Изготовление и характеристика оксида графена, функционализированного таурином, с 5-фторурацилом в качестве противораковых систем доставки лекарств

Введение

Химиотерапия по-прежнему является распространенным методом лечения различных видов рака [1]. Существенным препятствием для большинства химиотерапевтических агентов является их неспособность проникать в опухолевые ткани в эффективных концентрациях или их нежелательные побочные эффекты в нормальных тканях [2]. Поэтому ученые сосредоточили свои усилия на разработке мощной системы доставки лекарств, которая может обеспечить контролируемую скорость высвобождения лекарства в опухолевых тканях, чтобы гарантировать эффективную доставку лекарств и терапию.

Многие наноразмерные материалы, включая липосомы [3], полимеры [4], наночастицы [5], дендримеры [6], мицеллы [7] и оксид графена [8, 9], были разработаны для доставки различных лекарств. Среди этих наноматериалов оксид графена (GO) представляет собой новый углеродный наноматериал, который химически отслаивается от окисленного графита и демонстрирует несколько увлекательных физических и химических свойств, таких как большое количество функциональных групп, большая удельная площадь поверхности, высокое количество лекарственного вещества и отличное диспергирование. способность в воде [10,11,12]. Более того, большинство экспериментальных результатов in vitro показали, что низкая концентрация ГО может использоваться в качестве субстрата для роста клеток и для активации иммунных клеток. Таким образом, ГО широко используется в диагностике заболеваний [13], визуализации и отслеживании раковых клеток [14], фототермической терапии рака [15], тканевой инженерии [16], адресной доставке лекарств [17] и особенно в качестве анти- носитель противоопухолевых препаратов [18, 19]. Однако несколько исследовательских групп сообщили, что высокая концентрация ГО имеет очевидные цитотоксические эффекты в доклинических и клинических исследованиях. Механизм, с помощью которого ГО вызывает токсические эффекты in vivo, заключается в окислительном стрессе и перепроизводстве внутриклеточных активных форм кислорода, вызывающих апоптоз клеток и вызывающих тяжелое воспаление, отек легких и образование гранулем [20]. Поэтому крайне важно решить проблему токсичности GO.

Сообщается, что функционализация ковалентных или нековалентных связей может снизить сильное гидрофобное взаимодействие между ГО и клетками. Это было продемонстрировано несколькими исследованиями, которые показали, что функционализация ГО улучшает его биосовместимость и почти устраняет его токсичность in vivo и in vitro. Yang et al. впервые изучили долгосрочное биораспределение ковалентно конъюгированного PEG-GO у мышей с использованием метода радиоактивного мечения, и результаты показали, что PEG-GO может постепенно выводиться из организма мышей, вероятно, с мочой и калом [21]. Zhang et al. сравнили ГО, функционализированный DEX, с ГО и обнаружили, что GO-DEX может значительно снизить клеточную токсичность и в основном выводится из организма мышей в течение недели [22]. Кроме того, нековалентное связывание ГО с плюроником F127 приводит к хорошей растворимости и стабильности в физиологических условиях, а также к низкой токсичности [23]. Хотя для функционализации ГО было использовано несколько полимеров или молекул, в этой области были достигнуты значительные результаты. Однако все еще необходимы усилия для разработки простых методов создания хорошего биосовместимого носителя для лекарств на основе GO.

Таурин (тау) - это полузаменимая аминокислота с хорошей стабильностью и растворимостью в воде. Тау может предотвратить сердечно-сосудистые и цереброваскулярные заболевания, поддерживать зрительную функцию, защищать клетки и регулировать иммунитет. Многочисленные исследования показали, что тау-белок обладает противоопухолевыми свойствами за счет его активации или подавления факторов экспрессии, которые играют важную роль в различных формах рака, включая рак легких, желудка, толстой кишки и молочной железы [24]. Таким образом, ГО, функционализированный тау, может играть более важную роль в качестве носителя противоопухолевых лекарственных средств. В этой статье мы впервые использовали ковалентный тау-функционализированный ГО в качестве наноносителя и оценили его цитотоксичность in vitro. Кроме того, 5-фторурацил (5-FU) использовался в качестве противоракового препарата, который нековалентно загружался на поверхность Tau-GO для создания системы доставки лекарственного средства. 5-FU-Tau-GO может не только уменьшить побочные эффекты на нормальные ткани, но также улучшить биодоступность лекарства. Следовательно, Тау-ГО был успешно разработан как новый наноматериал на основе ГО, который может иметь важные биомедицинские применения в будущем.

