Многофункциональные сфокусированные ультразвуковые наночастицы с низкой интенсивностью для интеграции ультразвуковой визуализации и синергетической терапии метастатического рака молочной железы

Введение

Рак груди долгие годы преследовал женщин как одна из самых опасных злокачественных опухолей. Сообщается, что из-за высокой гетерогенности и высокой метастатической способности отдаленные метастазы рака молочной железы составляли более 90% его смертности, тогда как 5-летняя выживаемость пациентов с запущенными или метастазирующими заболеваниями составляет всего 26%, что приводит к плохой клинический исход [1,2,3]. Отрицательная характеристика рака молочной железы затрудняет полное излечение, в результате чего стратегия лечения становится более сложной как при устранении первичной опухоли, так и при удалении метастазов.

Традиционные терапевтические подходы, такие как хирургия и химиотерапия, по-прежнему считаются эффективными при лечении рака груди [4]. Среди всех химиотерапевтических препаратов доцетаксел (DTX) играет важную роль в лечении метастатического рака груди (MBC) и распространенного рака груди (ABC) [5]. Как противоопухолевый препарат первой линии, синтезируемый химическими веществами тиса, противоопухолевый эффект DTX достигается в основном за счет разрушения митоза и пролиферации клеток [6]. Благодаря своей высокой противоопухолевой эффективности DTX становится одним из наиболее эффективных химиотерапевтических агентов при лечении рака груди [7]. Однако химиотерапевтическое средство обычно вызывает нежелательные эффекты, а также токсичность для всего организма, что значительно ограничивает терапевтическую эффективность [8]. Кроме того, разные клинические стадии и различные личные состояния показывают, что один терапевтический подход может быть недостаточно эффективным, чтобы оправдать все ожидания при лечении рака груди. Следовательно, существует острая необходимость обуздать побочный токсический эффект и повысить эффективность лечения DTX в будущих требованиях к применению.

Ультразвук был впервые использован в клинической диагностике из-за его исключительных преимуществ, таких как отсутствие излучения, неинвазивность и экономическая эффективность [9, 10]. Несмотря на упомянутые выше уникальные особенности, он также привлек большое внимание в терапевтических перспективах на основе наноструктурированных материалов [11]. Первоначально сонодинамическая терапия была реализована посредством кавитации и «эффекта сонопорации», вызванного ультразвуком. Генерация АФК во время этого процесса эффективно индуцирует цитотоксичность по отношению к раковым клеткам, что приводит к быстрому повреждению ДНК и апоптозу опухолевых клеток [9]. В отличие от поверхностного использования фотодинамической терапии (PDT), SDT получает более приятный терапевтический результат при лечении глубоко расположенных опухолей с помощью сфокусированного ультразвука низкой интенсивности (LIFU), который обладает достоинствами для предотвращения нежелательных термических повреждений во время лечения [12, 13]. Соносенсибилизаторы, являющиеся одним из важнейших компонентов SDT, были исследованы в различных методах лечения опухолей [14]. Хлор е6 (Се6) первоначально использовался в качестве обычного фотосенсибилизатора, но его желаемая терапевтическая способность и отличное сродство с опухолевой тканью сделали его пригодным для применения в качестве соносенсибилизатора [15]. Ce6, играющий роль второго поколения семейства хлора, вызвал широкое внимание в лечении опухолей для его желательного поколения ROS [16]. Однако однократное нанесение Ce6 постоянно вызывает нестабильность, а также нежелательную кожную токсичность, что ограничивает обширные исследования SDT.

В последние годы развитие нанотехнологий сыграло очень важную роль во многих областях, включая биочувствительность, загрязнение окружающей среды и деградацию загрязняющих веществ [17,18,19,20,21,22,23]. Наночастицы на основе нанотехнологий имеют много преимуществ, таких как меньший диаметр, большая площадь внешней поверхности и более низкое сопротивление внутренней диффузии [24]. Ранее наночастицы использовались в различных материалах, таких как MOF [25], диоксид титана [26] и графен [21]. Быстро растущая тенденция нанотехнологий в сочетании с лечением рака также широко изучалась, что позволило создать реальный путь для продвижения комбинированной терапевтической стратегии [27]. Для реализации эффективных терапевтических применений для лечения опухолей тонко разработанные наночастицы предназначены в первую очередь для повышения эффективности транспортировки токсичного химиотерапевтического агента за счет эффекта повышенной проницаемости и удерживания (EPR), что позволяет увеличить накопление в месте опухоли [28, 29]. Кроме того, нежелательный побочный эффект можно уменьшить за счет инкапсуляции химиотерапии. Сообщалось, что перфторпентан (PFP) обладает выдающейся способностью превращаться из жидкой фазы в газовую при облучении, что может быть использовано в качестве нового ультразвукового молекулярного зонда, особенно при ультразвуковой визуализации и лечении [30]. Что еще более важно, исходная жидкая фаза позволяет легко инкапсулировать ПФП в различные материалы [31]. Кроме того, инкапсуляция PFP может значительно улучшить возможности ультразвуковой визуализации в месте опухоли в соответствии с эффектом ЭПР, упомянутым выше, и избежать ограничения размера, вызванного микропузырьками большего размера. За исключением визуализации опухолей, сочетание нескольких терапевтических подходов имеет огромное значение для лечения рака, ориентированного на наносистемы. В частности, практики, включающие интеграцию сонодинамической терапии и химиотерапии, сделали упор на революцию в традиционной терапевтической эффективности. Xu et al. [32] продемонстрировали, что благодаря SDT можно было выявить улучшенный терапевтический результат с химиотерапевтическими препаратами и, таким образом, привести к активации апоптоза опухолевых клеток, нацеленного на митохондрии. Этот шаблон демонстрирует синергетический подход, который очень важен для использования в будущем.

