Ультразвуково-усиленные многофункциональные наночастицы: новая платформа для визуализации и синергетической терапии метастатического рака груди

Аннотация

Метастазирование рака груди считается негативно влияющим на прогноз заболевания. Благодаря замечательным характеристикам глубокого проникновения и неинвазивности, сонидинамическая терапия (SDT) демонстрирует целый ряд потенциалов для лечения рака. Для преодоления ограничений монотерапии исследуется многофункциональная наноплатформа для реализации синергетической терапевтической эффективности. В данной работе создана новая многофункциональная наносистема, инкапсулирующая хлорин e6 (Ce6, для SDT), перфторпентан (PFP, для ультразвуковой визуализации) и докetakсeл (DTX, для химиотерапии) в хорошо спроектированной структуре ядро-оболочка на основе PLGA. Синергетические наночастицы Ce6/PFP/DTX/PLGA (CPDP NPs), обладающие отличной биосовместимостью и стабильностью, в первую очередь обеспечивают их дальнейшее применение. При облучении низкоинтенсивным сфокусированным ультразвуком (LIFU) усиленная ультразвуковая визуализация демонстрируется как in vitro, так и in vivo. Что более важно, в сочетании с LIFU наночастицы проявляют интригующую противоопухолевую способность через цитотоксические реактивные формы кислорода, индуцируемые Ce6, а также высвобождение DTX для генерации совместной терапевтической эффективности. Кроме того, данная лечебная стратегия активирует мощную антиметастатическую способность, за счет чего количество метастатических узлов в легких значительно снижено. Результаты указывают на то, что SDT-ориентированная наноплатформа в сочетании с химиотерапией может быть представлена как перспективный подход для повышения эффективной синергетической терапии и подавления легких метастазов рака груди.

Введение

Рак груди уже много лет преследует женщин как одна из самых угрожающих злокачественных опухолей. Из-за высокой гетерогенности и высокой метастатической способности сообщается, что дальние метастазы рака груди составляют более 90% смертности, тогда как 5-летний выживаемость пациентов с продвинутыми или метастатическими формами составляет всего 26%, что приводит к плохому клиническому исходу [1-3]. Негативная характеристика рака груди делает его трудным для полного излечения, заставляя лечебную стратегию быть более сложной для устранения как первичной опухоли, так и дальних метастазов.

Традиционные терапевтические подходы, такие как хирургия и химиотерапия, по-прежнему считаются эффективными при лечении рака груди [4]. Среди всех химиотерапевтических препаратов докetakсeл (DTX) играет значительную роль в лечении метастатического рака груди (MBC) и продвинутого рака груди (ABC) [5]. Как антиопухолевый препарат первой линии, синтезированный из химических веществ тисового дерева, антиопухолевой эффект DTX в основном достигается за счет разрушения митоза и клеточной пролиферации [6]. Благодаря своей обширной противоопухолевой эффективности DTX становится одним из самых эффективных химиотерапевтических агентов при лечении рака груди [7]. Однако химиотерапевтический агент обычно вызывает нежелательные эффекты и системную токсичность, что сильно ограничивает терапевтическую эффективность [8]. Кроме того, различные клинические стадии и индивидуальные условия показывают, что единственный терапевтический подход может быть недостаточно эффективен для удовлетворения всех ожиданий в лечении рака груди. Следовательно, существует острая необходимость снизить токсичные побочные эффекты и повысить терапевтическую эффективность DTX в будущих прикладных требованиях.

Ультразвук впервые был изучен в клинической диагностике благодаря своим выдающимся преимуществам, таким как отсутствие излучения, неинвазивность и стоимость-эффективность [9, 10]. Несмотря на уникальные особенности, упомянутые выше, он также привлек много внимания в терапевтических перспективах на основе наноструктурированных материалов [11]. Сонидинамическая терапия была первоначально реализована путем кавитации и «эффекта сонопорации», запускаемых ультразвуком. Генерация РФК в этом процессе индуцирует цитотоксичность по отношению к раковым клеткам, приводя к быстрому повреждению ДНК и апоптозу опухолевых клеток [9]. В отличие от поверхностного применения фотодинамической терапии (PDT), SDT дает более приятный терапевтический результат при лечении глубокозалегших опухолей с помощью низкоинтенсивного сфокусированного ультразвука (LIFU), который обладает достоинствами для предотвращения нежелательного теплового повреждения во время лечения [12, 13]. Как одно из основных средств в SDT, сонически чувствительные вещества изучались в различных терапиях опухолей [14]. Хлорин e6 (Ce6) изначально использовался как обычный фотосенсибилизатор, но его желательная терапевтическая способность и отличная аффинность к опухолевой ткани сделали его пригодным для применения в качестве сонически чувствительного вещества [15]. Являясь вторым поколением хлоринового семейства, Ce6 привлекло широкое внимание в лечении опухолей за желательную генерацию РФК [16]. Однако единичное применение Ce6 постоянно вызывает нестабильность и нежелательную кожную токсичность, что все ограничивает широкое исследование SDT.