Эксперименты и методы

Материалы

Графитовый порошок, фосфатно-солевой буферный раствор (PBS) и диметилсульфоксид (ДМСО) были приобретены у Tianjin Laibo Chemical Co., Ltd .; Карбодиимид (EDC), N-гидроксисукцинимид (NHS), соляная кислота (HCl) и пероксид водорода (H ₂ О ₂ 30%) были приобретены у Shandong Yuwang Industrial Co., Ltd .; Таурин (Tau), 5-фторурацил (5-FU), клетки гепатомы человека (HepG2), раствор пенициллин-стрептомицин и фетальная бычья сыворотка (FBS) были приобретены у Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd .; серная кислота (H ₂ SO ₄ 98%) и перманганат калия (KMnO ₄ ) были приобретены у Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd .; нитрат натрия (NaNO ₃ ) и додецилсульфат натрия (SDS-Na) были приобретены у Shanghai Jinjinle Industrial Co., Ltd .; МТТ был приобретен у Sigma-Aldrich, Inc; DMEM был приобретен у HyClone, Inc; Крысы были приобретены в Центре экспериментальных животных Benxi Changsheng. Все остальные реагенты и химические вещества были аналитически чистыми и коммерчески доступными.

GO Synthesis

ГО был приготовлен из графитового порошка по модифицированной методике Хаммера. Сначала 168 мл 98% -ной серной кислоты добавляли вдоль стенки трехгорлой колбы, которую помещали в ледяную баню с термометром, и добавляли 5 г графита и 4 г нитрата натрия, когда температура достигала 5 ° C. Затем медленно порциями в течение 1 ч добавляли 22,5 г перманганата калия и поддерживали температуру ниже 5 ° C. После этого трехгорлую колбу переносили на масляную баню, и полученная смесь подвергалась взаимодействию при 35 ° C в течение 30 минут, затем температуру повышали до 65 ° C и реакционную смесь перемешивали в течение 30 минут. После этой стадии температуру повысили до 85 ° C и смесь подвергали дальнейшему взаимодействию в течение 1 ч с получением пурпурно-коричневой пасты. Эту смесь оставляли стоять в комнате на 1 неделю, переносили в химический стакан с 700 мл горячей воды и добавляли по каплям 30% перекись водорода до тех пор, пока она не стала желтовато-коричневой. Смесь центрифугировали при 10000 об / мин, промывали горячей водой и этот процесс повторяли несколько раз до тех пор, пока pH супернатанта не достигал 7,0. Наконец, продукт сушили в вакуумной сублимационной сушилке и получали нано-GO.

Синтез Тау-ГО

Точно взвешенные 50 мг GO растворяли в 50 мл дистиллированной воды и добавляли 150 мг EDC и 100 мг NHS для активации GO путем обработки ультразвуком на бане с ледяной водой в течение 20 мин. Затем 10 мл водного раствора тау (0,1 г / мл) медленно (по каплям) добавляли к приготовленному водному раствору GO, pH доводили до 6–7 с помощью HCl и непрерывно перемешивали в течение 24 ч в комнате в темноте. Продукт собирали центрифугированием при 5000 об / мин в течение 10 мин и 3 раза промывали дистиллированной водой. Tau-GO собирали после сублимационной сушки.

Загрузка 5-FU

20 мл раствора Тау-ГО обрабатывали ультразвуком в течение 2 ч. Точно взвешенное количество 5-FU растворяли в соответствующем количестве дистиллированной воды и медленно по каплям добавляли к приготовленному раствору Tau-GO при перемешивании при комнатной температуре, затем обрабатывали ультразвуком при 30 ° C в темноте в течение 1,5 часов. Продукты центрифугировали при 5000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° C. Нижний осадок промывали 20 мл дистиллированной воды и центрифугировали (5000 об / мин в течение 10 мин при 4 ° C), и процесс повторялся 3 раза. Нижний слой лиофилизировали, супернатант помещали в химический стакан, взвешивали объем, определяли концентрацию 5-ФУ с помощью ВЭЖХ 1200 (Agilent, США). Условия обнаружения были следующими:хроматографическая колонка:C18 (4,6 × 250 нм, 5 мкм); температура колонки:25 ° C; подвижная фаза:0,1% KH ₂ ЗП ₄ раствор с pH 5,5; скорость потока:1,0 мл / мин; объем впрыска:20 мкл; длина волны измерения:265 нм. Коэффициент инкапсуляции (EE) и эффективность загрузки лекарственного средства (LE) были получены по следующей формуле:

Общая доза 5-ФУ была записана как M ₁ . , концентрация и объем свободного 5-FU были записаны как C ₁ и L ₁ , а концентрация носителя была записана как C ₀ .