Здесь, с учетом вышеупомянутых идей, мы намерены использовать наночастицы «все-в-одном» (НЧ CPDP) для создания диагностической и терапевтической системы, которая реализуется с помощью синергетической терапии, ориентированной на SDT, в сочетании с химиотерапией, а также улучшенных ультразвуковая визуализация. Благодаря превосходной безопасности и идеальной метаболической стабильности в качестве желательного наноносителя, PLGA сделал его полезным для изучения различных противоопухолевых возможностей [33, 34]. Следовательно, в этой стратегии, используя PLGA в качестве материала внешнего слоя, PFP может значительно улучшить ультразвуковую визуализацию за счет своей способности сдвига фазы, запускаемой LIFU, в то время как Ce6, желательный соносенсибилизатор второго поколения, также может подвергаться воздействию LIFU, чтобы вызвать генерацию ROS. Кроме того, вместе с высвобождением DTX будут реализованы как химиотерапия, так и SDT для достижения в конечном итоге синергетической терапии. Важно отметить, что структура ядро-оболочка НЧ CPDP может вводиться стабильно, не повреждая нормальные ткани или клетки, а также позволяет наночастицам иметь относительно более высокую эффективность инкапсуляции [35]. Более того, содержимое может быть хорошо защищено в этой структуре ядро-оболочка [36,37,38], особенно для PFP, который может эффективно преобразовываться из жидкости в газ благодаря существованию структуры. Используя эту структуру ядро-оболочка, можно одновременно более стабильно продемонстрировать синергетическую стратегию. Во-первых, синергетическая стратегия помогает значительно уменьшить побочный эффект DTX за счет эффективной инкапсуляции, что имеет большое значение для облегчения страданий при лечении злокачественных и агрессивных опухолей; во-вторых, по сравнению с одиночной химиотерапией, комбинация SDT и химиотерапии была проверена как многообещающая стратегия для повышения терапевтической эффективности. В-третьих, улучшенная ультразвуковая визуализация, реализованная с помощью PFP, оптимизировала диагностическую стратегию, а также помогла проверить противоопухолевую эффективность. И последнее, но не менее важное:вся система безопасна и стабильна с отличной биосовместимостью. Подчеркивается, что в этой стратегии метастазирование в легкие, а также рост опухоли заметно подавлялись как in vitro, так и in vivo. В заключение следует отметить, что синергетическая стратегия продемонстрировала продуктивную эффективность лечения злокачественной опухоли груди и ее отдаленных метастазов, и в сочетании с возможностью ультразвуковой визуализации она может стать многообещающей стратегией лечения в дальнейшем клиническом применении.

Материалы и методы

Материалы

PLGA-COOH (Mw 12000 Да) был приобретен у Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd (Цзинань, Китай). Перфторпентан (PFP) и агароза были получены от Sigma-Aldrich Co., Ltd. (Сент-Луис, Миссури). Хлорин е6 (Се6) был приобретен в компании Melone Pharmaceutical Co., Ltd. (Далянь, Китай). Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) для анализа цитотоксичности был получен от Dojindo Molecular Technologies (Токио, Япония). Диацетат 2 ', 7'-дихлородигидрофлуоресцеина (H2DCFDA) был приобретен у MedChemExpress Co., Ltd. (Нью-Джерси, США). Иодид пропидия (PI) был получен от Solarbio Science and Technology Co. Ltd. (Пекин, Китай). Аннексин V-FITC / PI был получен от BD Biosciences (США). Доцетаксел (DTX) был приобретен в MedChemExpress Co., Ltd. (Нью-Джерси, США). Все остальные реагенты представляли собой аналитически чистые продукты без дополнительной очистки. Среда Roswell Park Memorial Institute 1640 (DMEM), фетальная бычья сыворотка и тиризин были приобретены у Gibco (ThermoFisher Scientific, США) и УФ-спектрофотометра (UV – Vis, Hitachi, Япония).

Синтез НП CPDP

Наночастицы Ce6-PFP-DTX / PLGA (НЧ CPDP) получали методом двойной эмульсии W / O / W согласно предыдущему отчету [39, 40]. Вкратце, 2 мг Ce6 сначала растворяли в 500 мкл метанола. Затем 50 мг PLGA-COOH и доцетаксела (2 мг) растворяли в 4 мл дихлорметана, а затем к нему одновременно добавляли предыдущий раствор. Затем к вышеуказанному раствору добавляли 200 мкл PFP. Как следствие, смесь запускалась ультразвуковым датчиком (Sonics &Materials Inc., США) для получения первой эмульсии (5 секунд включения и 5 секунд выключения, 3 минуты). Для получения второй эмульсии к указанной выше эмульсии добавляли 8 мл раствора поливинилового спирта (ПВС) (вес / объем =4%), используя тот же ультразвуковой датчик в течение 2 минут. После добавления 10 мл 2% изопропилового спирта в конечную эмульсию раствор механически перемешивали при комнатной температуре в течение по меньшей мере 4 ч для полного улетучивания дихлорметана. Наконец, НЧ CPDP центрифугировали три раза (12000 об / мин, 5 мин), а затем собирали и хранили при 4 ° C для дальнейшего использования. НЧ PDP были приготовлены аналогично, за исключением Ce6. Все экспериментальные процессы проводились над льдом и строго в темноте.

