Таурин-функционализированный оксид графена для доставки 5-фторурацила: изготовление, характеристика и антираковая эффективность

Аннотация

Недавно наносистемы-носители для противопухолевых препаратов, особенно системы доставки на основе оксида графена (GO), стали благословением для онкобольных. В данном исследовании мы выбрали таурин (Tau) для функционализации поверхности GO с целью улучшения его биосовместимости. Во-первых, наноразмерный GO синтезировали модифицированным методом Хаммера и ультразвуковым эксфолированием. Таурин-модифицированный носитель оксида графена (Tau-GO) синтезирован химическим методом для получения Tau-GO с хорошей диспергируемостью и стабильностью в воде, с дзета-потенциалом −38,8 мВ и размером частиц 242 нм. На основе критериев оценки эффективности инкапсуляции оптимальная формулировка была определена для комбинирования Tau-GO и 5-ФУ нековалентной связью. 5-ФУ-Tau-GO был более стабилен в нейтральной среде, чем в кислой, и имел определенный pH-отклик и эффект устойчивого высвобождения. В виво мы сравнивали пероральное и внутривенное введение 5-ФУ и 5-ФУ-Tau-GO соответственно, используя фармакокинетические тесты и связанные параметры, и показали, что пероральное или внутривенное введение 5-ФУ-Tau-GO удлиняет время действия 5-ФУ в организме и улучшает его биодоступность. Кроме того, ингибирование клеток HepG2, измеренное MTT-тестом, показало, что значение IC₅₀ 5-ФУ составляло 196 ± 8,73 мкг/мл, а значение IC₅₀ 5-ФУ-Tau-GO — 65,2 ± 0,7 мкг/мл, что указывает на то, что 5-ФУ-Tau-GO более потентен против клеток HepG2 и имеет более сильный ингибирующий эффект на раковые клетки. Эффект на морфологию клеток, измеренный с помощью AO/EB окраски, также показал, что 5-ФУ-Tau-GO не только разрушает клетки, но и значительно индуцирует апоптоз по сравнению с 5-ФУ. Мы также проверили компьютерным моделированием, что Tau-GO может лучше связываться с 5-ФУ, чем немодифицированный GO, и что сформированная система 5-ФУ-Tau-GO более стабильна и способствует переносу и высвобождению 5-ФУ в виво.

Введение

Химиотерапия по-прежнему является распространенным методом, используемым в лечении различных раков. Значительным препятствием для большинства химиотерапевтических агентов является их неспособность проникать в опухолевые ткани в эффективных концентрациях или их нежелательные побочные эффекты на нормальные ткани. Поэтому ученые сосредоточили усилия на разработке мощной системы доставки препаратов, которая может достичь контролируемой скорости высвобождения препарата в опухолевых тканях для обеспечения эффективной доставки и терапии.

Многие наноматериалы, включая липосомы, полимеры, наночастицы, дендримеры, мицеллы и оксид графена, были разработаны для доставки различных препаратов. Среди этих наноматериалов оксид графена (GO) — новый углеродный наноматериал, химически эксфолированный из окисленного графита, который демонстрирует несколько увлекательных физических и химических свойств, таких как обильные функциональные группы, большая удельная площадь, высокая загрузка препарата и отличная диспергируемость в воде. Более того, большинство ин витро экспериментальных результатов показали, что низкая концентрация GO может использоваться как субстрат для роста клеток и активации иммунных клеток. Поэтому GO широко использовался в диагностике заболеваний, визуализации и отслеживании раковых клеток, фототермической терапии рака, тканевой инженерии, таргетированной доставке препаратов и, особенно, как носитель противоопухолевых препаратов. Однако несколько исследовательских групп сообщили, что высокая концентрация GO имеет очевидные цитотоксические эффекты в доклинических и клинических исследованиях. Механизм, которым GO производит токсические эффекты в виво, заключается в окислительном стрессе и сверхпродукции внутриклеточных реактивных форм кислорода, индуцируя апоптоз клеток и вызывая сильное воспаление, легочный отек и гранулематоз. Поэтому критически важно решить проблему токсичности GO.