Характеристика

Чтобы охарактеризовать приготовленный нанокомпозит, инфракрасные спектры с преобразованием Фурье (FT-IR) сканировали от 4000 до 400 см ^-1 . на спектрометре IRAffinity-1 (Shimadzu, Япония) для подтверждения взаимодействий. Спектры поглощения в УФ-видимой области регистрировали на сканирующем спектрофотометре UV-3600 (Shimadzu, Япония). Образцы растворяли в дистиллированной воде, и размеры частиц, дзета-потенциалы и значения PDI получали на приборе Nano-ZS 90 Nano (Malvern, UK). Морфологию образцов анализировали с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЕМ) JEM-2100 (JEOL, Япония). Термогравиметрические анализы (ТГА) проводили на термогравиметрическом анализаторе (NETZSCH, Германия) при скорости нагрева 10 ° C / мин от 0 до 800 ° C в атмосфере азота. Рентгеноструктурное измерение образцов проводили на рентгеновском дифрактометре (Bruker, Германия) с медным CuKα-излучением ( λ =1,5406 Å) в широкоугольном положении с углом 2θ. Измерения XPS были выполнены с использованием зонда Omicron ESCA Probe с монохроматическим датчиком Al Karadiation (Thermo, America).

Выпуск лекарства in vitro

Высвобождение лекарственного средства in vitro осуществляли при pH 1,2 (моделирование среды желудка), рН 6,5 (моделирование среды клеток рака печени) и рН 7,4 (моделирование физиологической среды) при 37 ° C (моделируемая температура тела), соответственно. Вкратце, 15 мг 5-FU-Tau-GO помещали в диализную мембрану, погруженную в 50 мл буферных растворов, содержащих 0,1% SDS-Na с pH 1,2, 6,5 и 7,4. Все образцы помещали в водяную баню для непрерывного встряхивания со скоростью 100 об / мин и при температуре 37 ° C. В заранее определенные моменты времени (0 минут, 5 минут, 10 минут, 20 минут, 30 минут, 1 час, 1,5 часа, 2 часа, 2,5 часа, 3 часа, 4 часа, 8 часов, 12 часов, 24 часа, 48 часов и 72 ч), отобрали 1 мл каждого образца и заменили его 1 мл свежего буферного раствора, содержащего 0,1% SDS-Na, для поддержания того же объема среды высвобождения. Высвободившуюся среду центрифугировали и анализировали с помощью ВЭЖХ 1200.

Исследования цитотоксичности in vitro

Анализ МТТ

Анализ МТТ использовали для оценки цитотоксичности 5-FU, Tau-GO и 5-FU-Tau-GO. Вкратце, клетки гепатомы человека HepG2 культивировали в среде DEME с добавлением 10% FBS и 1% антибиотиков (раствор пенициллин-стрептомицин) при 37 ° C во влажной атмосфере с 5% CO ₂ . Клетки высевали в 96-луночный планшет с плотностью 5 × 10 ³ . клеток на лунку, содержащую 100 мкл среды DEME, дополненной FBS и антибиотиками. Планшет помещали на 24 часа в увлажненную камеру при 37 ° C, содержащую 5% CO ₂ . . После этого питательную среду удаляли и снова заполняли 100 мкл свежей среды, которая содержала различные концентрации (5, 10, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг / мл) 5-FU, Tau-GO, 5-FU- Тау-ГО соответственно. После 24-часовой инкубации клетки обрабатывали 20 мкл раствора МТТ и дополнительно инкубировали в течение 4 часов. Затем среду отсасывали и кристаллы формазана растворяли в 150 мкл ДМСО. Наконец, планшеты с лунками встряхивали при 37 ° C в течение 15 мин в осцилляторе постоянной температуры. Оптическую плотность (OD) каждого образца измеряли при 570 нм с использованием устройства для считывания микропланшетов. Эксперименты проводили в трех повторностях. Степень ингибирования клеток рассчитывалась по результатам по следующей формуле:

где OD _control абсорбция, полученная необработанными контрольными клетками, OD _{обработанными} абсорбция, полученная обработанными клетками.