В последние годы развитие нанотехнологий сыграло очень важную роль во многих областях, включая биосенсирование, загрязнение окружающей среды и деградацию загрязнителей [17-23]. Наночастицы на основе нанотехнологий имеют много преимуществ, таких как меньший диаметр, большая внешняя площадь поверхности и меньшее внутреннее диффузионное сопротивление [24]. Ранее наночастицы участвовали в применении различных материалов, таких как MOF [25], диоксид титана [26] и графен [21]. Быстро растущий тренд нанотехнологий в сочетании с лечением рака также широко изучался, проложив возможный путь к продвижению комбинированной терапевтической стратегии [27]. Для реализации эффективных терапевтических приложений к опухолям тонко спроектированные наночастицы в первую очередь устанавливаются для улучшения транспортировки токсичного химиотерапевтического агента через эффект усиленной проницаемости и удержания (EPR), обеспечивая увеличенное накопление в месте опухоли [28, 29]. Кроме того, нежелательные побочные эффекты также могут быть снижены через инкапсуляцию химиотерапии. Сообщалось, что перфторпентан (PFP) обладает выдающейся способностью трансформироваться из жидкой фазы в газообразную под облучением, что может применяться как новый ультразвуковой молекулярный зонд, особенно в ультразвуковой визуализации и лечении [30]. Что более важно, начальная жидкая фаза позволяет PFP легко инкапсулироваться в различные материалы [31]. Кроме того, инкапсуляция PFP может значительно улучшить способность ультразвуковой визуализации в месте опухоли согласно упомянутому выше эффекту EPR и избежать ограничений по размеру, возникающих из-за более крупных микрометровых микропузырей. Помимо визуализации опухолей, комбинация множественных терапевтических подходов представляет огромную ценность в наносистемно-ориентированном лечении рака. Конкретно, практики, включающие интеграцию сонидинамической терапии и химиотерапии, делают акцент на революционизации традиционных терапевтических эффективностей. Xu et al. [32] продемонстрировали, что благодаря SDT усиленный терапевтический результат может быть раскрыт с химиотерапевтическими препаратами и, таким образом, привести к активации митохондриально-таргетированной апоптоза опухолевых клеток. Этот паттерн раскрывает синергетическую терапию, которая вызывает высокую озабоченность в будущем использовании.

В данной работе, вдохновленные вышеизложенным, мы намерены применить все-в-одном наночастицы (CPDP NPs) для создания диагностико-терапевтической системы, реализуемой через SDT-ориентированную синергетическую терапию в сочетании с химиотерапией, а также усиленную ультразвуковую визуализацию. Благодаря отличной безопасности и идеальной метаболической стабильности как желательного наноносителя, PLGA сделала его благоприятным для исследования различных противоопухолевых способностей [33, 34]. Поэтому в этой стратегии, используя PLGA как материал внешнего слоя, PFP может значительно усилить ультразвуковую визуализацию через свою способность к фазовому переходу, запускаемую LIFU, в то время как Ce6, желательное сонически чувствительное вещество второго поколения, также может быть подвергнуто LIFU для индукции генерации РФК. Кроме того, сопровождаясь высвобождением DTX, и химиотерапия, и SDT будут реализованы для достижения синергетической терапии в конечном счете. Важно, что структура ядро-оболочка CPDP NPs может вводиться стабильно без повреждения нормальных тканей или клеток и также обеспечивает наночастицам относительно более высокую эффективность инкапсуляции [35]. Более того, содержимое может быть хорошо защищено в этой структуре ядро-оболочка [36-38], особенно для PFP, который может быть эффективно преобразован из жидкого в газ из-за существования структуры. Используя эту структуру ядро-оболочка, синергетическая стратегия может быть одновременно продемонстрирована более стабильным способом. Во-первых, синергетическая стратегия помогает значительно снизить побочный эффект DTX за счет эффективной инкапсуляции, что имеет большое значение для облегчения страданий при лечении злокачественных и агрессивных опухолей; во-вторых, по сравнению с отдельной химиотерапией, комбинация SDT и химиотерапии была подтверждена как перспективная стратегия для усиления терапевтической эффективности. В-третьих, усиленная ультразвуковая визуализация, реализованная PFP, оптимизировала диагностическую стратегию и также помогла верифицировать противоопухолевую эффективность. В-четвертых, вся система безопасна и стабильна с отличной биосовместимостью. Подчеркивается, что в этой стратегии метастазирование легких и рост опухоли были замечательно подавлены как in vitro, так и in vivo. В заключение, синергетическая стратегия продемонстрировала продуктивную терапевтическую эффективность против злокачественной опухоли груди и ее дальних метастазов, и в сочетании со своей ультразвуковой визуализацией может стать перспективной лечебной стратегией в дальнейшей клинической практике.