Сообщается, что функционализация ковалентными или нековалентными связями может уменьшить сильное гидрофобное взаимодействие между GO и клетками. Это было продемонстрировано несколькими исследованиями, показывающими, что функционализация GO улучшает его биосовместимость и практически устраняет его токсичность в виво и ин витро. Yang et al. впервые изучили долгосрочную биодистрибуцию ковалентно конъюгированного PEG-GO в мышах с использованием радиомаркировочного метода, и результаты показали, что PEG-GO может постепенно выводиться из мышей, вероятно, с мочой и калом. Zhang et al. сравнили DEX-функционализированный GO с GO и обнаружили, что GO-DEX может заметно снизить клетковую токсичность и в основном выводиться из мышей в течение недели. Кроме того, нековалентное связывание GO с плуроником F127 приводит к безвредной растворимости и стабильности в физиологических условиях и низкой токсичности. Хотя несколько полимеров или молекул использовались для функционализации GO, в этой области достигнуты значительные результаты. Однако все еще необходимы усилия для разработки простых методов построения хорошей биосовместимой GO-носительной системы для препаратов.

Таурин (Tau) — полунезаменимая аминокислота с хорошей стабильностью и водорастворимостью. Таурин может предсердечно-сосудистым и цереброваскулярным заболеваниям, поддерживать зрительную функцию, защищать клетки и регулировать иммунитет. Многочисленные исследования предполагают, что таурин обладает антипухолевыми свойствами через регуляцию экспрессии факторов, играющих важную роль в различных раках, включая легкие, желудок, колоректальный и грудной рак. Таким образом, таурин-функционализированный GO может оказывать высокую роль как носитель противоопухолевых препаратов. В данной статье мы впервые использовали ковалентно таурин-функционализированный GO в качестве наноносителя и оценили его цитотоксичность ин витро. Кроме того, 5-фторурацил (5-ФУ) использовался как противоопухолевой препарат, который нековалентно загружался на поверхность Tau-GO для построения системы доставки препарата. 5-ФУ-Tau-GO мог не только снизить побочные эффекты на нормальные ткани, но и улучшить биодоступность препарата. Следовательно, Tau-GO был успешно разработан как новый наноматериал на основе GO, который может иметь значимые биомедицинские применения в будущем.

Эксперименты и методы

Материалы

Графитовый порошок, фосфатно-буферный раствор (PBS) и диметилсульфоксид (DMSO) закупались у Tianjin Laibo Chemical Co., Ltd.; карбодиимид (EDC), N-гидроксисукцинимид (NHS), соляная кислота (HCl) и перекись водорода (H₂O₂ 30%) — у Shandong Yuwang Industrial Co., Ltd.; таурин (Tau), 5-фторурацил (5-ФУ), человеческие гепатомные клетки (HepG2), пенициллин-стрептомицин раствор и фетальная телячья сыворотка (FBS) — у Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd.; серная кислота (H₂SO₄ 98%) и перманганат калия (KMnO₄) — у Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.; нитрат натрия (NaNO₃) и додилсульфат натрия (SDS-Na) — у Shanghai Jinjinle Industrial Co., Ltd.; MTT — у Sigma-Aldrich, Inc; DMEM — у HyClone, Inc; крысы — у Benxi Changsheng Experimental Animal Center. Все остальные реагенты и химикаты были аналитически чистыми и коммерчески доступными.

Синтез GO

GO готовили из графитового порошка по модифицированному методу Хаммера. Во-первых, 168 мл 98% серной кислоты добавляли вдоль стенки трехгорлычного колбы, помещенной в ледяную баню с термометром, и при температуре 5 °C добавляли 5 г графита и 4 г нитрата натрия. Затем 22,5 г перманганата калия медленно добавляли порциями в течение 1 ч, поддерживая температуру ниже 5 °C. После этого трехгорлочную колбу переносили в масляную баню и полученную смесь реагировали при 35 °C в течение 30 мин, затем температуру повышали до 65 °C и мешали 30 мин. Далее температуру повышали до 85 °C и смесь еще реагировали 1 ч для получения пурпурно-коричневой пасты. Смесь оставляли при комнатной температуре на 1 неделю, переносили в стакан с 700 мл горячей воды, и 30% перекись водорода капали капельно до желтовато-коричневого цвета. Смесь центрифугировали при 10000 об/мин, промывали горячей водой, и этот процесс повторяли несколько раз до pH надстоя 7,0. Наконец, продукт сушили в вакуумной сублимационной сушилке и получали нано GO.