Анализ окрашивания AO / EB

Двойное окрашивание AO / EB использовали для оценки морфологических изменений клеток, обработанных 5-FU, Tau-GO и 5-FU-Tau-GO. Вкратце, клетки HepG2 в фазе логарифмического роста высевали в 6-луночный планшет при плотности 10000 клеток на лунку и культивировали в инкубаторе при 37 ° C и при 5% CO ₂ Атмосфера. Через 24 часа клетки обрабатывали фиксированной концентрацией 5-FU, Tau-GO или 5-FU-Tau-GO, а затем инкубировали в течение 24 часов. Среду из каждой лунки удаляли, и клетки дважды промывали PBS. Затем 1 мл PBS с добавлением 40 мкл флуоресцентных красителей (1 мг / мл AO и 1 мг / мл EB были смешаны в соотношении 1:1) добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 10 минут без света. Окрашенные клетки наблюдали под флуоресцентным микроскопом, и изображения делали случайным образом.

Фармакокинетическое исследование

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с политикой и принципами, сформулированными Комитетом по защите животных и этике. Всего 24 крысы-самцы SD с массой тела 230-270 г голодали в течение 12 часов и случайным образом делились на 4 группы перед введением лекарственного средства. Группам A и B внутривенно вводили растворы 5-FU и 5-FU-Tau-GO, а группам C и D давали пероральные растворы 5-FU и 5-FU-Tau-GO, соответственно. Все группы получали дозу 20 мг / кг. После введения лекарства образцы крови (около 0,5 мл) собирали в пробирки для антикоагуляции в заданные моменты времени (15 мин, 1 час, 2 часа, 4 часа, 6 часов, 8 часов, 12 часов, 16 часов, 24 часа и 48 часов). час). Образцы плазмы отделяли центрифугированием при 7500 об / мин и при 4 ° C в течение 10 мин. Затем 200 мкл плазмы и 50 мг (NH ₄ ) ₂ SO ₄ были объединены в пробирке (10 мкл раствора внутреннего стандарта 5-BrU 40 мкг / мл, высушены продувкой азотом на водяной бане при 40 ° C, встряхивались в течение 5 минут и центрифугированы при 10800 об / мин в течение 3 минут. Затем пробирка была добавляли 900 мкл раствора этилацетат / изопропанол (85:15, об. / об.), встряхивали в течение 3 мин и центрифугировали при 10800 об / мин в течение 15 мин. Супернатант удаляли и сушили азотом, добавляли 100 мкл подвижной фазы и Пробирку встряхивали в течение 1 мин. Наконец, полученный раствор, собранный из супернатанта, измеряли с помощью ВЭЖХ 1200.

Моделирование молекулярной динамики

Моделирование молекулярной динамики в основном используется для анализа силы взаимодействия между лекарственным средством и носителем и диффузионного поведения лекарственного средства. Химическая структура 5-FU была построена с использованием Chemdraw of chem office 2014, а структуры Tau-GO и GO были определены в модуле Polymer and Molecule Builders с использованием программного обеспечения для молекулярного моделирования Materials Studio (версия 7.0, Accelrys Inc. , США). Все построенные соединения были геометрически оптимизированы под действием силового поля COMPASS II, и конформация с наименьшей энергией была выбрана в качестве стабильной конформации. Уравновешивание NVT в течение 10 пс проводилось для каждой системы. Моделирование проводилось с использованием МД 100 пс для получения сбалансированной структуры при 298 К и 101,325 кПа с шагом 1 фс. Наконец, для каждой системы были получены среднеквадратичное смещение (MSD) и плотность энергии когезии (CED), а коэффициент диффузии (D) был рассчитан по следующей формуле:

где d - размерность системы, \ (r \ overrightarrow {\ left (t \ right)} \) и \ (r \ overrightarrow {\ left (0 \ right)} \) - вектор положения молекулы лекарства в момент времени т и 0 соответственно, \ (\ left [{\ left. {r \ overrightarrow {\ left (t \ right)} - ​​r \ overrightarrow {\ left (0 \ right)}} \ right]} \ right. ^ { 2} \) означает MSD.