Материалы и методы

Материалы

PLGA-COOH (Mw 12 000 Da) приобретен у Jinan Daigang Biomaterial Co., Ltd (Цзинань, Китай). Перфторпентан (PFP) и агароза получены от Sigma-Aldrich Co., Ltd. (Сент-Луис, МО). Хлорин e6 (Ce6) куплен у Melone Pharmaceutical Co., Ltd. (Дальнянь, Китай). Набор для анализа цитотоксичности Cell Counting Kit-8 (CCK-8) получен от Dojindo Molecular Technologies (Токио, Япония). 2′,7′-Дихлородигидрофлуоресцеин диацетат (H2DCFDA) приобретен у MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, США). Пропидиев йодид (PI) получен от Solarbio Science and Technology Co. Ltd. (Пекин, Китай). Annexin V-FITC/PI получен от BD Biosciences (США). Докetakсeл (DTX) куплен у MedChemExpress Co., Ltd. (NJ, США). Все остальные реактивы были аналитически чистыми продуктами без дальнейшей очистки. Среда Roswell Park Memorial Institute 1640 (DMEM), фетальная телячья сыворотка и трипсин приобретены у Gibco (ThermoFisher Scientific, США) и УФ-спектрофотометр (UV-Vis, Hitachi, Япония).

Синтез CPDP NPs

Наночастицы Ce6-PFP-DTX/PLGA (CPDP NPs) были приготовлены методом двойной эмульсии W/O/W согласно предыдущему отчету [39, 40]. Кратко, 2 мг Ce6 сначала растворяли в 500 мкл метанола. Затем 50 мг PLGA-COOH и докetakсeл (2 мг) растворяли в 4 мл дихлорметана, и предыдущий раствор одновременно добавляли в него. После этого 200 мкл PFP добавляли в вышеуказанный раствор. В результате смесь обрабатывали ультразвуковым зондом (Sonics & Materials Inc., США) для получения первой эмульсии (5 с вкл / 5 с выкл, 3 мин). Для получения второй эмульсии 8 мл раствора поли(винилового спирта) (PVA) (w/v = 4%) добавляли в вышеуказанную эмульсию, используя тот же ультразвуковой зонд в течение 2 мин. После добавления 10 мл 2% изопропилового спирта в конечную эмульсию раствор механически перемешивали при комнатной температуре не менее 4 часов для полного выпарения дихлорметана. Наконец, CPDP NPs центрифугировали трижды (12 000 об/мин, 5 мин), затем собирали и хранили при 4 °C для дальнейшего использования. Наночастицы PDP NPs готовили тем же способом, за исключением Ce6. Все экспериментальные процессы проводились на льду и строго в темноте.

Характеризация CPDP NPs

Размер частиц и дзета-потенциал CPDP NPs и PDP NPs определяли на приборе Malvern Zetasizer Nano (Malvern, Великобритания). Морфологию характеризовали с помощью проходящей электронной микроскопии (TEM) и оптической микроскопии. Для оценки стабильности CPDP NPs растворяли в фосфатно-буферном растворе (PBS) и измеряли размеры в течение 7 дней соответственно. Каждый образец измеряли трижды. Эффективность инкапсуляции CPDP NPs рассчитывалась по следующей формуле:

Эффективность инкапсуляции (%) = (Масса загруженного DTX или Ce6 / Масса общего DTX или Ce6) × 100%. Для верификации инкапсуляции различных материалов исследовали УФ-Vis спектры различных образцов (UH5300, Hitachi). Эффективная инкапсуляция также анализировалась с помощью TEM.

Скорость высвобождения препарата из CPDP NPs

Для оценки способности высвобождения Ce6 и DTX из CPDP NPs использовали два раствора с разным pH (фосфатный буферный раствор, PBS: 7,4, уксусный буферный раствор, ABS: 5,6) для тестирования кумулятивной эффективности высвобождения. Кратко, CPDP NPs сначала диспергировали с 1 мл PBS или ABS, после чего смесь помещали в диализационный мешок (Mw: 10 000); весь раствор затем переносили в стеклянную бутылку (общий объем: 150 мл), в которую добавляли 149 мл PBS или ABS для поддержания общего объема раствора на уровне 150 мл. Стеклянная бутылка затем помещали в термостатируемый шейкер при 37 °C, и в разные периоды времени (0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 24; 48; 72 ч) раствор собирал и немедленно восполнял тем же объемом среды. Каждая группа повторялась трижды. Наконец, концентрации Ce6 и DTX измеряли на Synergy Hybrid Multi-Mode Read (BioTek, США) при 403 и 229 нм соответственно, и скорость высвобождения препарата в каждую точку времени рассчитывали.