Характеристика NP CPDP

Размер частиц и дзета-потенциал НЧ CPDP и НЧ PDP были реализованы с помощью прибора Malvern Zetasizer Nano (Малверн, Великобритания). Морфология была охарактеризована с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) и оптической микроскопии. Для оценки стабильности НЧ CPDP растворяли в фосфатно-буферном растворе (PBS) и измеряли размеры за 7 дней соответственно. Каждый образец измеряли в трех экземплярах. Эффективность инкапсуляции NP CPDP рассчитывалась по следующей формуле:

Эффективность инкапсуляции (%) =(Вес загрузки DTX или Ce6 / Вес всего DTX или Ce6) × 100%. Чтобы проверить герметичность различных материалов, были исследованы УФ-видимые спектры различных образцов (UH5300, Hitachi). Эффективная инкапсуляция также была проанализирована с помощью ТЕМ.

Скорость высвобождения лекарства из NP CPDP

Для оценки способности Ce6 и DTX к высвобождению лекарственного средства в NP CPDP использовали два раствора с разными pH (фосфатный буферный раствор, PBS:7,4, ацетатный буферный раствор, ABS:5,6) для проверки совокупной эффективности высвобождения. Вкратце, НЧ CPDP сначала диспергировали в 1 мл PBS или ABS после того, как смесь запечатали в диализный мешок (Mw:10000); затем весь раствор переносили в стеклянную бутыль (общий объем:150 мл), в которую добавляли 149 мл PBS или ABS, чтобы поддерживать общий объем раствора на уровне 150 мл. Затем стеклянную бутылку помещали в шейкер с постоянной температурой 37 ° C, и в разные периоды времени (0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48, 72 ч) раствор собирали и немедленно добавляли тот же раствор. объем средний. Каждую группу повторяли трижды. Наконец, концентрации Ce6 и DTX были измерены с помощью Synergy Hybrid Multi-Mode Read (BioTek, США) при 403 и 229 нм соответственно, и была рассчитана скорость высвобождения лекарства в каждый момент времени.

Ультразвуковая визуализация in vitro

Чтобы исследовать ультразвуковые возможности НЧ CPDP, эмульсия (1 мг / мл) сначала запускалась с помощью низкоинтенсивного сфокусированного ультразвукового преобразователя (LIFU) (Ronghai Ultrasonic Medical Engineering Research Center, Chongqing, China), и проводилась диаграмма направленности. установлен как коэффициент заполнения 50%, длительность импульса 1 с при различной интенсивности (1–2 Вт / см ² ) для разного времени. Для ультразвуковой визуализации облученные NP CPDP были добавлены в ранее подготовленную модель агарозы, соответственно, с использованием ультразвукового диагностического прибора Philips EPIQ5 (частота зонда:12 МГц, MI:0,06) для наблюдения как 2D, так и CEUS-визуализации NP CPDP. Между тем, для анализа значения оттенков серого в каждой группе было применено программное обеспечение ImageJ.

Клеточное поглощение и создание ROS NP CPDP in vitro с помощью LIFU-облучения

Клеточная линия рака молочной железы мыши 4T1 была получена из Шанхайского банка клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай) и инкубирована в среде RPMI 1640, смешанной с 10% FBS и 1% стрептомицином / пенициллином при 37 ° C в 5% CO. ₂ увлажненный инкубатор.

Клетки 4T1 сначала инкубировали в предыдущих условиях при плотности 1 × 10 ⁴ . клеток на чашку для тестирования клеточного поглощения с использованием CLSM в разные интервалы времени (1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч). Для проверки генерации АФК клетки были разделены на следующие 5 групп:контроль, НП CPDP, LIFU, Ce6 + LIFU, НП CPDP + LIFU. После 24-часового традиционного культивирования среду заменяли NPDP CPDP (200 мкл, 0,8 мг / мл) или раствором Ce6 (200 мкл), соответственно, и клетки совместно инкубировали в течение еще 3 часов. Затем облучение LIFU (2 Вт / см ² , 120 с) проводилось соответственно по разным группам. После совместной инкубации и обработки LIFU добавляли 100 мкл разбавленного раствора DCFH-DA, и каждую группу культивировали в предыдущем инкубаторе в течение 15 мин. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) использовался для подтверждения результата образования активных форм кислорода, и соответствующие интенсивности флуоресценции были измерены с помощью программного обеспечения ImageJ.