Результаты и обсуждение

Характеристика

Конъюгат Тау-ГО был изготовлен амидной связью ГО и Тау. Успешный синтез нанокомпозита был подтвержден спектрами FT-IR (рис. 1). Присутствие кислородных функциональных групп на ГО подтверждается пиками поглощения при –ОН (~ 3405 см ^-1 ), C =O (1723 см ⁻¹ ), C =C (1628 см ⁻¹ ) и C – OH (1391 см ⁻¹ ). Эти результаты подтвердили успешность приготовления ГО (рис. 1а) [25]. Помимо некоторых характерных пиков GO, новые пики на 1638 см ⁻¹ и 3427 см ⁻¹ соответствует амидной группе, а 1164 см ⁻¹ и 1085 см ⁻¹ соответствует –SO. Спектр Tau-GO ясно показывает, что Tau функционализирован на поверхности GO (рис. 1b). На рис. 2б характерный пик –SO ₃ на 1164 см ⁻¹ был поглощен действием водородных связей и не был виден в ИК-Фурье спектрах. Таким образом, 5-ФУ был успешно загружен на Тау-ГО.

ИК-Фурье спектры GO ( a ) и Тау-ГО ( b )

ИК-Фурье спектры Тау-ГО ( a ) и 5-ФУ-Тау-ГО ( b )

Спектры поглощения GO UV – Vis показаны на рис. 3. Очевидный пик поглощения при 234 нм был приписан π – π * переходу связей C =C графена. Кроме того, пик плеча 300 нм был приписан n – π * -переходу связей C =O оксида графена на карбоксильной или карбонильной группе. Было доказано, что два характерных пика поглощения являются успешными препаратами ГО.

УФ-спектры ГО

Размеры ГО, Тау-ГО и 5-ФУ-Тау-ГО показаны на рис. 4. Дзета-потенциал ГО, тау-ГО и 5-ФУ-Тау-ГО показаны на рис. 5. Размер толщина листов GO составляла приблизительно 221 нм, а значение PDI было приблизительно 0,188, что указывает на то, что приготовленный GO имеет равномерное распределение и хорошую стабильность. Дзета-потенциал составлял приблизительно -33,3 мВ, что указывает на то, что отрицательный заряд в основном обусловлен присутствием многих кислородсодержащих групп на поверхности. Когда GO был модифицирован тау посредством амидной связи, аминогруппы заменяли некоторые из карбоксильных групп и –SO ₃ имел более сильную ионизирующую способность в растворе, дзета-потенциал уменьшился и стал - 38,8 мВ. Размер и значения PDI Tau-GO составляли приблизительно 242 нм и 0,190 нм. Затем 5-FU загружали в Tau-GO нековалентным связыванием. Дзета-потенциал составлял приблизительно -26,7 мВ, а абсолютное значение превышало 20 мВ. Кроме того, размер и значения PDI 5-FU-Tau-GO составляли приблизительно 264 нм и 0,182, это указывает на то, что электростатическое отталкивание между частицами велико, что нелегко вызвать агрегацию или осаждение, и что тау-белок имеет хорошую растворимость в воде. , GO также хорошо растворим в воде, поскольку его поверхность модифицирована кислородсодержащими функциональными группами. Использование носителя Tau-GO для загрузки 5-FU значительно улучшает растворимость 5-FU в воде, так что 5-FU-Tau-GO может стабильно диспергироваться в водном растворе.

Размер частиц GO ( a ), Тау-ГО ( б ) и 5-ФУ-Тау-ГО ( c )

Дзета-потенциалы GO ( a ), Тау-ГО ( б ) и 5-ФУ-Тау-ГО ( c )

Морфологии ГО, Тау-ГО и 5-ФУ-Тау-ГО были охарактеризованы с помощью ПЭМ (рис. 6). GO представляет собой плоскую структуру со складками на поверхности, что свидетельствует о том, что это плоская двумерная структура (рис. 6a). По сравнению с GO размер Tau-GO был немного увеличен, но все же имел пластинчатую структуру (рис. 6b). Изображение 5-FU-Tau-GO показало, что материалы не агрегировались или не изменялись при сохранении исходной ламеллярной структуры GO (рис. 6c). Следовательно, Тау-ГО и 5-ФУ-Тау-ГО имели хорошую стабильность.