In vitro ультразвуковая визуализация

Для исследования ультразвуковой способности CPDP NPs эмульсию (1 мг/мл) сначала обрабатывали прибором с низкоинтенсивным сфокусированным ультразвуком (LIFU) (Ronghai Ultrasonic Medical Engineering Research Center, Чунцин, Китай), а режим проведения устанавливали как 50% коэффициент заполнения, длительность импульса 1 с под разными интенсивностями (1–2 Вт/см²) в течение разных времен. Для ультразвуковой визуализации облученные CPDP NPs добавляли в предварительно подготовленную агарозную модель соответственно, используя ультразвуковой диагностический прибор Philips EPIQ5 (частота зонда: 12 МГц, MI: 0,06) для наблюдения 2D и CEUS визуализации CPDP NPs. Одновременно программное обеспечение ImageJ применяли для анализа значения серого каждого группы.

Клеточное поглощение и in vitro генерация РФК CPDP NPs при облучении LIFU

Муриновая клеточная линия рака груди 4T1 получена из Шанхайского банка клеток Китайской академии наук (Шанхай, Китай) и инкубировалась в среде RPMI 1640, смешанной с 10% FBS и 1% стрептомицина/пенициллина при 37 °C в увлажненном инкубаторе с 5% CO₂.

Клетки 4T1 сначала инкубировали в предыдущих условиях при плотности 1 × 10⁴ клеток на блюдце для тестирования клеточного поглощения с помощью CLSM в разных временных интервалах (1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч). Для верификации генерации РФК клетки разделяли на следующие 5 групп: контроль, CPDP NPs, LIFU, Ce6 + LIFU, CPDP NPs + LIFU. После 24-часовой обычной культивирования среду заменяли на CPDP NPs (200 мкл, 0,8 мг/мл) или раствор Ce6 (200 мкл) соответственно, и клетки ко-инкубировали еще 3 ч. Затем облучением LIFU (2 Вт/см², 120 с) воздействовали соответственно согласно разным группам. После ко-инкубации и лечения LIFU добавляли 100 мкл разбавленного раствора DCFH-DA, и каждую группу культивировали в предыдущем инкубаторе 15 мин. Конфокальный лазерный сканирующий микроскоп (CLSM) использовали для подтверждения результата производства реактивных форм кислорода, а соответствующие флуоресцентные интенсивности измеряли программным обеспечением ImageJ.

In vitro цитотоксичность и способность к совместному лечению CPDP NPs

Анализ CCK-8 применяли для оценки in vitro цитотоксичности CPDP NPs. В этом отношении проектировали разные группы с или без облучения LIFU при разных концентрациях. Результаты показали, что после 24-часовой ко-инкубации без облучения LIFU не было заметного эффекта на выживаемость клеток CPDP NPs даже при наивысшей концентрации (0,8 мг/мл), демонстрируя желательную биобезопасность CPDP NPs (Рис. 5a). Напротив, показывали, что после облучения LIFU происходило резкое снижение жизнеспособности клеток, показывая, что комбинация CPDP NPs и LIFU заметно запускает гибель клеток 4T1, что согласуется с in vitro генерацией РФК.

Для дальнейшей оценки эффективности SDT вводили анализ методом потоковой цитометрии. Как показано на Рис. 5b, c, индекс некроза и апоптоза клеток был максимально наблюдаем в группе CPDP NPs + LIFU, в то время как другие группы не показывали очевидного некроза и апоптоза. Особенно, скорость некроза и апоптоза в группе CPDP NPs + LIFU была в три раза выше, чем в группе только CPDP NPs, что обеспечило значительную эффективность гибели опухолевых клеток SDT с другого аспекта. Интригующе, по сравнению с группой PDP NPs + LIFU, скорость некроза и апоптоза в группе CPDP NPs + LIFU была значительно увеличена, демонстрируя эффективность синергетической терапии SDT и химиотерапии.

In vitro ингибирование клеточного метастазирования

Для исследования ингибирования метастатической способности клеток проектировали анализ заживления раны и трансвелл-анализ. Для анализа заживления раны клетки 4T1 обычным образом культивировали как ранее в 6-колодчатой пластинке. После роста клеток до 80% конфлюэнтности пипетку (10 мкл) применяли для проведения искусственного поражения вдоль центра 6-колодчатой пластинки. Затем клетки обрабатывали в тех же группах, упомянутых выше. После непрерывной ко-инкубации в течение 24 ч клетки промывали PBS 3 раза и наблюдали под оптической микроскопией (Olympus, Япония).

Для трансвелл-анализа верхняя камера трансвелл-камеры (Corning, Сан-Диего, США) в первую очередь применялась для имитации внеклеточной матрицы in vivo. Клетки 4T1 при плотности 1 × 10⁵ клеток на колодку посевали в верхнюю камеру в среде RPMI 1640 без сыворотки, в то время как нижняя камера заполняли полной культурной средью, смешанной с 10% FBS. Затем клетки разделяли так же, как и выше группы, и обрабатывали 24 ч соответственно. После этого клетки на нижней поверхности фиксировали параформальдегидом и окрашивали кристаллическим фиолетом. Результаты наблюдали с помощью световой микроскопии (Olympus, Япония).