Цитотоксичность in vitro и возможность согласованного лечения НЧ CPDP

Анализ CCK-8 применяли для оценки цитотоксичности НЧ CPDP. Вкратце, клетки рака молочной железы мыши 4T1 инкубировали в 96-луночном планшете с плотностью 1 × 10 ⁴ за скважину на 24 ч. Затем НЧ CPDP разбавляли бессывороточной средой RPMI 1640 при различных концентрациях (0,0,2,0,4,0,6,0,8 мг / мл, n =3), с облучением LIFU или без него (2 Вт / см ² , 120 с). Еще через 24 часа совместного культивирования оценили жизнеспособность клеток 4T1.

Чтобы оценить эффективность апоптоза клеток при согласованном лечении, клетки 4T1 совместно культивировали, как и ранее, в течение 24 часов, а затем разделили на пять следующих групп:(1) контрольная (без каких-либо обработок), (2) LIFU (только с воздействием LIFU при 2 Вт / см ² ), (3) НЧ CPDP (только с раствором НЧ CPDP при 0,8 мг / мл), (4) НЧ PDP + LIFU и (5) НЧ CPDP + LIFU. После совмещения различных наночастиц (200 мкл) и воздействия LIFU каждую группу обрабатывали двойным окрашиванием аннексином V (5 мкл) и пропидия иодидом (5 мкл) в течение 20 минут и анализировали с помощью протокола проточной цитометрии.

Ингибирование клеточных метастазов in vitro

Для исследования ингибирования метастатической способности клеток были разработаны анализ заживления ран и анализ трансвелл. Для анализа заживления ран клетки 4T1 культивировали обычным образом, как и ранее, в 6-луночном планшете. После роста клеток до 80% слияния кончик пипетки (10 мкл) наносили для нанесения искусственной царапины по центру 6-луночного планшета. Затем клетки обрабатывали в тех же группах, упомянутых выше. После непрерывной совместимости в течение 24 часов клетки промывали 3 раза PBS и наблюдали под оптической микроскопией (Olympus, Япония).

Для анализа через лунки верхний отсек камеры трансвелл (Corning, Сан-Диего, США) в первую очередь использовался для имитации внеклеточного матрикса in vivo. 4T1 клетки с плотностью 1 × 10 ⁵ клетки на лунку высевали в верхнюю камеру в бессывороточной среде RPMI 1640, а нижний отсек заполняли полной культуральной средой, смешанной с 10% FBS. Затем клетки разделяли так же, как и указанные выше группы, и обрабатывали в течение 24 часов соответственно. После этого клетки нижней поверхности фиксировали параформальдегидом и окрашивали кристаллическим фиолетовым. Результаты наблюдались с помощью световой микроскопии (Olympus, Япония).

Ультразвуковая визуализация in vivo

Здоровых самок мышей BALB / c (4 недели) и мышей Kunming (4 недели) получали из Центра лабораторных животных Медицинского университета Нинся. Все эксперименты на животных проводились в соответствии с инструкциями, утвержденными Комитетом по этике защиты животных Медицинского университета Нинся. Для создания модели мышей, несущих опухоль, мышей BALB / c инокулировали клетками рака груди 4T1 (1 × 10 ⁷ / мл) на правом фланге. После того, как размер опухоли вырос до 60–80 мм ³ , Мышам BALB / c вводили НЧ CPDP (200 мкл, 1 мг / мл) через хвостовую вену внутривенно. Через 24 часа участки опухоли у мышей анализировали с помощью LIFU (2 Вт / см ² , 120 с), а затем были получены изображения 2D и CEUS с помощью упомянутого ранее ультразвукового диагностического прибора Philips EPIQ5. Анализ оттенков серого проводился с помощью программного обеспечения ImageJ.

Синергетическая терапевтическая эффективность НЧ CPDP in vivo

После инокуляции раковых клеток 4T1 размер опухоли регистрировали каждые два дня, и объем опухоли рассчитывали по формуле:Объем =1/2 × Длина × Ширина ² . Размер опухоли и массу тела мышей регистрировали каждые 2 дня, а изображения роста опухоли - каждые 3 дня. Когда объем опухоли достигал 60–80 мм ³ , мышей с аналогичным размером опухоли были случайным образом разделены на те же пять групп:контрольная, LIFU, CPDP NP, PDP + LIFU и CPDP NPs + LIFU ( n =3). Каждой группе внутривенно вводили различные NP (200 мкл) через хвостовую вену, за исключением контрольной группы (вместо этого 200 мкл PBS). Двадцать четыре часа спустя участок опухоли подвергали облучению LIFU (2 Вт / см ² ) на 120 с. Полное введение SDT повторялось каждые 3 дня и длилось 18 дней. У мышей измеряли и рассчитывали массу тела и объем опухоли. После лечения мышей умерщвляли, а ткани опухоли отправляли в H&E, TUNEL и PCNA для дальнейшего гистологического анализа.

Биобезопасность NPs CPDP in vivo

Чтобы исследовать биобезопасность наночастиц CPDP in vivo, здоровые самки мышей Kunming ( n =3) были разделены на следующие 4 группы:контроль, 5 мг / мл, 10 мг / мл и 20 мг / мл. НЧ CPDP (200 мкл) вводили через хвостовую вену мыши; затем у мышей был свободный доступ к пище и воде без какого-либо дальнейшего введения. Вес мышей измеряли каждые 2 дня. Через 30 дней мышей забивали и собирали образцы крови для анализа клеток крови и биохимии. Основные органы (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) были собраны и исследованы на окрашивание H&E соответственно.