Синтез Tau-GO

Точно взвешенные 50 мг GO растворяли в 50 мл дистиллированной воды, и добавляли 150 мг EDC и 100 мг NHS для активации GO ультразвуком в ледяной ванне 20 мин. Затем 10 мл водного раствора Tau (0,1 г/мл) медленно добавляли капельно в приготовленный водный раствор GO, и pH регулировали до 6–7 HCl и непрерывно мешали 24 ч при комнатной температуре в темноте. Продукт собирали центрифугированием при 5000 об/мин 10 мин и промывали 3 раза дистиллированной водой. Tau-GO собирали после сублимационной сушки.

Загрузка 5-ФУ

20 мл раствора Tau-GO ультразвуковыми обрабатывали 2 ч. Точно взвешенное количество 5-ФУ растворяли в соответствующем количестве дистиллированной воды и медленно добавляли капельно в приготовленный раствор Tau-GO под мешанием при комнатной температуре, затем ультразвуковыми обрабатывали при 30 °C в темноте 1,5 ч. Продукты центрифугировали при 5000 об/мин 10 мин при 4 °C. Нижний осадок промывали 20 мл дистиллированной водой и центрифугировали (5000 об/мин 10 мин при 4 °C), процесс повторяли 3 раза. Нижний слой сублимационно сушили, надстой помещали в стакан, измеряли объем, концентрацию 5-ФУ определяли HPLC 1200 (Agilent, USA). Условия детекции: хроматографическая колонка C18 (4,6×250 нм, 5 мкм); температура колонки 25 °C; мобильная фаза: 0,1% раствор KH₂PO₄ с pH 5,5; расход 1,0 мл/мин; объем инъекции 20 мкл; длина волны измерения 265 нм. Коэффициент инкапсуляции (EE) и эффективность загрузки препарата (LE) получали формулами:

EE (%) = (M₁ − C₁ × L₁) / M₁ × 100%

LE (%) = (M₁ − C₁ × L₁) / (20C₀ + M₁ − C₁ × L₁) × 100%

Общая доза 5-ФУ записывалась как M₁, концентрация и объем свободного 5-ФУ — как C₁ и L₁, концентрация носителя — как C₀.

Характеристика

Для характеристики приготовленного нанокомпозита Фурье-ИК спектры сканировались от 4000 до 400 см⁻¹ на спектрометре IRAffinity-1 (Shimadzu, Япония) для подтверждения взаимодействий. УФ-видимые абсорбционные спектры записывали на UV-3600 Scanning Spectrophotometer (Shimadzu, Япония). Образцы растворяли в дистиллированной воде, размер частиц, дзета-потенциалы и PDI значения получали на Nano-ZS 90 Nano инструменте (Malvern, UK). Морфологии образцов анализировали передаточной электронной микроскопией JEM-2100 (JEOL, Япония). Термогравиметрические анализы (TGA) проводили на термогравиметрическом анализаторе (NETZSCH, Германия) со скоростью нагрева 10 °C/мин от 0 до 800 °C в азотной атмосфере. XRD измерения образцов выполняли рентгеновским дифрактометром (Bruker, Германия) с медным CuKα излучением (λ = 1,5406 Å) в широкоугольном режиме с углом 2θ. XPS измерения выполняли на Omicron ESCA Probe с монохроматизированным Al Kα излучением (Thermo, Америка).

Ин витро высвобождение препарата

Ин витро высвобождение препарата проводили при pH 1,2 (симуляция желудочной среды), pH 6,5 (симуляция среды клеток рака печени) и pH 7,4 (симуляция физиологической среды) при 37 °C (симуляция температуры тела) соответственно. Кратко: 15 мг 5-ФУ-Tau-GO помещали в диализационную мембрану, погружали в 50 мл буферных растворов, содержащих 0,1% SDS-Na с pH 1,2, 6,5 и 7,4. Все образцы помещали в постоянно трясущуюся водяную баню со скоростью 100 об/мин и температурой 37 °C. В заданные временные точки (0 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин, 1 ч, 1,5 ч, 2 ч, 2,5 ч, 3 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч, 48 ч и 72 ч) 1 мл каждого образца забирали и заменяли 1 мл свежим буферным раствором с 0,1% SDS-Na для поддержания того же объема среды высвобождения. Среда высвобождения центрифугировали и анализировали HPLC 1200.