In vivo ультразвуковая визуализация

Здоровые самки мышей BALB/c (4 недели) и мышей Куньмин (4 недели) получены из Центра лабораторных животных Нинсяньского медицинского университета. Все животные эксперименты проводились согласно руководству, одобренному Комитетом по этике животных Нинсяньского медицинского университета. Для установления модели мышей с опухолями мышей BALB/c инокулировали клетками рака груди 4T1 (1 × 10⁷/мл) в правый бок. После роста размера опухоли до 60–80 мм³, мышей BALB/c инъекционировали CPDP NPs (200 мкл, 1 мг/мл) через хвостовую вену внутривенно. Через 24 ч место опухоли мышей облучали LIFU (2 Вт/см², 120 с), а затем 2D и CEUS визуализацию получали через вышеупомянутый ультразвуковой диагностический прибор Philips EPIQ5. Анализ серого измеряли программным обеспечением ImageJ.

In vivo синергетическая терапевтическая эффективность CPDP NPs

После инокуляции клеток рака 4T1 размер опухоли регистрировали каждые два дня, а объем опухоли рассчитывали по формуле: Объем = 1/2 × Длина × Ширина². Размер опухоли и вес мышей регистрировали каждые 2 дня, в то время как фотографии роста опухоли записывали каждые 3 дня. Когда объем опухоли достигал 60–80 мм³, мышей с похожим размером опухоли случайно разделяли на те же пять групп: контроль, LIFU, CPDP NPs, PDP + LIFU и CPDP NPs + LIFU (n = 3). Каждой группе внутривенно вводили различные NPs (200 мкл) через хвостовую вену, кроме контрольной группы (200 мкл PBS вместо этого). Через 24 часа место опухоли облучали LIFU (2 Вт/см²) в течение 120 с. Вся SDT администрировка повторялась каждые 3 дня и длилась 18 дней. Вес тела и объем опухоли мышей измеряли и рассчитывали. После лечения мышей усыпляли, а ткани опухоли отправляли на H&E, TUNEL и PCNA для дальнейшего гистологического анализа.

Биобезопасность CPDP NPs in vivo

Для исследования биобезопасности наночастиц CPDP in vivo здоровых самок мышей Куньмин (n = 3) разделяли на следующие 4 группы: контроль, 5 мг/мл, 10 мг/мл и 20 мг/мл. CPDP NPs (200 мкл) вводили через хвостовую вену мышей; затем мыши имели свободный доступ к еде и воде без дальнейшего администрирования. Вес тела мышей измеряли каждые 2 дня. Через 30 дней мышей усыпляли, а образцы крови собирали для анализа клеток крови и биохимии. Основные органы (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) собирали и исследовали на H&E окраску соответственно.

In vivo ингибирование метастазирования легких

Для оценки эффективности ингибирования метастазирования легких каждой группы весь процесс проводили путем наблюдения количества метастатических узлов в легких, а также оценки гистологии H&E окраски. После усыпления всех мышей ткани легких удаляли и фиксировали; затем фотографировали опухолевые узлы, а ткани легких дополнительно анализировали с H&E окраской.

Статистический анализ

Измерительные данные все выполнялись 3 раза и выражались как среднее ± стандартное отклонение (SD) и анализировались односторонним ANOVA или стандартным t-тестом Стьюдента через программное обеспечение SPSS (версия: 19.0), в то время как p-значение < 0,05 считалось статистически значимым.

Результаты

Характеризация CPDP NPs и эффективность высвобождения препарата

Метод двойной эмульсии применяли для fabricación CPDP NPs, которые одновременно инкапсулировали и фазово-переходный материал PFP, сонически чувствительное вещество Ce6 и химиотерапевтический препарат DTX. При диспергировании в PBS или деионизированной воде раствор представлял светло-серый внешний вид. CPDP NPs демонстрировали однородную сферическую форму и четкую структуру ядро-оболочка, سواء наблюдаемые через оптическую микроскопию или проходящую электронную микроскопию (Рис. 1a, b). Средние диаметры CPDP NPs и PDP NPs составляли 249,5 ± 77,46 нм и 246,6 ± 81,01 нм, а средние дзета-потенциалы поверхности — −18,47 ± 0,55 мВ и −3,987 ± 0,66 мВ соответственно (Рис. 1c, d). Размер CPDP NPs гарантировал, что они могут накапливаться в месте опухоли пассивно через эффект EPR [40]. Разный заряд между CPDP NPs и PDP NPs в основном обусловлен отрицательно заряженным Ce6 [41]. Кроме того, отрицательный дзета-потенциал CPDP NPs указывал на более низкую адсорбцию плазменных белков, подтверждая относительную стабильность наночастиц. Распределение размеров частиц поддерживалось в диапазоне от 249,5 до 385,1 нм в течение 7 дней (Рис. 1e), демонстрируя относительную устойчивость CPDP NPs. Согласно стандартной кривой, эффективность инкапсуляции DTX и Ce6 составляла 83,84 ± 1,39% и 60,54 ± 3,79% соответственно.