Ингибирование метастазов в легких in vivo

Чтобы оценить подавление метастазов в легких в каждой группе, весь процесс проводился путем наблюдения за количеством метастатических узелков в легких, а также гистологической оценки окрашивания H&E. После того, как все мыши были умерщвлены, легочные ткани были удалены и зафиксированы; затем были сделаны фотографии раковых узелков и ткани легких были дополнительно проанализированы с окрашиванием H&E.

Статистический анализ

Все данные измерений были выполнены 3 раза и выражены как среднее ± стандартное отклонение (SD) и проанализированы с помощью однофакторного дисперсионного анализа или стандартного критерия Стьюдента t тестировать с помощью программного обеспечения SPSS (версия:19.0), а p значение <0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Характеристика НЧ CPDP и эффективности высвобождения лекарств

Метод двойной эмульсии применялся при изготовлении NP CPDP, которые одновременно инкапсулировали материал PFP с фазовым сдвигом, соносенсибилизатор Ce6 и химиопрепарат DTX. При диспергировании в PBS или деионизированной воде раствор имел светло-серый цвет. НЧ CPDP демонстрируют однородную сферическую форму и четкую структуру ядро-оболочка, наблюдаемые с помощью оптической микроскопии или просвечивающей электронной микроскопии (рис. 1a, b). Средние диаметры НЧ CPDP и НЧ PDP составляли 249,5 ± 77,46 нм и 246,6 ± 81,01 нм, а средние поверхностные дзета-потенциалы составляли -18,47 ± 0,55 мВ и -3,987 ± 0,66 мВ, соответственно (рис. 1c, d). Размер НП CPDP гарантировал, что он может накапливаться в опухолевом участке пассивно за счет эффекта ЭПР [40]. Различный заряд между НЧ CPDP и НЧ PDP в основном обусловлен отрицательно заряженным Ce6 [41]. Кроме того, отрицательный дзета-потенциал НЧ CPDP указывает на более низкую адсорбцию белков плазмы, что подтверждает относительную стабильность наночастиц. Распределение частиц по размерам сохранялось в диапазоне от 249,5 до 385,1 нм в течение 7 дней (рис. 1e), что демонстрирует относительную стабильность НЧ CPDP. Согласно стандартной кривой эффективность инкапсуляции DTX и Ce6 составила 83,84 ± 1,39% и 60,54 ± 3,79% соответственно.

а ТЕМ (шкала:500 нм) и b Изображение НЧ CPDP под световым микроскопом (масштабная линейка:20 мкм). c Распределение размеров и d дзета-потенциал НЧ PDP и НЧ CPDP. е Распределение НП CPDP по размеру в течение 7 дней. е Скорость высвобождения Ce6 и г скорость высвобождения DTX в различных условиях (pH 7,4 и pH 5,6, n =3). ч УФ – видимый спектр наночастиц Ce6, DTX, PFP / PLGA и CPDP соответственно. Стрелки НЧ CPDP показывают характерные пики Ce6 и DTX, что указывает на эффективную инкапсуляцию обоих материалов. я Результаты ПЭМ двух наночастиц. Наночастица PFP / PLGA имеет тонкую оболочку и круглое ядро ​​(слева). Наночастица CPDP, инкапсулированная как Ce6, так и DTX, показывает гораздо более толстую оболочку и ядро ​​овальной формы (справа)

Поскольку эффективность высвобождения лекарственного средства Ce6 и DTX из НЧ CPDP указана на рис. 1f, g, почти двукратное увеличение индекса высвобождения DTX было зарегистрировано при pH 5,5 по сравнению с наночастицами, растворенными при pH 7,4, что указывает на разумное высвобождение лекарственного средства. Скорость DTX может быть эффективно достигнута в кислой микросреде опухоли. Вышеуказанные результаты во всех представленных тонко сконструированных NP CPDP могут обеспечивать устойчивое и своевременное высвобождение химиотерапевтического лекарственного средства в кислой среде опухоли, а также принципиально желательны для подготовки к SDT.

В УФ-видимой области DTX и Ce6 показали уникальные пики поглощения при 229 нм и 403 нм, соответственно, и, наоборот, PFP / PLGA не показал ни одного из пиков. Следует отметить, что спектр наночастиц CPDP демонстрирует аналогичные пики как вблизи двух вышеупомянутых длин волн, тогда как остальные демонстрируют ту же тенденцию в спектре PFP / PLGA, что указывает на успешную инкапсуляцию различных материалов (рис. 1h). Для дополнительной проверки эффективной инкапсуляции на рис. 1i указано, что наночастица PFP / PLGA имеет гораздо более тонкую оболочку и круглое ядро, в то время как наночастица CPDP показывает относительно более толстую оболочку и ядро ​​овальной формы из-за инкапсуляции как DTX, так и Ce6.