Ин витро цитотоксические исследования

MTT тест

MTT тест использовался для оценки цитотоксичности 5-ФУ, Tau-GO и 5-ФУ-Tau-GO. Кратко, человеческие гепатомные клетки HepG2 культивировали в среде DMEM, дополненной 10% FBS и 1% антибиотиками (пенициллин-стрептомицин раствор) при 37 °C в увлажненной атмосфере 5% CO₂. Клетки посевали в 96-колончатую пластинку с плотностью 5×10³ клеток на колодец, содержащий 100 мкл среды DMEM с FBS и антибиотиками. Пластинку инкубировали 24 ч в увлажненной камере 37 °C с 5% CO₂. После этого среду роста удаляли и доливали 100 мкл свежей среды, содержащей различные концентрации (5, 10, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг/мл) 5-ФУ, Tau-GO, 5-ФУ-Tau-GO соответственно. После 24-часовой инкубации клетки обрабатывали 20 мкл раствора MTT и инкубировали еще 4 ч. Затем среду аспирировали, и формазановые кристаллы растворяли в 150 мкл DMSO. Наконец, пластинки трясли при 37 °C 15 мин в термостатированном осцилляторе. Оптическая плотность (OD) каждого образца измеряли при 570 нм на микропластинчатом считывателе. Эксперименты выполняли в триplicates. Скорость ингибирования клеток рассчитывалась по формуле:

Cell inhibition rate = (OD_control − OD_treated) / OD_control × 100%

где OD_control — абсорбция необработанных контрольных клеток, OD_treated — абсорбция обработанных клеток.

AO/EB окраска

Двойная окраска AO/EB использовалась для оценки морфологических изменений клеток, обработанных 5-ФУ, Tau-GO и 5-ФУ-Tau-GO. Кратко, клетки HepG2 в логарифмической фазе роста посевали в 6-колончатую пластинку с плотностью 10000 клеток на колодец и культивировали в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂. Через 24 ч клетки обрабатывали фиксированной концентрацией 5-ФУ, Tau-GO или 5-ФУ-Tau-GO и инкубировали еще 24 ч. Среду в каждом колодце удаляли и клетки промывали дважды PBS. Затем 1 мл PBS с добавлением 40 мкл флуоресцентных красителей (1 мг/мл AO и 1 мг/мл EB смешаны в соотношении 1:1) добавляли в каждый колодец и инкубировали 10 мин без света. Окрашенные клетки наблюдали под флуоресцентным микроскопом и случайно фотографировали.

Фармакокинетическое исследование

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с политиками и принципами Комитета по защите животных и этике. Всего 24 самца крыс линии SD, массой тела 230–270 г, голодовали 12 ч и случайно делили на 4 группы перед введением препарата. Группы A и B внутривенно вводили растворы 5-ФУ и 5-ФУ-Tau-GO, а группы C и D — перорально 5-ФУ и 5-ФУ-Tau-GO соответственно. Все группы получали дозу 20 мг/кг. После введения препарата пробу крови (~0,5 мл) забирали в антикоагулянтные пробирки в заданные временные точки (15 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 12 ч, 16 ч, 24 ч и 48 ч). Плазменные образцы отделяли центрифугированием при 7500 об/мин и 4 °C 10 мин. Затем 200 мкл плазмы и 50 мг (NH₄)₂SO₄ комбинировали в пробирке (10 мкл 40 мкг/мл 5-BrU внутреннего стандарта, сушили азотом в водяной бане 40 °C, вихревали 5 мин и центрифугировали 10800 об/мин 3 мин. Затем пробирке добавляли 900 мкл этилацетат/изопропанол раствора (85:15, v/v), вихревали 3 мин и центрифугировали 10800 об/мин 15 мин. Надстой удаляли и сушили азотом, добавляли 100 мкл подвижной фазы и вихревали 1 мин. Наконец, полученный раствор из надстоя измеряли HPLC 1200.