ТЕМ ГО ( a ), Тау-ГО ( б ) и 5-ФУ-Тау-ГО ( c )

Термогравиметрический анализ был использован для количественной оценки составов композитов. Кривые ТГА GO и Tau-GO показаны на рис. 7. GO и Tau-GO имеют остаточную массу 39,73% и 34,22% в атмосфере азота при 800 ° C. Таким образом, при сравнении значений изменения веса было определено, что содержание тау-белка в Tau-GO составляет примерно 13%.

ТАГ ГО и Тау-ГО

Диаграммы XRD Tau, GO и Tau-GO показаны на рис. 8. Характерный пик GO можно наблюдать при 10,7 ° значения 2θ, что подтверждает образование GO с полным окислением для сильного химического окисления и процесса расслоения. . После функционализации тау-белком на поверхности GO дифракционная картина пика немного уменьшилась при значении 2θ 8,2. Это означает, что GO был успешно введен в действие Тау.

Рентгенограммы Тау, Тау-ГО и ГО

XPS-спектры C1s GO и Tau-GO показаны на рис. 9. XPS-спектры C1s GO показывают, что существует значительная степень окисления с присутствием четырех атомов углерода, соответствующих различным функциональным группам. Спектры XPS C1s Tau-GO также демонстрируют те же самые атомы углерода. Кроме того, появление пиков компонентов, связанных со связью C – N, было приписано аминогруппам, амидным группам. Эти результаты также показывают, что GO успешно функционирует с помощью Tau.

C1s XPS-шаблоны GO и Tau-GO

Поведение при загрузке и отпускании лекарств

5-ФУ адсорбировался на наноноситель тау-ГО за счет нековалентных взаимодействий. Калибровочная кривая 5-FU была y =62,135 x + 21,873 ( r =0,9999), а диапазон составлял 6,5 ~ 250 мкг / мл. Коэффициент инкапсуляции (EE) и эффективность загрузки лекарственного средства (LE) определяли по концентрациям несвязанного лекарственного средства для оценки эффективности загрузки лекарственного средства. Результаты показали, что EE увеличивалось с увеличением концентрации лекарственного средства, и что максимальное значение EE составляло 83,2%. Согласно формуле LE составлял 33,7%, то есть 508,52 мкг 5-FU можно адсорбировать на 1 мг Tau-GO. Таким образом, Тау-ГО является перспективным лекарственным средством-носителем, способным обеспечить большую лекарственную нагрузку. Возможные механизмы высокой нагрузки 5-FU на Tau-GO можно резюмировать следующими объяснениями:во-первых, Tau используется для функционализации GO и введения активных функциональных групп (–SO ₃ ). –SO ₃ обладает сильной ионизационной способностью в растворе, что снижает агломерацию между GO и облегчает загрузку 5-FU в Tau-GO. Во-вторых, дзета-потенциал 5-FU-Tau-GO на 12,1 мВ отличается от дзета-потенциала Tau-GO, что указывает на то, что 5-FU загружается на поверхность Tau-GO, и электростатическое взаимодействие играет важную роль в загрузка 5-ФУ. Наконец, существует множество форм водородных связей между 5-FU и носителем Tau-GO, включая –COOH в Tau-GO и –NH– в 5-FU, –COOH в Tau-GO и -в 5-FU C =O , –OH в Tau-GO и –NH– в 5-FU, –OH в Tau-GO и –C =O в 5-FU, –COOH и 5-FU в Tau-GO –F в Tau-GO, - COOH в Tau-GO и –F в 5-FU, эти водородные связи делают 5-FU-Tau-GO стабильным в растворе.

Кумулятивное высвобождение 5-FU из 5-FU-Tau-GO in vitro при температуре 37 ° C в растворе PBS с pH 1,2, 6,5 и 7,4 (моделирование среды желудка, среды клеток рака печени и физиологической среды, соответственно) показана на фиг. 10. Было обнаружено, что на поведение высвобожденного 5-ФУ влияло значение pH окружающей среды. В буфере с pH 7,4 высвобождение лекарства было медленным и непрерывным, и общее высвобожденное количество лекарства составляло приблизительно 70,84% через 72 часа. Напротив, высвобожденное количество лекарственного средства при pH 7,4 было значительно ниже, чем при pH 1,2 и pH 6,5 в тот же момент времени. Общая нагрузка лекарственного средства, которая высвобождалась из 5-FU-Tau-GO, могла быть достигнута приблизительно на уровне 90,29% и 85,75% и при pH 1,2 и pH 6,5 соответственно. Это может быть связано с π-π взаимодействиями и водородными связями между 5-FU и Tau-GO. Чем ниже значение pH, тем выше степень протонирования водородной связи. Следовательно, прочность водородной связи контролировалась значением pH, что привело к высвобождению 5-FU. Эта чувствительная к pH система доставки лекарств играет важную роль в противоопухолевых лекарствах и может обеспечить высвобождение лекарств в опухолевую клетку.

