Эффективный одноступенчатый зеленый синтез многофункциональных золотых наночастиц для таргетированной визуализации и терапии опухолей

Аннотация

Золотые наночастицы (GNP) всегда использовались как транспортные векторы доксорубицина (DOX) для диагностики и терапии опухолей; однако процесс синтеза этих векторов заключается в приготовлении GNP химическим восстановлением сначала, затем конъюгации с DOX или специфическими пептидами, поэтому эти методы сталкивались с общими проблемами, включая множественные этапы, высокую стоимость, времязатратность, сложную подготовку и пост-обработку. Здесь мы представляем одноступенчатую стратегию приготовления DOX-конъюгированных GNP на основе химической конституции DOX впервые. Более того, мы готовим многофункциональные GNP (DRN-GNP) одноступенчатым методом с помощью редуктивных функциональных групп, которыми обладают DOX, RGD пептиды и ядерные локализационные пептиды (NLS), что требует только 30 мин. Результаты рассеянных изображений и клеточных TEM исследований указывали, что DRN-GNP могли таргетировать ядро клеток HeLa. Скорости ингибирования опухоли DRN-GNP через внутриопухолевую и вену хвостового введения у нюд мышей составляли 66,7% и 57,7% соответственно, что значительно превосходило контрольные группы. Одноступенчатый синтез многофункциональных GNP не только экономит время, материалы, но также соответствует направлению развития зеленой химии и заложит основу для крупномасштабных применений в ближайшем будущем. Наши результаты предполагали, что стратегия фабрикации эффективна, и наши приготовленные DRN-GNP обладают хорошей коллоидной стабильностью в физиологической системе; они являются потенциальным контрастным агентом и эффективным вектором транспорта DOX для диагностики и терапии шейного рака.

Введение

Доксорубицин (DOX) — широко используемое противопухолевое лекарство, которое широко применялось в различных химиотерапиях рака, таких как злокачественные опухоли крови, различные аденокарциномы, мягкотканные саркомы и др. Однако длительное и высокие дозировки DOX приводят к лекарственной резистентности, тошноте, выпадению волос и острой и хронической токсичности, что может привести к сердечной недостаточности. Поэтому очень необходимо разработать носитель лекарства с хорошей биосовместимостью и высокой способностью загрузки лекарства. В последние годы много наноматериалов, таких как квантовые точки, хитосан, кремниевые наноматериалы, полимерные наноматериалы, флуоресцентные наночастицы и металлические наноматериалы разрабатывались как транспортные векторы DOX для диагностики и терапии опухолей. Золотые наноматериалы широко использовались благодаря их уникальным химическим и оптическим свойствам, низкой токсичности, хорошей биосовместимости и способности контроля поверхностной модификации среди этих наноматериалов. На данный момент существует три подхода для конъюгации DOX на GNP. Первый — конъюгация DOX на поверхность GNP с помощью гидразина, 1-этил-3-[3-диметиламинпропил] карбодиимид гидрохлорид (EDC), pH-чувствительного агента, системы DCC/NHS. Второй — инкубация GNP с DOX минимум 24 ч. Третий — замена цитрата, конъюгированного на поверхности GNP, на DOX. Хотя эти DOX-конъюгированные GNP использовались в терапии опухолей, применение все еще ограничено из-за недостаточной специфичности. Недавно группа Эль-Сайеда функционализировала GNP с DOX, RGD пептидами и ядерными локализационными сигнальными (NLS) пептидами. Основное достоинство их работы в том, что GNP входят в опухолевые клетки через рецептор-мединированную эндоцитозу RGD пептидов, а затем входят в ядро с помощью NLS пептидов, что заставляет DOX эффективно интерферировать с ДНК синтезом. К сожалению, это требовало минимум 120 ч для конъюгации пептидов или лекарств слой за слоем на GNP, и каждый процесс требовал минимум 24 ч. Аналогично, все вышеупомянутые методы сталкивались с общими проблемами: множественные этапы, высокая стоимость, сложная подготовка и пост-обработка. Поэтому необходимо разработать простой и быстрый метод синтеза многофункциональных золотых наноматериалов.

В этой статье мы представляем одноступенчатую стратегию приготовления DOX-конъюгированных GNP на основе химической конституции DOX впервые. Более того, мы представляем удобный синтетический метод приготовления многофункционального транспортного вектора DOX для улучшения работы DOX, который может использоваться в диагностике и терапии опухолей. Ключевое различие нашей работы от других заключается в том, что мы используем DOX, RGD пептиды и NLS пептиды как восстанавливающие реагенты и стабилизирующие реагенты для фабрикации GNP и заставляем все эти три вещества конъюгироваться на поверхности GNP для формирования DRN-GNP в то же время. Наши предыдущие работы доказали, что RGD и другие пептиды могут использоваться для восстановления золотых ионов для фабрикации золотых наноматериалов. N-терминал NLS может быть модифицирован использованием цистеин-цистеин-тирозин (CCY) последовательности для построения CCYNLS, который может восстанавливать золотые ионы, сохраняя таргетирующий эффект NLS. Мы также обнаружили, что DOX обладает двумя фенольными гидроксильными группами с сильной восстановительной способностью при щелочном условии, поэтому он также может восстанавливать золотые ионы для формирования GNP. Более того, противоопухолевой эффект DOX может не быть затронут, потому что он интеркалирует в ДНК аминогруппой углерода 7 и гидроксильной группой углерода 9. В то же время сера, кислород и азот на пептидах и DOX могут комбинироваться с GNP для поддержания коллоидной стабильности. Результаты показывают, что DRN-GNP успешно фабрицированы и хорошо работали в визуализации, диагностике и терапии опухолей (Схема 1). На наше знание, это первый отчет о синтезе DOX, RGD и NLS пептидов конъюгированных многофункциональных GNP одноступенчатым методом и их применении в диагностике и терапии опухолей.