Молекулярно-динамическое моделирование

Молекулярно-динамическое моделирование основно использовалось для анализа взаимодействия между препаратом и носителем и диффузионного поведения препарата. Химическая структура 5-ФУ строилась с помощью Chemdraw ChemOffice 2014, а структуры Tau-GO и GO проводились в модуле Polymer and Molecule Builders с использованием программного обеспечения молекулярного моделирования Materials Studio (версия 7.0, Accelrys Inc., США). Все построенные соединения геометрически оптимизировали под силовым полем COMPASS II, и конформация с наименьшей энергией выбиралась как стабильная. 10 пс NVT равновесирование проводилось для каждой системы. Моделирование выполнялось 100 пс MD для получения сбалансированной структуры при 298 К и 101,325 кПа с шагом 1 фс. Наконец, среднеквадратичное смещение (MSD) и плотность когезивной энергии (CED) получали для каждой системы, и коэффициент диффузии (D) давался формулой:

D = 1/(2d) lim_τ→∞ d/dτ [|r⃗(t) − r⃗(0)|²]

где d — размерность системы, r⃗(t) и r⃗(0) — радиус-вектор молекулы препарата в момент t и 0 соответственно, |r⃗(t) − r⃗(0)|² означает MSD.

Результаты и обсуждение

Характеристика

Конъюгат Tau-GO изготавливался амидной связью GO и Tau. Успешный синтез нанокомпозита подтверждался ФТИР спектрами (рис. 1). Наличие кислородсодержащих функциональностей на GO подтверждалось пиками абсорбции при −OH (~3405 см⁻¹), C=O (1723 см⁻¹), C=C (1628 см⁻¹) и C–OH (1391 см⁻¹). Эти результаты доказали успешную подготовку GO (рис. 1a). Помимо некоторых характерных пиков GO, новые пики при 1638 см⁻¹ и 3427 см⁻¹ соответствовали амидной группе, а 1164 см⁻¹ и 1085 см⁻¹ — группе –SO. Спектр Tau-GO четко указывал, что Tau был функционализирован на поверхности GO (рис. 1b). На рис. 2b характерный пик –SO₃ при 1164 см⁻¹ был заглушен действием водородной связи и не был виден в ФТИР спектрах. Следовательно, 5-ФУ успешно загружен на Tau-GO.

УФ-видимые абсорбционные спектры GO показаны на рис. 3. Очевидный пик абсорбции при 234 нм атрибутировался π–π* переходу графеновых C=C связей. Кроме того, плечевой пик при 300 нм приписывался n–π* переходу графеновых оксида C=O связей на карбоксильной или карбонильной группе. Два характерных пика абсорбции доказывали успешную подготовку GO.

Размеры GO, Tau-GO и 5-ФУ-Tau-GO показаны на рис. 4. Дзета-потенциалы GO, Tau-GO и 5-ФУ-Tau-GO показаны на рис. 5. Размер листов GO составлял примерно 221 нм, а значение PDI ~0,188, указывая на равномерное распределение и хорошую стабильность приготовленного GO. Дзета-потенциал составлял примерно −33,3 мВ, указывая на то, что отрицательный заряд преимущественно обусловлен наличием множества кислородсодержащих групп на поверхности. Когда GO модифицировали Tau через амидную связь, аминогруппы заменяли некоторые карбоксильные группы, а –SO₃ имел более сильную ионизационную способность в растворе, дзета-потенциал уменьшался и становился −38,8 мВ. Размер и PDI значения Tau-GO составляли примерно 242 нм и 0,190. Затем 5-ФУ загружали на Tau-GO нековалентной связью. Дзета-потенциал составлял примерно −26,7 мВ, а абсолютное значение было больше 20 мВ. Более того, размер и PDI значения 5-ФУ-Tau-GO составляли примерно 264 нм и 0,182, это указывает на то, что электростатическое отталкивание между частицами велико, что нелегко вызывает агрегацию или осаждение, и что Tau имеет хорошую водорастворимость, GO также имеет хорошую водорастворимость, потому что его поверхность модифицирована кислородсодержащими функциональными группами. Использование носителя Tau-GO для загрузки 5-ФУ значительно улучшает водорастворимость 5-ФУ, так что 5-ФУ-Tau-GO может стабильно диспергироваться в водном растворе.