Кривые высвобождения 5-FU-Tau-GO в фосфатном солевом растворе in vitro при 37 ° C

Исследования цитотоксичности in vitro

Чтобы оценить потенциальную токсичность и эффективность противоопухолевой терапии наноносителя, оценивали жизнеспособность клеток in vitro на клетках HepG2 с использованием МТТ-тестов (рис. 11). Tau-GO не проявлял значительной цитотоксичности при различных концентрациях. После загрузки 5-FU 5-FU-Tau-GO проявлял очевидный ингибирующий эффект, и поэтому в зависимости от дозы наноноситель обладал способностью доставлять противоопухолевые препараты. IC ₅₀ Значение 5-FU-Tau-GO составляло 65,2 ± 0,7 мкг / мл, что было более токсичным, чем свободный 5-FU (196 ± 8,73 мкг / мл). Это может быть связано со способностью таурина вызывать апоптоз в опухолевых клетках, тем самым косвенно усиливая ингибирующее действие 5-ФУ на клетки. Кроме того, из эксперимента по высвобождению in vitro можно было увидеть, что 5-FU, загруженный на Tau-GO, может постепенно высвобождаться в клетках. Следовательно, эффективное время действия 5-FU-Tau-GO на клетки было больше, чем у свободного 5-FU, и, таким образом, обеспечивалось лучшее ингибирование.

The viability of different concentrations of 5-FU, Tau-GO, and 5-FU-Tau-GO

AO fluorescent agent could emit green fluorescence when it passed through intact cell membranes and stained nuclei, while EB only marked the nucleus of damaged cells that emitted a red/orange fluorescence. The cells with early and late apoptosis presented greenish yellow or orange nuclei with the AO/EB stain, respectively. Therefore, AO/EB staining was performed to investigate whether the cells death was associated with apoptosis using characteristics of cell morphological changes. The results obtained from the AO/EB staining are presented in Fig. 12. Control cells were in spindle shape and with green nuclei. In the cell group that was cultured with Tau-GO alone, small parts of the nuclei were invaginated and with dark green or orange-red staining. Significant orange or red apoptotic cells with chromatin fragments and apoptotic bodies were observed in the 5-FU alone group. Compared with 5-FU, 5-FU-Tau-GO caused more damage to HepG2 cell morphology, which not only broke the cells, but also caused a large amount of apoptosis in cancer cells. As can be seen from the pictures, almost all the cells that were treated with 5-FU-Tau-GO, had morphological changes, a large number of cell debris and apoptotic bodies, indicating that the 5-FU-Tau-GO nano drug delivery system had a good killing effect on HepG2 cells.

The AO/EB of control (a ), Tau-GO (b ), 5-FU (c ), and 5-FU-Tau-GO (d )

Pharmacokinetic Studies

The pharmacokinetic studies of 5-FU and 5-FU-Tau-GO were performed in SD rats. The profiles of 5-FU concentration in plasma vs. time, following oral administration, are presented in Fig. 13a. We found that the tendency of the two curves was similar, but the 5-FU plasma concentration from the 5-FU-Tau-GO nanocarrier was higher than that from the 5-FU alone and this was observed at each measured time point. Figure 13b shows the 5-FU in vivo release profiles via tail vein. The 5-FU-Tau-GO could achieve sustained drug release over 24 h, and the drug concentration gradually decreased in the first few hours, indicating that 5-FU was slowly released.

