–visible)

FTIR:

Фурье-спектроскопия ИК (Fourier transform infrared)

XRD:

Рентгеновская дифракция (X-ray diffraction)

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (X-ray photoelectron spectroscopy)

TGA:

Термогравиметрический анализ (Thermogravimetric analysis)

PBS:

Фосфатно-буферный раствор (Phosphate-buffered saline)

SAED:

Выбранная область электронной дифракции (Selected-area electron diffraction)

TGA:

Гравиметрический анализ (Gravimetric analysis)