Ультразвуковая визуализация in vitro

Подчеркивается, что PFP обладает отличной способностью сдвигать фазу. Преобразование жидкости в газ не только способствует агрегации наночастиц в очаге опухоли, но также дает право на повышение эффективности ультразвуковой визуализации [42]. Чтобы продемонстрировать это, облучение LIFU было применено в качестве триггера для индукции фазового превращения PFP, а именно эффекта акустического испарения капель (ADV) [43]. Результаты показали, что интенсивность оттенков серого поддерживалась на относительно низком уровне до облучения LIFU, в то время как после увеличения интенсивности и времени облучения LIFU была выявлена ​​тенденция к усилению ультразвуковой визуализации как в 2D, так и в CEUS (рис. 2a). Акустический анализ ImageJ еще раз подтвердил результат за счет повышенного значения оттенков серого (рис. 2b, c), что согласуется с результатами визуализации. Следует отметить, что наиболее значительный результат 2D и CEUS был получен, когда интенсивность LIFU достигла 2 Вт / см ² и длилась 120 с. Приведенные выше результаты продемонстрировали, что PFP был успешно инкапсулирован в NP CPDP, и возможности ультразвуковой визуализации значительно улучшились при более высокой интенсивности, а также при более продолжительном времени введения LIFU.

а Ультразвуковые изображения 2D и CEUS при разной интенсивности LIFU и продолжительности. б Соответствующая интенсивность оттенков серого при разной интенсивности и времени 2D-изображения и c Визуализация CEUS (** p <0,01, n =3)

Клеточное поглощение и генерация ROS CPDP NPs in vitro с помощью LIFU-облучения

Как показывает результат CLSM на рис. 3, поглощение клетками NPDP CPDP проявляет повышенную тенденцию в различные интервалы времени, достигая наиболее значительной агрегации при 8-часовом совпадении.

Поглощение НЧ CPDP клетками 4T1 в течение различных интервалов времени (синий:окрашенные DAPI клетки 4T1. Красный:меченные DiR НЧ CPDP, масштабная линейка составляет 50 мкм)

Основная стратегия сонодинамической терапии (SDT) - это генерация ROS - серии продуктов одноэлектронного восстановления - для индукции апоптоза раковых клеток и подавления пролиферации клеток [44]. Подчеркивается, что под воздействием ультразвука соносенсибилизатор склонен запускать продукцию ROS; Между тем, в течение всего процесса будет высвобождаться значительное количество энергии [45]. Учитывая, что и ультразвук, и соносенсибилизатор являются незаменимыми элементами для продвижения SDT, следовательно, внутриклеточная генерация ROS была разработана и проанализирована для исследования различий между разделенными группами. Согласно фиг. 4a, количество ROS, генерированное группой облучения свободным Ce6 плюс LIFU, было незначительным, что может быть связано с тем, что быстрый метаболизм свободного Ce6 приводит к неудовлетворительному производству ROS. Напротив, наибольшая интенсивность флуоресценции была обнаружена в группе НЧ CPDP + LIFU. Предполагалось, что инкапсулированный Ce6 был хорошо защищен и, таким образом, не подвергался метаболизму. Как следствие, после стимуляции LIFU, Ce6 высвобождался, чтобы производить обильные АФК. Для сравнения, в других группах не было обнаружено значимых флуоресцентных сигналов (рис. 4b).

а Изображения CLSM генерации ROS с различными обработками и b соответствующий анализ интенсивности ФЛ (**** p <0,0001, n =3). Масштабная линейка составляет 50 мкм

Цитотоксичность in vitro и возможность согласованного лечения НЧ CPDP

Анализ Cell Counting Kit-8 (CCK-8) был введен для тестирования цитотоксичности in vitro NP CPDP. В связи с этим были созданы разные группы с облучением LIFU в разных концентрациях или без него. Результаты показали, что после 24-часовой совместной инкубации без воздействия LIFU не было очевидного влияния на выживаемость НЧ CPDP даже при самой высокой концентрации (0,8 мг / мл), что свидетельствует о желаемой биобезопасности НЧ CPDP (рис. 5а). Напротив, он показал резкое снижение жизнеспособности клеток после облучения LIFU, показывая, что комбинация NP CPDP и LIFU заметно вызвала гибель клеток 4T1, что согласуется с генерацией ROS in vitro.

а Relative cell viability with or without LIFU irradiation under different CPDP NPs concentrations. б 4T1 tumor cell apoptosis and necrosis by flow cytometry assay and c the data of corresponding necrosis and apoptosis rate analysis (****p  < 0.0001, ***p  < 0.001, n =3)

To further evaluate SDT efficacy, a flow cytometry assay was introduced. As the results shown in Fig. 5b, c, the index of cell necrosis and apoptosis was highest observed in CPDP NPs + LIFU group, while other groups showed no obvious and necrosis and apoptosis. Notably, the necrosis and apoptosis rate of CPDP NPs + LIFU group was threefold higher than that of CPDP NPs only group, which ensured the significant tumor cell death efficiency of SDT from another respect. Intriguingly, compared with PDP NPs + LIFU group, cell necrosis and apoptosis rate in CPDP NPs + LIFU group was significantly increased, exhibiting the synergistic therapy efficiency of SDT and chemotherapy.