Схематичное изображение синтеза DRN-GNP, поглощения клетками HeLa и диагностики опухоли DRN-GNP

Материалы и методы

Материалы

HAuCl₄·4H₂O приобретен в Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd, циклические RGD пептиды (последовательность аминокислот: аргинин-глицин-аспартат-тирозин-глутаминовая кислота (c(RGDyE))) и гидроксид натрия те же, что и в ссылке. Доксорубицин приобретен в Sangon Biotech (Шанхай) Co., Ltd. CCYNLS пептиды (последовательность аминокислот: цистеин-цистеин-тирозин-пролин-пролин-лизин-лизин-лизин-аргинин-лизин-валин, CCYPPKKKRKV) поставлены China Peptides Co., Ltd (Шанхай, Китай). Линии клеток HeLa и MCF-7 предоставлены Guangzhou Youdi Biological Technology Co. Ltd. Фетальная телячья сыворотка (FBS) и модифицированное среднее Дюльбекко (DMEM) приобретены в GibcoBRL Life Technologies. Набор для пролиферации и цитотоксичности (MTT) приобретен в Beijing Dingguo Changsheng Biotechnology Co. Ltd.

Синтез DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP, DRN-GNP

Для приготовления DOX-GNP, раствор DOX (0,2 мг/мл, 1,0 мл) добавляли в хлороауриновую кислоту раствор (0,86 мМ, 1,0 мл) под магнитным перемешиванием, затем NaOH (2 М, 5 мкл) добавляли для регулировки pH. Для приготовления NLS-GNP, раствор CCYNLS пептидов (0,5 мМ, 1,0 мл) добавляли в хлороауриновую кислоту раствор (3,44 мМ, 1,0 мл) под магнитным перемешиванием, затем NaOH (2 М, 20 мкл) добавляли для регулировки pH. Для приготовления DR-GNP, раствор DOX (0,2 мг/мл, 1,0 мл) и раствор RGD пептидов (1,0 мМ, 1,0 мл) добавляли в хлороауриновую кислоту раствор (1,72 мМ, 2,0 мл) под магнитным перемешиванием, затем NaOH (2 М, 15 мкл) добавляли для регулировки pH. Для приготовления DN-GNP, раствор DOX (0,2 мг/мл, 1,0 мл) и раствор CCYNLS пептидов (0,5 мМ, 1,0 мл) добавляли в хлороауриновую кислоту раствор (1,72 мМ, 2,0 мл) под магнитным перемешиванием, затем NaOH (2 М, 20 мкл) добавляли для регулировки pH. Для приготовления DRN-GNP, растворы DOX (0,2 мг/мл, 1,0 мл), CCYNLS пептидов (0,5 мМ, 1,0 мл) и RGD пептидов (1,0 мМ, 1,0 мл) добавляли в хлороауриновую кислоту раствор (1,72 мМ, 3,0 мл) под магнитным перемешиванием, затем NaOH (2 М, 35 мкл) добавляли для регулировки pH. Все реакции продолжались 30 мин при 100 °C в рефлюсной системе и pH значение было 10–12. Все GNP очищали центрифугированием при 55 000 об/мин 30 мин (Optima MAX-TL, Beckman Coulter). После удаления супернатанта GNP передиспергировали в сверхчистой воде.

Характеристика

Спектры GNP реализовывали с использованием UV 3150 Спектрофотометра (Shimadzu, Япония), Nicolet Avatar FTIR модели 330 спектрометра (Thermo, Америка) и ESCALab250 рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (XPS) с теми же аналитическими условиями, что и в ссылке. TEM изображения GNP получали от TEM (JEM-2100F, JEOL, Япония) работающем при ускоряющем напряжении 200 кВ.

Динамическое рассеяние света и измерения дзета-потенциала

Zeta PALS Зета Потенциал Анализатор (Brookhaven Instrument Corporation) использовали для измерения динамического рассеяния света (DLS) DOX-GNP, NLS-GNP, DR-GNP, DN-GNP и DRN-GNP, который работал под углом 90° с твердотельным лазером (λ = 670 нм) при комнатной температуре. Когда оснащен электродом AQ-827, анализатор использовали для измерения дзета-потенциалов GNP.

ICP анализ

Количественный анализ Au в GNP был тем же, что и в ссылке.

Стабильность DR-GNP, DN-GNP и DRN-GNP, диспергированных в PBS, HCl, NaOH, NaCl растворах

Смешивали 100 мкл осажденных GNP и 500 мкл высокой концентрации 0,2 М PBS, 0,5 М HCl, 0,5 М NaOH и 1,0 М NaCl раствора соответственно. Через 12 часов делали их фото и тестировали их UV поглощения спектры.

Клеточная культура

Клетки HeLa и MCF-7 культивировали в инкубаторе (увлажненный 5% CO₂ сбалансированный воздух) при 37 °C 24 ч. Культурная среда была DMEM с 10% FBS. Количество живых клеток считали клетками счетной доской.