a TEM (шкала: 500 нм) и b изображение светового микроскопа CPDP NPs (шкала: 20 мкм). c Распределение размера и d дзета-потенциал PDP NPs и CPDP NPs. e Распределение размера CPDP NPs в течение 7 дней. f Скорость высвобождения Ce6 и g скорость высвобождения DTX при разных условиях (pH 7,4 и pH 5,6, n = 3). h УФ-Vis спектр Ce6, DTX, PFP/PLGA и CPDP NPs соответственно. Стрелки CPDP NPs показывают характерные пики Ce6 и DTX, указывающие на эффективную инкапсуляцию обоих материалов. i Результат TEM двух наночастиц. Наночастица PFP/PLGA демонстрирует тонкую оболочку и круглое ядро (слева). Наночастица CPDP, инкапсулировавшая и Ce6, и DTX, показывает значительно более толстую оболочку и овальное ядро (справа)

Как показано эффективностью высвобождения препарата Ce6 и DTX из CPDP NPs на Рис. 1f, g, почти двукратное увеличение индекса высвобождения DTX фиксировалось при pH 5,5 по сравнению с наночастицами, растворенными при pH 7,4, что указывало на то, что разумная скорость высвобождения DTX может быть эффективно достигнута в кислой микросреде опухоли. Вышеуказанные результаты во всем демонстрировали, что тонко спроектированные CPDP NPs могут обеспечивать стабильное и своевременное высвобождение химиотерапевтического препарата в кислой опухолевой среде и также фундаментально желательны для подготовки к SDT.

Как показывало УФ-Vis, DTX и Ce6 раскрывали уникальные пики поглощения при 229 нм и 403 нм соответственно, а напротив, PFP/PLGA не показывал ни одного из пиков. Следует отметить, что спектр CPDP NPs демонстрировал похожие пики вблизи вышеуказанных двух длин волн, в то время как остальное показывало ту же тенденцию, что и спектр PFP/PLGA, указывая на успешную инкапсуляцию различных материалов (Рис. 1h). Для дальнейшей верификации эффективной инкапсуляции, Рис. 1i показывал, что наночастица PFP/PLGA обладает значительно более тонкой оболочкой и круглым ядром, в то время как наночастица CPDP раскрывает относительно более толстую оболочку и овальное ядро из-за инкапсуляции и DTX, и Ce6.

In vitro ультразвуковая визуализация

Подчеркивается, что PFP обладает отличной способностью к фазовому переходу. Трансформация жидкость-газ не только помогает наночастицам агрегироваться в месте опухоли, но также предоставляет способность усиливать эффективность ультразвуковой визуализации [42]. Для демонстрации этого LIFU облучение применяли как триггер для индукции фазового превращения PFP, а именно эффекта акустической дисперсионной испарения (ADV) [43]. Результаты показали, что интенсивности серого держались на относительно низком уровне до облучения LIFU, в то время как после увеличения интенсивности и времени облучения LIFU тенденция усиленной ультразвуковой визуализации раскрывалась как в 2D, так и в CEUS (Рис. 2a). Акустический анализ ImageJ дополнительно убедил в результате за счет повышенного значения серого (Рис. 2b, c), что было согласовано с результатами визуализации. Следует отметить, что самый значимый результат 2D и CEUS получался, когда интенсивность LIFU достигала 2 Вт/см² и длилась 120 с. Результаты выше продемонстрировали, что PFP успешно инкапсулирован в CPDP NPs, и способность ультразвуковой визуализации была значительно повышена под более высокой интенсивностью и более длительным временем администрирования LIFU.

a Ультразвуковые изображения 2D и CEUS под разными интенсивностями и длительностями LIFU. b Соответствующая интенсивность серого при разных интенсивностях и времени 2D визуализации и c CEUS визуализации (**p < 0,01, n = 3)

Клеточное поглощение и in vitro генерация РФК CPDP NPs при облучении LIFU

Как показывал результат CLSM на Рис. 3, клеточное поглощение CPDP NPs демонстрировало усиленную тенденцию в разных временных интервалах, достигая наиболее значительной агрегации при 8-часовой ко-инкубации.