Морфологии GO, Tau-GO и 5-ФУ-Tau-GO характеризовались ТЕМ (рис. 6). GO представляет собой плоскую структуру с морщинками на поверхности, иллюстрируя, что это плоская двумерная структура (рис. 6a). По сравнению с GO, размер Tau-GO слегка увеличился, но все еще показывал пластинчатую структуру (рис. 6b). Изображение 5-ФУ-Tau-GO показывало, что материалы не агрегировались и не менялись с исходной пластинчатой структурой GO, остающейся нетронутой (рис. 6c). Следовательно, Tau-GO и 5-ФУ-Tau-GO имели хорошую стабильность.

Термогравиметрический анализ использовался для количественного определения составов композитов. Кривые TGA GO и Tau-GO показаны на рис. 7. GO и Tau-GO имели остаточные массы 39,73% и 34,22% в азотной атмосфере при 800 °C. Поэтому, сравнивая значения изменения массы, содержание Tau в Tau-GO определялось примерно как 13%.

XRD паттерны Tau, GO и Tau-GO показаны на рис. 8. Характерный пик GO можно наблюдать при 10,7° значения 2θ, что подтверждает формирование GO с полным окислением для сильного химического окисления и эксфолирования. После функционализации Tau на поверхности GO дифракционный паттерн пика слегка уменьшился при значении 2θ 8,2. Это означает, что GO успешно функционализирован Tau.

C1s XPS спектры GO и Tau-GO показаны на рис. 9. C1s XPS спектры GO указывают на значительную степень окисления с присутствием четырех атомов углерода, соответствующих разным функциональным группам. C1s XPS спектры Tau-GO также демонстрируют эти же атомы углерода. Кроме того, появление компонентных пиков, связанных с C–N связью, атрибутировалось аминогруппам, амидным группам. Эти результаты также указывают на то, что GO успешно функционализирован Tau.

Поведение загрузки и высвобождения препарата

5-ФУ адсорбировался на наноноситель Tau-GO через нековалентные взаимодействия. Калибровочная кривая 5-ФУ была y = 62,135x + 21,873 (r = 0,9999), диапазон 6,5–250 мкг/мл. Коэффициент инкапсуляции (EE) и эффективность загрузки препарата (LE) определялись по концентрации несвязанного препарата для оценки производительности загрузки. Результаты показали, что EE увеличивался с увеличением концентрации препарата, и наивысшее значение EE составляло 83,2%. Согласно формуле, LE составляла 33,7%, то есть 508,52 мкг 5-ФУ может адсорбироваться на 1 мг Tau-GO. Следовательно, Tau-GO — перспективный носитель препарата, способный достичь большой загрузки препарата. Возможные механизмы высокой загрузочной способности 5-ФУ на Tau-GO можно резюмировать следующим образом: во-первых, Tau используется для функционализации GO и введения активных функциональных групп (–SO₃). –SO₃ имеет сильную ионизационную способность в растворе, что снижает агрегацию между GO и облегчает загрузку 5-ФУ в Tau-GO. Во-вторых, дзета-потенциал 5-ФУ-Tau-GO отличается на 12,1 мВ от Tau-GO, что указывает на загрузку 5-ФУ на поверхность Tau-GO, и электростатическое взаимодействие играет важную роль в загрузке 5-ФУ. В-третьих, существует много форм водородных связей между 5-ФУ и носителем Tau-GO, включая –COOH в Tau-GO и –NH– в 5-ФУ, –COOH в Tau-GO и C=O в 5-ФУ, –OH в Tau-GO и –NH– в 5-ФУ, –OH в Tau-GO и –C=O в 5-ФУ, –COOH и 5-ФУ в Tau-GO –F в Tau-GO, –COOH в Tau-GO и –F в 5-ФУ, эти водородные связи делают 5-ФУ-Tau-GO стабильным в растворе.