Цитотоксичность свободного DOX и DRN-GNP

Клетки HeLa и MCF-7 в экспоненциальной фазе добавляли в колодцы 96-колодчатых пластинок (около 5 × 10³ клеток/колодезь) и инкубировали 24 ч соответственно. Затем DRN-GNP концентраций 0, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг/мл (соответствующая концентрация DOX была 0,0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2 и 39,0 мкг/мл) инкубировали с каждым колодцем и инкубировали 24 ч при 37 °C соответственно. Контрольная группа устанавливали добавлением только буферного раствора PBS, и ее жизнеспособность устанавливали как 100%. MTT (20 мкл, 5 мг/мл) добавляли в каждый колодец и инкубировали при 37 °C около 4 ч. Затем культурную среду аккуратно всасывали, и 150 мкл двух диметилсульфоксида добавляли в каждый колодец на 10 мин до полного растворения кристалла. Микропластинный читатель (Thermo Multiskan Mk3) использовали для измерения OD значения каждого колодца при 490 нм. Три колодца для каждой группы готовили и вычисленные значения выражали как среднее ± S.D.

Эксперимент потоковой цитометрии

Клетки HeLa и MCF-7 в экспоненциальной фазе добавляли в каждый колодец двух 12-колодчатых пластинок (около 5 × 10⁴ клеток/колодезь) и инкубировали 24 ч соответственно. Затем раствор DRN-GNP добавляли в каждый колодец (конечные концентрации 0, 20, 40, 60, 80 и 100 мкг/мл) и инкубировали при 37 °C 24 ч соответственно. Удаляли культурную среду и добавляли Трипсин (содержащий EDTA) раствор в колодцы для дигеста клеток. Затем удаляли Трипсин раствор из колодцев, добавляли культурную среду в колодцы и переносили клетки в центрифугные трубки. После центрифугирования при 1000 g 5 мин, супернатант удаляли и клетки в каждой трубке собирали и считали в PBS растворе. Около 5–10 × 10⁴ клеток забирали в другие центрифугные трубки и центрифугировали при 1000 g 5 мин снова. Удаляли супернатант и добавляли 100 мкл AnnexinV буферного раствора в трубки. Добавляли 5 мкл AnnexinV-FITC и 5 мкл пропидиевого йодида в трубки и смешивали их с клетками мягко. Трубки инкубировали при комнатной температуре (20–25 °C) 15 мин в темноте и затем тестировали потоковым цитометром (BD Accuri C6).

Оптическое темнопольное рассеянное изображение и трансляционная электронная микроскопия клеточной культуры

Клетки HeLa и MCF-7 имплантировали на 8-отверстный стекло для клеточной культуры около 7 × 10³ клеток для каждого колодца соответственно. DRN-GNP добавляли в каждый колодец с конечной концентрацией 35 мкг/мл. После инкубации 24 ч физически удаляли и свободно адсорбированные GNP промыванием этих клеток PBS раствором три раза. Затем фиксировали их 4% параформальдегидом 20 мин, покрывали несколькими каплями глицерина и запечатывали эти 8-отверстные стекла для клеточной культуры другими стеклышками. Темнопольный микроскоп (Zeiss Imager Z1) использовали для оценки клеток при ×200 увеличении и рефлексивном режиме. Время экспозиции для яркопольных и темнопольных изображений при напряжении 5 В составляло 1 мс и 400 мс соответственно.

Для TEM исследований, клетки HeLa и MCF-7 инкубировали с DRN-GNP (35 мкг/мл) 24 ч в клеточном флаконе соответственно. После инкубации и всасывания смешанного раствора среды и DRN-GNP промывали клетки PBS раствором три раза и затем дигестировали их трипсином. Клетки переносили в центрифугную трубку с небольшим объемом DMEM среды. Клетки центрифугировали (1500 об/мин) 10 мин, DMEM среду аккуратно всасывали, и 3% глутаральдегидный раствор (обычно 40 раз объем материалов) аккуратно добавляли в трубку для фиксации клеток на дне трубки более 1 ч. Клетки дополнительно фиксировали добавлением 1% тетраоксида осмия 1 ч, обезвоживали этанолом и затем встраивали в Spurr (Sigma-Aldrich Co., USA). Клетки извлекали из трубки, резали на секции, окрашивали водным уранилацетатом и цитратом свинца, и затем монтировали на медную сетку (300 меш). Образцы измеряли FEI TECNAI-12 трансляционной электронной микроскопией (рабочее напряжение 120 кВ).

Животные эксперименты

Животные субъекты

Атимические самки нюд мыши приобретены в Центре животных экспериментов Южного медицинского университета (Гуанчжоу, Китай) для in vivo теста терапии опухоли. Все животные эксперименты проводились в соответствии с Правилами управления животными Министерства здравоохранения КНР (Документ № 55, 2001) и руководящими принципами заботы и использования лабораторных животных Китайского фармацевтического университета.