Клеточное поглощение 4T1 CPDP NPs в разных временных интервалах (Синий: DAPI окрашенные клетки 4T1. Красный: DiR-маркированные CPDP NPs, шкала 50 мкм)

Основная стратегия сонидинамической терапии (SDT) — генерация РФК — серии продуктов одноэлектронного восстановления — для индукции апоптоза раковых клеток и ингибирования клеточной пролиферации [44]. Подчеркивается, что при воздействии ультразвука сонически чувствительное вещество склонно запускать производство РФК; в то же время значительное количество энергии высвобождается в течение всего процесса [45]. Учитывая, что и ультразвук, и сонически чувствительное вещество являются незаменимыми элементами для продвижения SDT, внутриклеточное генерирование РФК проектировали и анализировали для исследования различий между разделенными группами. Согласно Рис. 4a, количество РФК, сгенерированных группой свободного Ce6 плюс облучение LIFU, было пренебрежимо малым, что может быть связано с быстрым метаболизмом свободного Ce6, ведущим к неудовлетворительному производству РФК. Напротив, самая сильная флуоресцентная интенсивность раскрывалась группой CPDP NPs + LIFU. Предполагали, что инкапсулированный Ce6 был хорошо защищен и таким образом удерживался от метаболизма. В результате, после стимуляции LIFU, Ce6 высвобождался для производства изобилия РФК. Сравнительно, в других группах не находили значимых флуоресцентных сигналов (Рис. 4b).

a CLSM изображения генерации РФК при различных лечениях и b соответствующий анализ FL интенсивности (****p < 0,0001, n = 3). Шкалы 50 мкм

In vitro цитотоксичность и способность к совместному лечению CPDP NPs

Анализ Cell Counting Kit-8 (CCK-8) вводили для тестирования in vitro цитотоксичности CPDP NPs. В этом отношении проектировали разные группы с или без облучения LIFU при разных концентрациях. Результаты указывали, что после 24-часовой ко-инкубации без облучения LIFU не было очевидного эффекта на выживаемость клеток CPDP NPs даже при наивысшей концентрации (0,8 мг/мл), демонстрируя желательную биобезопасность CPDP NPs (Рис. 5a). Напротив, показывали, что после облучения LIFU происходило резкое снижение жизнеспособности клеток, показывая, что комбинация CPDP NPs и LIFU заметно запускает гибель клеток 4T1, что согласуется с in vitro генерацией РФК.

a Относительная жизнеспособность клеток с или без облучения LIFU при разных концентрациях CPDP NPs. b Апоптоз и некроз опухолевых клеток 4T1 анализом потоковой цитометрии и c данные соответствующего анализа скорости некроза и апоптоза (****p < 0,0001, ***p < 0,001, n = 3)

Для дальнейшей оценки эффективности SDT вводили анализ методом потоковой цитометрии. Как показано на Рис. 5b, c, индекс некроза и апоптоза клеток был максимально наблюдаем в группе CPDP NPs + LIFU, в то время как другие группы не показывали очевидного некроза и апоптоза. Особенно, скорость некроза и апоптоза в группе CPDP NPs + LIFU была в три раза выше, чем в группе только CPDP NPs, что обеспечило значительную эффективность гибели опухолевых клеток SDT с другого аспекта. Интригующе, по сравнению с группой PDP NPs + LIFU, скорость некроза и апоптоза в группе CPDP NPs + LIFU была значительно увеличена, демонстрируя эффективность синергетической терапии SDT и химиотерапии.

In vitro ингибирование клеточного метастазирования

Инвазивная и миграционная способность опухолевых клеток незаменимы в прогрессировании опухоли [46, 47]. Как показано на Рис. 6a, замыкание между физическим зазором группы CPDP NPs + LIFU было значительно шире, чем в других группах, указывая на относительно более низкую скорость миграционной эффективности. Согласно анализу программного обеспечения ImageJ (Рис. 6c), скорость миграции группы CPDP NPs + LIFU также была замечательно снижена по сравнению с другими группами.

a Анализ заживления раны и b Трансвелл-анализ после различных лечений. c Соответствующая скорость миграции анализа заживления раны. d Соответствующее количество миграции трансвелл-анализа (****p < 0,0001, n = 3)

Аналогично в трансвелл-анализе, по сравнению с быстрой скоростью миграции других групп, группа CPDP NPs + LIFU раскрывала значительное снижение количества клеток (Рис. 6b), что демонстрировало отличную антимиграционную способность синергетической терапии. Конкретно, при отсутствии SDT (группы только CPDP NPs и только LIFU) количество опухолевых клеток слегка снижалось (Рис. 6d). В целом, благодаря комбинации SDT и химиотерапии, метастазирование клеток 4T1 было замечательно ингибировано in vitro.