In Vitro Inhibition of Cell Metastasis

The invasive and migration capability of tumor cells are indispensable in tumor progression [46, 47]. As shown in Fig. 6a, the closure between the physical gap of CPDP NPs + LIFU group was significantly wider than other groups, indicating a relatively slower speed of migrating efficiency. According to the ImageJ software analysis (Fig. 6c), the migration rate of CPDP NPs + LIFU group was also remarkably reduced compared with other groups.

а The wound healing and b The transwell assay after various treatments. c The corresponding migration rate of wound-healing assay. г The corresponding migration number of tranwell assay (****p  < 0.0001, n =3)

Similarly in the transwell assay, compared with the swift migration speed of other groups, CPDP NPs + LIFU group revealed a significant reduction of cell number (Fig. 6b), which demonstrated an excellent anti-migration capability of the synergistic therapy. Specifically, with the absence of SDT (CPDP NPs only and LIFU only group), the number of tumor cells was mildly decreased (Fig. 6d). On the whole, due to the combination of SDT as well as chemotherapy, metastasis of 4T1 cells has been remarkably inhibited in vitro.

In Vivo Ultrasound Imaging

Since PFP was encapsulated in CPDP NPs, it is also necessary to evaluate the characteristic ultrasound imaging capability in vivo. After the injection via the tail vein of CPDP NPs, LIFU was then applied to the tumor site to acquire both 2D and CEUS imaging (Fig. 7a). The clear graphic difference between the two groups indicated that after LIFU irradiation, the corresponding intensity of CPDP NPs was elevated obviously compared with the pre-irradiation group. Further data of the average echo intensity also confirmed this result, which was also consistent with the in vitro imaging result previously (Fig. 7b, c).

а 2D and CEUS images with and without LIFU irradiation. б , c The corresponding grayscale intensity analysis measured by ImageJ (**p <0,01, * p  < 0.05, n =3)

In Vivo Synergistic Therapeutic Efficiency of CPDP NPs

Seeing from Fig. 8a, b, the tumor volume of CPDP NPs + LIFU group was significantly smaller after 18 days of treatment than that of other groups, which may attribute to the effectiveness of ROS originated from SDT treatment as well as chemotherapy to exert a valid synergistic therapy efficiency. Similarly, photographs of mice-bearing tumors (Fig. 8a) also showed the same trend, verifying the cooperative treating efficacy of CPDP NPs triggered by LIFU exposure. Furthermore, there was no obvious weight reduction of mice between different groups (Fig. 8c). The results above all indicated a much higher inhibition rate of CPDP NPs + LIFU group, revealing that the synergistic therapy could significantly prevent tumor growth.

а Images of tumor-bearing mice under various treatments within the certain 18 days (n =3). б Tumor volume analysis according to various treatments (**p <0,01). c Weights of tumor-bearing mice under various treatments (ns no significance, n =3). г H&E, PCNA and TUNEL results under various treatments (scale bar:200 μm). е  Analysis of PCNA proliferation index of tumors under various treatments. f Analysis of TUNEL apoptotic index of tumors under various treatments (****p <0.0001, n =3)

To further testify the therapeutic results of all groups, both H&E, PCNA, and TUNEL staining were utilized (Fig. 8d). The proliferate rate of PCNA in CPDP NPs + LIFU group was only 20.50%, which was fourfold lower than control group, threefold lower than LIFU and CPDP NPs only group and twofold lower than PDP + LIFU group, respectively, demonstrating a significant anti-tumor proliferation rate (Fig. 8e). As it is shown in Fig. 8d, f, the TUNEL results indicated CPDP NPs + LIFU group exhibited an obvious apoptosis index of 72.86%, which was much higher than control (9.66%), LIFU (12.86%), CPDP NPs (19.59%), and PDP NPs + LIFU (37.06%) group. The results above all demonstrated the effectiveness of synergistic therapy exerted in vivo, which was also proved consistent with the previous in vitro results.

Biosafety of CPDP NPs In Vivo

Despite the effective therapeutic outcome, it is of great importance to explore the biosafety of the novel established nanoparticles as well. On behalf of the safe distribution of CPDP NPs in vivo, the metabolic safety was conducted. The results showed that instead of apparent body weight loss, the mice body weight elevated gradually in all the groups of mice (Fig. 9a), which indicated a negligible negative influence of CPDP NPs. In addition, as various organs and the blood samples exhibited in Fig. 9b, no significant changes were observed in blood cell, biochemistry analysis index, and H&E staining (Fig. 9c) among different treating groups, indicating the excellent biosafety of CPDP NPs in vivo.

а The weights of healthy Kunming mice under various concentrations of CPDP NPs (n =3). б The blood biochemistry and blood routine examination under various concentrations of CPDP NPs within a certain period of 30 days (n =3). c H&E results of different organs (heart, liver, spleen, lung, and kidney) of mice under the same treatment (scale bar:50 μm)

In vivo Inhibition of Lung Metastasis

It is well established that the lung is the main target organ for distant metastasis of breast cancer [48]. In order to evaluate the suppressing efficiency of metastasis, lung tissues of mice were utilized for anti-metastatic investigation. As seen from Fig. 10a, b, compared with control, LIFU, CPDP NPs, and PDP + LIFU group, the CPDP NPs + LIFU group exhibited the most remarkable decrease of lung nodules, which suggested its desirable lung metastatic inhibition efficiency. A similar trend of decreasing also further indicated by H&E staining (Fig. 10c), which in all demonstrated this synergistic therapy strategy could exert effective effort in eliminating lung metastasis in mice.