Терапевтическая эффективность свободного DOX и его конъюгатов в мышах с опухолями

Кратко, 36 нюд мышей (возраст 5–6 недель, вес 16–18 г) случайно делили на шесть групп. Они подкожно инъецировали клетки HeLa (5 × 10⁶ клеток в PBS) в правую подмышковую яму. Пять дней позже мыши в контрольной группе инъецировали вену хвоста физиологическим раствором (0,154 моль/л, 0,2 мл). Мыши групп свободного DOX, DR-GNP, DN-GNP и DRN-GNP инъецировали вену хвоста также. Для сравнения противоопухолевой эффективности DRN-GNP между внутривенным введением и введением в опухоль, мы установили группу для инъекции равного количества DRN-GNP в место опухоли. Эти пять групп поддерживали дозу 0,3 мг/кг эквивалент свободного или конъюгированного DOX в каждой мыши. Каждая мышь проходила вену хвоста или опухолевую инъекцию раз в день. Масса тела и объем опухоли каждой мыши мониторили каждый день в течение 14 дней. Для дальнейшего исследования терапевтических эффектов DOX, DR-GNP, DN-GNP и DRN-GNP, опухоли шести групп эксцидировали для патологического анализа после 14 дней лечения. Опухоли и внутренние органы сердца, печени, селезенки, легких и почек изолировали от мышей, фиксировали 10% нейтрально буферизованным формалином и встраивали в парафин. Нарезанные опухолевые ткани окрашивали гемatoxylином и эозином (H&E) и исследовали оптическим микроскопом Olympus.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика DOX-GNP, NLS-GNP, DN-GNP, DR-GNP, DRN-GNP

В синтезе DOX-GNP, когда раствор NaOH добавляли в смешанный раствор DOX и хлороауриновой кислоты, цвет раствора немедленно менялся с оранжевого на светло-фиолетовый, затем становился вино-красным при 100 °C в рефлюсной системе под магнитным перемешиванием за одну минуту, указывая на формирование DOX-GNP. Результат указывал на то, что восстановительная способность DOX очень сильна, потому что DOX обладает двумя фенольными гидроксильными группами (углерод №6 и №11) с сильной восстановительной способностью при щелочном условии. Реакция продолжалась 30 мин до тех пор, пока цвет не переставал меняться.

Для избежания путаницы оранжево-красного цвета DOX и вино-красного цвета GNP, мы приводим больше доказательств, характеризуя их UV поглощения спектры (как показано на рис. 1a). DOX имеет характерный пик поглощения около 485 нм и пик при 530 нм; однако пик при 480 нм исчезал в спектре раствора продукта и характерный пик при 520 нм поверхностного плазмонного резонанса (SPR) GNP возникал. Даже так, формирование GNP все еще не полностью определено между 520 нм GNP и 530 нм пиком DOX. Учитывая, что GNP осадятся с высокоскоростной центрифугацией, а молекулы DOX нет, мы видим фиолетовый осадок в продукте на дне центрифужной трубки (вставка рис. 1a(3-4)) и DOX не имеет ни того ни другого (вставка рис. 1a (1-2)).

a UV-Vis поглощения спектры DOX и приготовленных DOX-GNP, вставка (a) — изображения DOX (1, 2) и DOX-GNP (3, 4) до (1, 3) и после центрифугирования (2, 4). b TEM изображение DOX-GNP. c FTIR спектры DOX и приготовленных DOX-GNP. d XPS спектр DOX-GNP

DOX имеет красную флуоресценцию под облучением 365 нм ультрафиолетовым светом; однако флуоресценция DOX исчезала после синтеза GNP. Есть две возможные причины: первая — коэффициент гашения GNP очень силен, они склонны гасить флуоресценцию молекул, когда они близко расположены к поверхности GNP (< 5 нм). Если расстояние увеличивается до 20 нм или более, плазмонное поле наночастиц слишком далеко для гашения их флуоресцентного сигнала. Другая причина — флуоресцентная группа DOX была разрушена после игры роли восстановительного агента. Как показано на рис. 1c, хотя количество инфракрасных пиков поглощения DOX-GNP значительно меньше, чем у DOX, многие характеристики DOX все еще сохранялись, такие как характерные IR пики поглощения при 2910 см⁻¹ (C-H, растяжение вибрации), 1631 см⁻¹ (карбонил растяжение вибрации), 1114 см⁻¹ (C-O, C-N растяжение вибрации) и 867 см⁻¹ (N-H, C-H, выпрямленные вибрации) соответственно. Те представительные пики DOX также отображались в спектрах DOX-GNP, указывая на то, что DOX успешно связался с DOX-GNP. Интересно, пик при 1214 см⁻¹ характерный пик для C-O растяжения вибрации фенольной гидроксильной группы исчез в спектрах DOX-GNP. Фенольная группа может восстанавливать Au ионы в GNP, а затем переносилась в карбонильную группу. Мы предполагаем, что эффект DOX не затронут, потому что он интеркалирует в ДНК аминогруппой углерода 7 и гидроксильной группой углерода 9.

Мы можем наблюдать, что размер частиц DOX-GNP составляет около 6 нм из результатов TEM (рис. 1b). Рассчитанное отношение Au (I) составляло 31,93% из XPS спектра DOX-GNP (рис. 1d), что достаточно высоко для поддержания стабильности коллоида. Однако когда осадок DOX-GNP диспергировали в 0,2 М PBS буферном растворе с высокоскоростной центрифугацией после удаления супернатанта, цвет этого раствора становился фиолетово-черным, и был виден нерастворимый флокулент. Это указывало на то, что стабильность DOX-GNP была не очень хороша в среде высокой соляной концентрации. Это можно объяснить тем, что DOX обладает только одной аминогруппой, но не обладает сульфидрильной группой, что недостаточно для DOX для соединения с поверхностью GNP через Au-S и Au-N связи. Так что нужны больше усилий, если DOX-GNP используется как контрастный агент и противоопухолевой материал для визуализации и терапии опухолей.