Ин витро кумулятивное высвобождение 5-ФУ из 5-ФУ-Tau-GO при температуре 37 °C в растворах фосфатного буфера pH 1,2, 6,5 и 7,4 (симуляция желудочной среды, среды клеток рака печени и физиологической среды соответственно) показано на рис. 10. Обнаружено, что поведение высвобождения 5-ФУ влияло pH значение среды. В буфере pH 7,4 высвобождение препарата было медленным и непрерывным, и общее высвобожденное количество препарата составляло примерно 70,84% через 72 ч. В противовес, высвобожденное количество препарата при pH 7,4 было значительно ниже, чем при pH 1,2 и pH 6,5 в ту же временную точку. Общая загрузка препарата, высвобожденная из 5-ФУ-Tau-GO, могла быть достигнута примерно 90,29% и 85,75% при pH 1,2 и pH 6,5 соответственно. Это можно атрибутировать π-π взаимодействиям и водородным связям между 5-ФУ и Tau-GO. Чем ниже значение pH, тем выше степень протонирования водородной связи. Следовательно, сила водородной связи контролировалась значением pH, что приводило к высвобождению 5-ФУ. Эта pH-чувствительная система доставки препарата играет важную роль в противоопухолевых препаратах и может достичь высвобождения препарата в клетки опухоли.

Ин витро цитотоксические исследования

Для оценки потенциальной токсичности и эффективности терапии опухоли наноносителя, ин витро жизнеспособность клеток проводилась в клетках HepG2 с использованием MTT тестов (рис. 11). Tau-GO не показывал значительной цитотоксичности при разных концентрациях. После загрузки 5-ФУ, 5-ФУ-Tau-GO показывал явный ингибирующий эффект в дозазависимом режиме, следовательно, наноноситель имел способность доставлять противоопухолевые препараты. Значение IC₅₀ 5-ФУ-Tau-GO составляло 65,2 ± 0,7 мкг/мл, что было более токсичным, чем свободный 5-ФУ (196 ± 8,73 мкг/мл). Это может быть связано с способностью таурина индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, тем самым косвенно усиливая ингибирующий эффект 5-ФУ на клетки. Кроме того, из ин витро эксперимента по высвобождению видно, что 5-ФУ, загруженный на Tau-GO, может постепенно высвобождаться в клетках. Поэтому эффективное время действия 5-ФУ-Tau-GO на клетки было длиннее, чем свободного 5-ФУ, и таким образом производило лучшее ингибирование.

AO флуоресцентный агент мог излучать зеленую флуоресценцию, когда проходил через целые клеточные мембраны и окрашивал ядра, в то время как EB маркировал только ядра поврежденных клеток, излучая красно-оранжевую флуоресценцию. Клетки с ранней и поздней апоптозом демонстрировали желтовато-зеленые или оранжевые ядра с AO/EB окраской соответственно. Следовательно, AO/EB окраска проводилась для исследования, связана ли смерть клеток с апоптозом, используя характеристики морфологических изменений клеток. Результаты, полученные от AO/EB окраски, представлены на рис. 12. Контрольные клетки были веретеновидной формы с зелеными ядрами. В группе клеток, культивированных с Tau-GO в одиночестве, небольшие части ядер были инвагинированы и с темно-зелеными или оранжево-красными окрасками. Значительные оранжевые или красные апоптотические клетки с хроматиновыми фрагментами и апоптотическими телами наблюдались в группе 5-ФУ в одиночестве. По сравнению с 5-ФУ, 5-ФУ-Tau-GO вызывал больше повреждений морфологии клеток HepG2, что не только ломало клетки, но и вызывало большое количество апоптоза в раковых клетках. Как видно из изображений, почти все клетки, обработанные 5-ФУ-Tau-GO, имели морфологические изменения, большое количество клеточных фрагментов и апоптотических тел, указывая на то, что наносистема доставки препарата 5-ФУ-Tau-GO имела хороший убивающий эффект на клетки HepG2.

Фармакокинетические исследования

Фармакокинетические исследования 5-ФУ и 5-ФУ-Tau-GO проводились на крысах линии SD. Профили концентрации 5-ФУ в плазме против времени после перорального введения представлены на рис. 13a. Мы обнаружили, что тенденция двух кривых была похожей, но концентрация 5-ФУ в плазме от наноносителя 5-ФУ-Tau-GO была выше, чем от 5-ФУ в одиночестве, и это наблюдалось в каждой измеренной временной точке. Рис. 13b показывает ин виво профили высвобождения 5-ФУ через хвостовую вену. 5-ФУ-Tau-GO мог достигать устойчивого высвобождения препарата более 24 ч, и концентрация препарата постепенно уменьшалась в первые несколько часов, указывая на то, что 5-ФУ медленно высвобождался.