In vivo pharmacokinetic standard curves of 5-FU and 5-FU-Tau-GO through oral administration (a ). In vivo pharmacokinetic standard curve of 5-FU and 5-FU-Tau-GO through intravenous injection (b )

The two-compartment model was used to analyze the pharmacokinetic parameters of oral or intravenous administration in rats. The pharmacokinetic parameters are presented in Table 1. Compared with the 5-FU, the 5-FU-Tau-GO showed higher T_1/2β that were 2.3 times by oral administration, and 3.0 times by intravenous injection, respectively. Moreover, the area under the concentration time curve (AUC_0−t ) of 5-FU-Tau-GO nanocomplexes was roughy 2.1-fold higher through the oral administration, and 2.8-fold higher through intravenous injection when compared to that of the 5-FU solution, respectively. Therefore, we concluded that 5-FU-Tau-GO could significantly extend 5-FU retention time in vivo and improve bioavailability. In addition, the T_1/2β of the 5-FU-Tau-GO nanocomplexes that were orally administered (1.67 ± 1.15 h), was longer than that of the intravenous injection (1.33 ± 0.64 h); however, the AUC_0−t of oral administration (36.02 ± 1.83 mg/L*h) was lower than that of intravenous injection (96.50 ± 8.70 mg/L*h). These results might be due to two aspects:on the one hand, when administered by intravenous injection, the drug directly enters the blood system for circulation and without passing through the gastrointestinal barrier for redistribution; on the other hand, because 5-FU easily causes a certain damage to the gastrointestinal system, it may also affect the effective use of drugs in the body.

MD Simulations

The docking and molecular dynamics of unmodified GO, Tau-GO and 5-FU were simulated by molecular docking and molecular dynamics simulation. The molecular docking results of GO, Tau-GO and 5-FU are shown in Fig. 14, where it can be seen that the bond lengths of 5-FU and GO and Tau-GO are 3.66 Å and 2. 602 Å, respectively. Moreover, from the calculation results, the binding energies of 5-FU to GO and Tau-GO were 47.69 kcal/mol and 25.04 kcal/mol, respectively. These indicated that the binding force of Tau-GO and 5-FU was stronger than that of GO and 5-FU. This is due to Tau polar atoms, such as S and N, forming a stronger non-covalent bond with 5-FU, that makes the force between Tau-GO and 5-FU stronger.

The Molecular docking of GO sheets with 5-FU (a ). The molecular docking of Tau-GO with 5-FU (b )

The diagrams of the molecular dynamics simulation of GO, Tau-GO and 5-FU were shown in Fig. 15. According to the calculation results, the CED of 5-FU-GO and 5-FU-Tau-GO were 2.67*10 ⁸ and 2.83*10 ⁸ , соответственно. These results showed a stronger interaction between the drug and the Tau-GO. The graphs between MSD and time were plotted (Fig. 16) to obtain the diffusion coefficient via MSD. The drug diffusion coefficients were obtained by the slope divided by 6 as follows:0.094m ² /s and 0.058 m ² / с. These show that the force between Tau-GO and 5-FU is stronger, which is consistent with the results of the molecular docking. Therefore, the functionalized GO makes the entire carrier more abundant in atoms and groups; Therefore, making the non-covalent bond with 5-FU stronger, and the entire system more stable.

Snapshots of the GO and 5-FU at the end of the MD (a ). Snapshots of the Tau-GO and 5-FU at the end of the MD (b )

The drug MSD profiles of the GO and 5-FU (a ), Tau-GO and 5-FU (b )

Выводы

In summary, we successfully prepared a Tau-GO nanocomposite through a simple chemical method. GO functionalization with Tau has a good stability and improves its biocompatibility. The unique structure and brilliant properties of Tau-GO nanocarriers offer great opportunities for the loading and delivery of 5-FU. The 5-FU-Tau-GO has a potential anti-tumor ability and an excellent circulation time of drugs. Therefore, we believe that the modification of GO by the carrier Tau for 5-FU loading, is an effective and applicable tool for constructing a 5-FU-Tau-GO nano drug delivery system for the delivery of anticancer drugs and anti-tumor therapy.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, использованные и / или проанализированные в ходе текущего исследования, доступны у соответствующего автора по разумному запросу.

Сокращения

GO:

Оксид графена

Tau:

Taurine

5-FU:

5-Fluorouracil

5-FU-Tau-GO:

Taurine functionalized graphene oxide loading 5-fluorouracil

EE:

Encapsulation ratio

LE:

Drug-loading efficiency

FT-IR:

Инфракрасное преобразование Фурье

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия

TGA:

Thermogravimetric analyses

MSD:

Mean square displacement

CED:

Cohesive energy density