Мы синтезировали DRN-GNP с DOX, RGD пептидами и NLS пептидами как восстанавливающими и стабилизирующими агентами. RGD пептиды могут специфически таргетировать некоторые опухолевые клетки, сверхэкспрессирующие интегрины α_vβ₃, а NLS пептиды могут специфически таргетировать ядро. Рис. 2a показывает UV-Vis спектры фабрицированных DOX-GNP, NLS-GNP, DRN-GNP; характеристики их поверхностного плазмонного поглощения пика было 520–530 нм. Можно также увидеть из вставки, что GNP показывали яркий вино-красный цвет. TEM изображения (Доп. файл 1: Рисунок S1) показывают, что размер частиц NLS-GNP и DRN-GNP составлял около 10 нм и 5 нм, и GNP распределялись равномерно, никакого очевидного коагулирования не находили.

a UV-Vis поглощения спектры и фото изображения DOX-GNP (a), NLS-GNP (b) и DRN-GNP (c). b UV-Vis поглощения спектры основного DOX, RGD пептидов, NLS пептидов и супернатанта DRN-GNP. c FTIR спектры NLS пептидов, NLS-GNP и DRN-GNP. Расстояние между спектром GNP и спектром NLS пептидов увеличено для контраста

Для валидации синтеза NLS-GNP и DRN-GNP мы характеризовали FTIR спектры NLS пептидов и GNP на рис. 2c. Некоторые FTIR пики NLS пептидов находили в спектрах NLS-GNP и DRN-GNP, такие как C-H растяжение вибрации поглощения пик (2840–2972 см⁻¹), C=O растяжение вибрации поглощения пик (1630–1700 см⁻¹) и =C-H в-плоскости изгиб вибрации пик (1300–1475 см⁻¹); это указывало на то, что CCYNLS пептиды успешно конъюгировались на поверхности GNP. Мы также обнаружили, что бензольный скелет вибрации пика тирозина терминала в NLS пептиде при 1529 см⁻¹ и фенольная гидроксильная C-O растяжение вибрации пик при 1193 см⁻¹ исчезли в инфракрасных спектрах NLS-GNP и DRN-GNP, это означает, что бензольный скелет тирозина терминала был транспортирован в киноновую структуру после игры роли восстановительного агента.

Мы центрифугировали DRN-GNP с высокой скоростью, собирали супернатантную жидкость, которая была почти бесцветной, и затем тестировали, остались ли реагенты через UV-Vis спектры на рис. 2b. UV поглощения пики RGD и NLS пептидов производятся от тирозин остатков, поглощения пик находился при 275 нм. Однако фенольная гидроксильная группа становилась отрицательными кислородными ионами при щелочных условиях, что увеличивало электронную плотность бензольного кольца, пик был красносдвинут до 292 нм. Мы не видели характерный пик в UV-Vis спектре супернатанта DRN-GNP, что означает, что оба пептида приняли участие в реакции. DOX обладает тремя поглощениями пиками в диапазоне 450–600 нм, но супернатант DRN-GNP не имеет тех пиков. Кроме того, никакого DOX не находили в супернатанте DRN-GNP, потому что его цвет был светло-коричневым, а цвет DOX при щелочном условии был прозрачным светло-фиолетовым. Можно заключить, что три материала почти полностью реагируют. Аналогично DR-GNP и DN-GNP также объясняются этим путем, см. Доп. файл 1: Рисунок S2.

Мы использовали XPS спектроскопию для изучения валентности Au для NLS-GNP и DRN-GNP. Как показано на рис. 3a, b, два пика с энергиями связи около 83,6 эВ и 87,0 эВ согласуются с эмиссией Au 4f7/2 и 4f 5/2 фотоэлектронов. Их Au 4f7/2 энергия связи позиции обоих GNP почти 84,0 эВ. Для NLS-GNP это может быть деконволюционировано в Au (0) (83,5 эВ) и Au (I) (84,1 эВ), их площадь пиков соотношение 57% и 43% соответственно. Аналогично для DRN-GNP это может быть деконволюционировано в Au (0) (83,6 эВ) и Au (I) (84,4 эВ), площади пиков соотношения 62% и 38% соответственно, таким образом у них более высокая пропорция Au (I). Заряд может образовывать Au (I)-S комплексы, которые помогают поддерживать коллоидную стабильность GNP. Интересно, мы идентифицировали три типа S в XPS спектрах NLS-GNP, DN-GNP и DRN-GNP в Доп. файл 1: Рисунок S3. Синие и черные кривые представляют окислительные состояния серы, фиолетовые кривые представляют S-H связь, а зеленая кривая представляет Au-S связь. Формирование Au-S связи иллюстрировало, что NLS пептиды успешно конъюгировались на поверхности этих трех GNP.

XPS спектр Au 4f (a) NLS-GNP, (b) DRN-GNP. Au 4f7/2 энергия связи исходных спектров (черные) и аппроксимированных результатов (красные) могли быть деконволюционированы в два компонента, Au(0)-синяя кривая и Au(I)-фиолетовая кривая. UV-Vis поглощения спектры и изображения DRN-GNP диспергированных в PBS, NaCl, NaOH и HCl соответственно (c).