Двухкомпартментная модель использовалась для анализа фармакокинетических параметров перорального или внутривенного введения у крыс. Фармакокинетические параметры представлены в Таблице 1. По сравнению с 5-ФУ, 5-ФУ-Tau-GO показывал более высокие T_1/2β, которые были в 2,3 раза выше при пероральном введении и в 3,0 раза — при внутривенной инъекции соответственно. Более того, площадь под кривой концентрация-время (AUC_0−t) нанокомплексов 5-ФУ-Tau-GO была примерно в 2,1 раза выше через пероральное введение и в 2,8 раза выше через внутривенную инъекцию по сравнению с раствором 5-ФУ соответственно. Следовательно, мы заключили, что 5-ФУ-Tau-GO может значительно удлинить время удержания 5-ФУ в виво и улучшить биодоступность. Кроме того, T_1/2β нанокомплексов 5-ФУ-Tau-GO, введенных перорально (1,67 ± 1,15 ч), был длиннее, чем при внутривенной инъекции (1,33 ± 0,64 ч); однако AUC_0−t перорального введения (36,02 ± 1,83 мг/л·ч) был ниже, чем внутривенной инъекции (96,50 ± 8,70 мг/л·ч). Эти результаты могут быть связаны с двумя аспектами: с одной стороны, при внутривенной инъекции препарат напрямую входит в кровеносную систему для циркуляции и без прохождения через желудочно-кишечный барьер для перераспределения; с другой стороны, потому что 5-ФУ легко вызывает определенный ущерб желудочно-кишечной системе, это также может влиять на эффективное использование препаратов в организме.

MD моделирование

Докинг и молекулярная динамика немодифицированного GO, Tau-GO и 5-ФУ моделировались молекулярным докингом и молекулярно-динамическим моделированием. Результаты молекулярного докинга GO, Tau-GO и 5-ФУ показаны на рис. 14, где видно, что длины связей 5-ФУ с GO и Tau-GO составляют 3,66 Å и 2,602 Å соответственно. Кроме того, из результатов расчетов энергии связи 5-ФУ с GO и Tau-GO составляли 47,69 ккал/моль и 25,04 ккал/моль соответственно. Это указывало на то, что сила связи Tau-GO и 5-ФУ была сильнее, чем GO и 5-ФУ. Это связано с тем, что полярные атомы Tau, такие как S и N, образуют более сильную нековалентную связь с 5-ФУ, что делает силу между Tau-GO и 5-ФУ более сильной.

Диаграммы молекулярно-динамического моделирования GO, Tau-GO и 5-ФУ показаны на рис. 15. Согласно результатам расчетов, CED 5-ФУ-GO и 5-ФУ-Tau-GO составляли 2,67×10⁸ и 2,83×10⁸ соответственно. Эти результаты показывали более сильное взаимодействие между препаратом и Tau-GO. Графики между MSD и временем строили (рис. 16) для получения коэффициента диффузии через MSD. Коэффициенты диффузии препарата получались делением наклона на 6 следующим образом: 0,094 м²/с и 0,058 м²/с. Это показывает, что сила между Tau-GO и 5-ФУ сильнее, что согласуется с результатами молекулярного докинга. Следовательно, функционализированный GO делает весь носитель более богатым атомами и группами; поэтому делает нековалентную связь с 5-ФУ более сильной, и всю систему более стабильной.

Заключение

В кратце, мы успешно приготовили нанокомпозит Tau-GO простым химическим методом. Функционализация GO таурином имеет хорошую стабильность и улучшает его биосовместимость. Уникальная структура и блестящие свойства наноносителей Tau-GO предлагают большие возможности для загрузки и доставки 5-ФУ. 5-ФУ-Tau-GO имеет потенциальную противоопухолевую способность и отличное время циркуляции препарата. Следовательно, мы считаем, что модификация GO носителем Tau для загрузки 5-ФУ является эффективным и применимым инструментом для построения наносистемы доставки препарата 5-ФУ-Tau-GO для доставки противоопухолевых препаратов и противоопухолевой терапии.