а Images of the general appearances of lung tissues. б The analysis of the metastatic lung nodules between various treatments (**p  < 0.01, n =3). c Corresponding images of lung metastatic H&E staining results (scale bar:50 μm)

Discussion

It has been greatly acknowledged that the metastasis of breast cancer will extensively influence its poor prognosis [3, 49]. As a desirable therapeutic approach, SDT may serve for its high efficiency and deep penetrating capability has been extensively convinced [11, 50]. Admittedly, since certain limitations exist in the single application of sonosensitizers, using SDT alone may still be less sufficient in further cancer exploration. The development of nanotechnology combined with clinical medicine has been promoted significantly in recent years, owning to the inspiring merits such as negligible toxicity, none invasiveness, and excellent biocompatibility. Using this novel approach, researchers have made many efforts in exploring multifunctional therapeutic strategies to enhance antitumor efficiency.

The biosafety is the priority of nano-agents. As a widely accepted material approved by the Food and Drug Administration (FDA) certification, it is highlighted that PLGA could be performed as a desirable carrier in application [51, 52]. Based on its advantages, we established a nano-system to realize multifunctional therapy efficiency, exploiting PLGA as the outer structure to encapsulate sonosensitizer Ce6, phase-shift material PFP and chemotherapeutic agent DTX. The CPDP nanoparticles (CPDP NPs) were primarily observed by the core–shell structure and appropriate size so that a desirable aggregation through the EPR effect could be achieved. The cell viability of CPDP NPs has been proved to be above 80% after 24-h coincubation, indicating the well safety of this nanoplatform. Besides, the phase transformation of encapsulated PFP has also guaranteed CPDP NPs as a contrast-enhanced agent when activated by LIFU. The enhanced ultrasound imaging capability will not only ensure the ideal therapeutic window but also promote the promising future for CPDP NPs to realize an integration of accurate diagnosis and precise treatment.

The key strategy in SDT is the generation of ROS. Compared with the single employment of Ce6, the encapsulated Ce6 in PLGA exerted a desirable protection, which could be verified by the ROS result. In our study, there was only a negligible amount of ROS generated by single use of Ce6, while nanoparticle-encapsulated Ce6 produced a considerable amount of ROS, which was further proved by SDT efficiency. The result indicated that ROS generation was preserved by the encapsulated Ce6 in CPDP NPs, which could lay a firm foundation for later tumor inhibition. Besides, the drug-releasing rate showed even at pH 5.5, little Ce6 was released from nanoparticles, demonstrating a well protection of sonosensitizer by PLGA, which was further proved by the ROS production and SDT outcome with high efficiency. Interestingly, the drug-releasing efficiency of DTX and Ce6 at pH 5.5 was quite different according to the results (more than 40% and around 20%, respectively), which may possibly cause by the diverse encapsulation efficiency of the two drugs. The minor releasing rate of Ce6 demonstrated that it could be effectively protected in PLGA so that substantial ROS generation through LIFU stimulation could be reached to get a more convinced SDT efficiency. Another reason for this difference may be due to the different solvents of the two drugs during the preparation process. Specifically, DTX and PLGA were directly dissolved in dichloromethane, while Ce6 needed to be first dissolved in methanol and then added dropwise to dichloromethane, due to its poor solubility in the latter [53]. Since drug release in nanoparticles is directly related to the effectiveness of subsequent combination therapy, the assessment of drug-releasing rate as well as ROS generation result has mutually proved this point. Current researches have suggested that using chemotherapy alone may not significantly reverse tumor progression [41]. In this study, the nanoplatform we designed demonstrated strong evidence that compared with the single employment of chemotherapy, the synergistic treatment has remarkably elevated therapeutic efficiency both in vitro and in vivo. Since LIFU stimulation optimized the therapeutic strategy, an increased cell apoptosis rate was remarkably elevated. It is worth noting that due to this synergistic strategy, lung metastasis could be significantly inhibited both at tumor cell level and inoculated mice model, which is consistent with previous reports [16, 52].

Conclusion

In conclusion, the safe and stable CPDP NPs we designed and prepared plus LIFU irradiation could remarkably eliminate breast tumor progression and its lung metastasis. With an enhanced imaging capability, this nanoplatform was also considered to be a promising contrast-enhanced agent in clinical. Hence, the novel synergistic strategy combined with LIFU might be considered as an effective treating application to reverse the poor outcome of metastatic breast cancer.

Сокращения

LIFU:

Сфокусированный ультразвук низкой интенсивности

SDT:

Sonodynamic therapy

PFP:

Перфторпентан

EPR:

Enhanced permeability and retention effect

DCFH-DA:

Dichlorodihydrofluorescein diacetate

PI:

Propidium iodide

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

ROS:

Активные формы кислорода

Ce6:

Chlorin e6

DTX:

Docetaxel

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CPDP NPs:

Ce6/PFP/DTX/PLGA nanoparticles

PDP NPs:

PFP/DTX/PLGA nanoparticles