Более того, пики N 1s, C 1s и O 1s XPS спектров демонстрировали, что пептиды и DOX были присоединены к GNP (Доп. файл 1: Рисунок S4).

XRD спектры (Доп. файл 1: Рисунок S5) показывали, что кристаллическая структура этих GNP является гранецентрированной кубической кристаллической структурой, потому что все их XRD спектры содержали четыре пика при 38,2°, 44,5°, 64,7° и 77,8°, соответствующие плоскостям (111), (200), (220) и (311).

Стабильность DRN-GNP

Динамическое рассеяние света (DLS) и дзета-потенциал данных этих пяти GNP отображены в Таблице 1; их гидродинамический размер больше, чем характеризованный TEM, что может быть приписано определенному количеству гидратированных молекул вокруг ядра водорастворимых GNP. Их дзета-потенциалы были отрицательными из-за карбоксильной группы, конъюгированной на поверхности GNP. Раствор GNP показывает хорошую коллоидную стабильность, когда абсолютное значение дзета-потенциала больше 30 мВ; чем больше абсолютное значение, тем лучше стабильность. Можно увидеть, что они все обладают хорошей коллоидной стабильностью из Таблицы 1. В сравнении, значение дзета-потенциала NLS-GNP было самым высоким, это может быть потому, что их поверхность полна NLS пептидов, которые могут образовывать сильную Au-S связь через тиол группу. Абсолютное значение дзета-потенциала DOX-GNP было близко к 30 мВ; это было согласовано с ранее упомянутым, что DOX-GNP не были очень стабильны, когда они диспергировались в PBS буферном растворе. Спектральные данные отображены в Доп. файл 1: Рисунок S6.

Изменения характерных поверхностных плазмонных резонансных (SPR) полос GNP могут использоваться для определения агрегации GNP с использованием UV-Vis спектрометрии. Мы измеряли их UV-Vis спектры и делали фотографии DRN-GNP (рис. 3c), когда они диспергировались в высокосолевых (1 М NaCl и 0,2 М PBS), сильных кислотных (0,5 М HCl) и сильных щелочных (0,5 М NaOH) растворах. Никакого изменения цвета раствора или сдвига UV-vis спектров не наблюдалось под различными суровыми условиями, за исключением HCl раствора, в котором их цвет менялся на слегка фиолетовый и ультрафиолетное поглощение пик красносдвигался примерно на 20 нм, что означает, что GNP слегка коагулировали под сильным кислотным условием. Причина может быть в том, что отрицательно заряженная коллоидная стабильность GNP была затронута под сильным кислотным условием, но не влиялась в нейтральном PBS буфере и щелочной среде. Мы можем заключить, что DRN-GNP высоко стабильны под высокосолевыми и щелочными условиями, указывая на то, что наши синтезированные DRN-GNP ожидались быть использованными для in vitro клеточной визуализации и in vivo противоопухолевой терапии.

Плазмонное темнопольное рассеянное изображение опухолевых клеток и клеточная TEM микроскопия

Для специфической таргетированной визуализации опухолевых клеток с DRN-GNP мы выбрали клетки HeLa как тестовую группу и клетки MCF-7 как контрольную группу. Причина в том, что клетки HeLa сверхэкспрессируют интегрины α_vβ₃, но клетки MCF-7 нет, поэтому у них нет специфического связывания RGD; это хорошая контрольная группа. Поглощение DRN-GNP этими двумя клеточными линиями после инкубации 24 ч с конечной концентрацией 35 мкг/мл оценивали вертикальной флуоресцентной микроскопией в темнопольном режиме. Клетки, обработанные без GNP, не показывали плазмонного рассеяния света (Рис. 4 A-HeLa клетки, 5C-MCF-7 клетки). Изображения клеток HeLa, обработанных DRN-GNP, показывают, что рассеянные сигналы от GNP сильно локализованы в ядре (Рис. 4b и 5e). Однако мы могли с трудом увидеть рассеянный свет от клеток MCF-7 после инкубации с DRN-GNP, даже если небольшое количество GNP могло войти в опухолевые клетки через пассивный эффект усиленной проницаемости и удержания (EPR эффект) (Рис. 4d и 5f), усиленная проницаемость и удержание (EPR) эффект — уникальное явление твердых опухолей, связанное с их анатомическими и патофизиологическими отличиями от нормальных тканей. Например, ангиогенез приводит к высокой сосудистой плотности в твердых опухолях, большие зазоры существуют между эндотелиальными клетками в опухолевых сосудах, и опухолевые ткани показывают селективную экстравазацию и удержание макромолекулярных лекарств. Поэтому они могли не быть четко детектированы под теми же экспериментальными условиями. Результаты продемонстрировали, что эндоцитоз клеток HeLa через рецептор-мединированную эндоцитозу был облегчен RGD пептидами на поверхности GNP. NLS пептиды также могли сохранить свою активность для специфического таргетирования ядра. Так что наши синтезированные DRN-GNP могли быть очень потенциальным контрастным агентом для таргетированной визуализации опухолей.

Содержимое строк перечислено следующим образом: «PBS буфер» представляет клетки инкубированные с PBS буфером, «DRN-GNP» представляет клетки инкубированные с DRN-GNP. Подстрочный индекс «1» представляет яркопольные изображения клеток, «2» представляет темнопольные изображения клеток, и «3» представляет накладывающиеся изображения (яркопольные и темнопольные) клеток. Все масштабные бары 20 мкм. Картинка E — малая область, выбранная из B₃ в Рис. 4, картинка F — малая область, выбранная из D₃ в Рис. 4, масштабные бары 10 мкм

TEM изображения DRN-GNP инкубированных в клетках HeLa и MCF-7 24 ч. A₁, A₂ и A₃ соответствуют клеткам HeLa, в то время как B₁ и B₂ соответствуют клеткам MCF-7

Таблица 2 показывает значения соотношений между средней серой плотностью клеток и фоном в том же изображении, что имеет положительную корреляцию с поглощенными количествами DRN-GNP этими двумя клеточными линиями. Соотношения клеток, инкубированных с PBS буфером и клеток MCF-7 были почти 1,0, яркость клеток была почти близка к фону. Соотношение клеток HeLa, инкубированных с DRN-GNP, было 4,80, что означает, что синтезированные DRN-GNP могли быть специфически таргетированы и вошли в опухолевые клетки, сверхэкспрессирующие интегрины α_vβ₃.

Для подтверждения рецептор-специфической интернализации DRN-GNP мы исследовали клеточное поглощение DRN-GNP клетками HeLa и MCF-7 используя TEM технику (см. Рис. 5). Большое количество DRN-GNP локализовалось в ядерных и цитоплазматических областях α_vβ₃-позитивных клеток HeLa (Рис. 5(A₁-A₃)). С другой стороны, только пренебрежимое количество частиц находилось внутри цитоплазматических областей α_vβ₃-негативных клеток MCF-7 (Рис. 5(B₁-B₂)), они могли быть накоплены в клетках MCF-7 посредством пассивного таргетирования EPR эффекта. Мы обнаружили, что были высококонтрастные черные непрерывные области в ядре клеток MCF-7; это был уранилацетат, окрашивающий ядро, и они отличались от гранулярных частиц в ядре клеток HeLa. TEM изображения согласуются с темнопольными результатами визуализации, указывая на то, что RGD и NLS пептиды на поверхности GNP облегчали таргетирование DRN-GNP ядра клеток HeLa. Так что наши синтезированные DRN-GNP могли использоваться как идеальный контрастный агент для таргетированной визуализации и диагностики опухолей.

Оценка клеточной терапевтической эффективности

Для оценки терапевтической эффективности DOX и DRN-GNP на клеточном уровне, MTT анализ сначала проводили для изучения жизнеспособности клеток HeLa и MCF-7 под лечением этих двух образцов 24 ч. DRN-GNP демонстрировали почти тот же ингибирующий эффект, убивая почти 70% клеток при той же концентрации DOX (39,0 мкг/мл, Рис. 6(A, B)). В соответствии с результатами MTT, когда концентрация DRN-GNP была 40 мкг/мл, количество и состояние клеток HeLa и MCF-7 были относительно хорошими, поэтому концентрация 35 мкг/мл была подходящей концентрацией для визуализации. Мы наблюдали, что когда концентрация DRN-GNP была высока 60 мкг/мл (Рис. 6(C₃)), клетки HeLa становились некрозом очевидно. Когда концентрация DRN-GNP поднималась до 100 мкг/мл, заметное уменьшение количества клеток можно наблюдать и четкие морфологические изменения клеток как характеристика некроза наблюдалась. Та же концентрация конъюгированного DOX все еще демонстрировала почти ту же противоопухолевую эффективность по сравнению с свободным DOX. Эти результаты указывали на то, что наши синтезированные DRN-GNP могли использоваться не только как контрастный агент, но и как хорошая система доставки лекарства.

MTT анализ использовался для качественного отображения in vitro противоопухолевой активности DOX и DRN-GNP на клетках HeLa (a) и MCF-7 (b) 24 ч (100%). Концентрации C₀-C₅ составляют 0, 20, 40, 60, 80, 100 мкг/мл для DRN-GNP; соответствующие концентрации DOX 0, 7,8, 15,6, 23,4, 31,2, 39,0 мкг/мл. Данные представлены как средние ± стандартные отклонения трипликатных образцов (n = 3). Изображения клеток HeLa инкубированных с разными концентрациями DRN-GNP (c)

Результат, детектированный потоковой цитометрией на рис. 7, также демонстрирует противоопухолевую эффективность DRN-GNP. Жизнеспособность клеток HeLa при воздействии DRN-GNP разных концентраций измерялась потоковой цитометрией на основе анализа. Два режима клеточной смерти, апоптоз и некроз, измерялись с использованием красителей AnnexinV-FITC и пропидиевого йодида (PI) соответственно (Рис. 7). Аналогично результатам MTT анализа, данные показывали, что DRN-GNP индуцировали некроз клеток в доза-зависимом режиме. Пропорция некротических клеток составляла 8% без инкубации с DRN-GNP; когда концентрация была высока 100 мкг/мл, пропорция некротических клеток была 23,84%; это означает, что наши синтезированные DRN-GNP могли эффективно убивать клетки HeLa. Разница между результатами MTT и потоковой цитометрии может быть объяснена разницей в количестве клеток и методах.

Представительные двухмерные контурные плотностные графики для определения долей живых, апоптотических и некротических клеток при воздействии DRN-GNP разных концентраций (0–100 мкг/мл) 24 ч соответственно. Клеточный некроз и апоптоз измерялись использованием PI и AnnexinV-FITC красителей

Оценка терапии DRN-GNP в мышах с опухолями

Для дальнейшего определения, индуцировали ли DRN-GNP комбинированный терапевтический эффект на опухолевые клетки in vivo, мы оценили противоопухолевой эффект DRN-GNP в мышах с опухолями для длительного внутривенного введения лекарств. Группа физиологического раствора и группы свободного DOX, DR-GNP и DN-GNP внутривенно инъецированные устанавливались как контрольные группы, в которых концентрация конъюгированного DOX была такой же, как у свободного DOX. Мы наблюдали, что размеры опухолей групп, обработанных DRN-GNP, были очевидно меньше, чем у групп, обработанных физраствором, DOX, DN-GNP и DR-GNP (Рис. 8a). Объем опухоли и масса тела мышей мониторили каждые 2 дня. Значительная вариация объема опухоли и веса опухоли среди всех обработанных групп показана на рис. 8d, f; объемы опухолей и вес опухолей групп DN-GNP и DR-GNP обработанных были меньше, чем у группы свободного DOX обработанных, но все еще больше, чем у групп DRN-GNP обработанных из-за меньшей таргетированной активности. Это может быть потому, что молекулы DOX малы, лишены таргетирования и имеют короткий полупериод в vivo; поэтому они могут быть быстро очищены. Однако DRN-GNP обладают сильной стабильностью в кровеносной системе, длинным полупериодом и высокой таргетированной способностью, поэтому они могут таргетироваться в место опухоли и затем играть противоопухолевой эффект DOX. Между DRN-GNP внутривенно инъецированными и опухольно-инъецированными группами, противоопухолевая эффективность последней группы лучше, чем первой, потому что лекарства не нуждаются в сложной системе кровообращения в очаг. Скорость ингибирования опухоли DOX менее 50%, а скорости всех DOX-конъюгированных GNP больше 50%; они могут быть высокими до 66,7% и 57,7% соответственно. Результаты H&E окраски показали, что была определенная степень повреждения органов печени в группе внутривенно инъецированных DRN-GNP (Рис. 9). Более того, био-токсичность DOX, DR-GNP и DN-GNP на мышах с опухолями также оценивали гистологическим анализом. Как показано на рис. 8b, объем опухолевых клеток физраствора группы сравнительно больше, чем у групп лечения, и опухолевые клетки демонстрируют с более митотическими фигурами. Все результаты показывали, что ингибирующий эффект DRN-GNP на опухоль был лучшим среди GNP. Таким образом, наши синтезированные DRN-GNP могли использоваться как идеальная система доставки DOX для терапии опухолей.

a Изображения опухолей, изолированных от мышей с опухолями после лечения физраствором, свободным DOX, DN-GNP, DR-GNP и DRN-GNP (опухолевая инъекция и внутривенная инъекция). b Гистологические изображения опухолей мышей после лечения физраствором, свободным DOX, DN-GNP, DR-GNP и DRN-GNP (опухолевая инъекция и внутривенная инъекция). c Масса тела, объем опухоли (d), скорость ингибирования опухоли (e) и вес опухоли (f) мышей с опухолями в течение 14 дней лечения; данные представлены как средние ± стандартные отклонения (n = 6)

Гистологические изображения основных органов (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) мышей после лечения физраствором, свободным DOX, DR-GNP, DN-GNP и DRN-GNP (опухолевая инъекция и внутривенная инъекция)

Заключение

В этом исследовании мы успешно разработали одноступенчатый метод приготовления многофункциональных DRN-GNP примерно за полчаса. GNP также успешно применялись к таргетированной визуализации опухолей и терапии опухолей как in vitro, так и in vivo. Успех показывает, что возможно полностью использовать восстановительную и стабилизирующую способность DOX, RGD пептидов и CCYNLS пептидов, что сделает процесс синтеза GNP простым и эффективным. Что более важно, одноступенчато синтезированные DRN-GNP все еще обладают хорошей коллоидной стабильностью в физиологической системе, а пептиды, конъюгированные на поверхности, сохраняли таргетирующую способность, и DOX все еще обладает своей противоопухолевой способностью. На наше знание, это первый отчет о синтезе DOX, RGD и CCYNLS пептидов конъюгированных многофункциональных GNP одноступенчатым методом и их применении в визуализации, диагностике и терапии опухолей. Эта стратегия соответствует направлению развития зеленой химии и заложит основу для крупномасштабных применений в ближайшем будущем. Мы ожидаем, что наш отчет предоставит новый путь для одноступенчатого синтеза многофункциональных наноматериалов, используемых для визуализации и терапии опухолей.

Доступность данных и материалов

Все наборы данных представлены в основной статье или в дополнительных поддерживающих файлах.

Аббревиатуры

CCYNLS пептиды:

Последовательность аминокислот: цистеин-цистеин-тирозин-пролин-пролин-лизин-лизин-лизин-аргинин-лизин-валин

Циклические RGD пептиды:

Последовательность аминокислот: аргинин-глицин-аспартат-тирозин-глутаминовая кислота

DOX:

Доксорубицин

DR-GNP:

DOX-RGD-GNP, DN-GNP: DOX-NLS-GNP, DRN-GNP: DOX-RGD-NLS GNP

GNP:

Золотые наночастицы