In vivo ультразвуковая визуализация

Поскольку PFP был инкапсулирован в CPDP NPs, также необходимо оценить характерную ультразвуковую визуализацию in vivo. После инъекции через хвостовую вену CPDP NPs, LIFU затем применяли к месту опухоли для получения 2D и CEUS визуализации (Рис. 7a). Четкая графическая разница между двумя группами указывала на то, что после облучения LIFU соответствующая интенсивность CPDP NPs была очевидно повышена по сравнению с группой до облучения. Дальнейшие данные средней интенсивности эха также подтверждали этот результат, что также согласовывалось с ранее полученным in vitro результатом визуализации (Рис. 7b, c).

a 2D и CEUS изображения с и без облучения LIFU. b, c Соответствующий анализ интенсивности серого, измеренный ImageJ (**p < 0,01, *p < 0,05, n = 3)

In vivo синергетическая терапевтическая эффективность CPDP NPs

Судя по Рис. 8a, b, объем опухоли группы CPDP NPs + LIFU был значительно меньше после 18 дней лечения, чем в других группах, что может быть атрибутировано эффективности РФК, исходящей от лечения SDT, а также химиотерапии для осуществления валидной синергетической терапевтической эффективности. Аналогично, фотографии мышей с опухолями (Рис. 8a) также показывали ту же тенденцию, верифицируя кооперативную терапевтическую эффективность CPDP NPs, запускаемой воздействием LIFU. Более того, не было очевидного снижения веса мышей между разными группами (Рис. 8c). Результаты выше все указывали на гораздо более высокий коэффициент ингибирования группы CPDP NPs + LIFU, раскрывая, что синергетическая терапия может значительно предотвратить рост опухоли.

a Изображения мышей с опухолями при различных лечениях в течение определенных 18 дней (n = 3). b Анализ объема опухоли согласно различным лечениям (**p < 0,01). c Вес мышей с опухолями при различных лечениях (ns незначимо, n = 3). d H&E, PCNA и TUNEL результаты при различных лечениях (шкала: 200 мкм). e Анализ индекса пролиферации PCNA опухолей при различных лечениях. f Анализ апоптотического индекса TUNEL опухолей при различных лечениях (****p < 0,0001, n = 3)

Для дальнейшего свидетельства терапевтических результатов всех групп использовали H&E, PCNA и TUNEL окраску (Рис. 8d). Скорость пролиферации PCNA в группе CPDP NPs + LIFU составляла только 20,50%, что было в четыре раза ниже контрольной группы, в три раза ниже групп только LIFU и только CPDP NPs и в два раза ниже группы PDP + LIFU соответственно, демонстрируя значительную антиопухолевую пролиферативную скорость (Рис. 8e). Как показано на Рис. 8d, f, результаты TUNEL указывали, что группа CPDP NPs + LIFU демонстрировала очевидный апоптотический индекс 72,86%, который был намного выше контрольной (9,66%), LIFU (12,86%), CPDP NPs (19,59%) и PDP NPs + LIFU (37,06%) групп. Результаты выше все продемонстрировали эффективность синергетической терапии, осуществленной in vivo, что также было доказано согласованным с предыдущими in vitro результатами.

Биобезопасность CPDP NPs in vivo

Несмотря на эффективный терапевтический результат, крайне важно исследовать биобезопасность новосозданных наночастиц. От имени безопасного распределения CPDP NPs in vivo проводили метаболическую безопасность. Результаты показали, что вместо явной потери веса тела, вес тела мышей постепенно увеличивался во всех группах мышей (Рис. 9a), что указывало на пренебрежимое негативное влияние CPDP NPs. Кроме того, как показывали различные органы и образцы крови на Рис. 9b, не наблюдалось значительных изменений в клетках крови, индексах биохимического анализа и H&E окраске (Рис. 9c) среди разных лечебных групп, указывая на отличную биобезопасность CPDP NPs in vivo.

a Вес здоровых мышей Куньмин при различных концентрациях CPDP NPs (n = 3). b Биохимия крови и общий анализ крови при различных концентрациях CPDP NPs в течение определенного периода 30 дней (n = 3). c H&E результаты разных органов (сердце, печень, селезенка, легкие и почки) мышей при том же лечении (шкала: 50 мкм)

In vivo ингибирование метастазирования легких

Хорошо установлено, что легкие являются основным органом-мишенью для дальних метастазов рака груди [48]. Для оценки эффективности подавления метастазирования использовали ткани легких мышей для антиметастатического исследования. Как видно из Рис. 10a, b, по сравнению с контрольной, LIFU, CPDP NPs и PDP + LIFU группами, группа CPDP NPs + LIFU демонстрировала наиболее замечательное снижение легких узлов, что предполагало ее желательную эффективность ингибирования легких метастазов. Подобная тенденция снижения также дополнительно указывалась H&E окраской (Рис. 10c), что во всем демонстрировало, что данная синергетическая терапевтическая стратегия может прилагать эффективные усилия для устранения метастазирования легких у мышей.

a Изображения общего вида тканей легких. b Анализ метастатических легких узлов между различными лечениями (**p < 0,01, n = 3). c Соответствующие изображения H&E окраски метастазов легких (шкала: 50 мкм)

Обсуждение

Большое признание имеет то, что метастазирование рака груди будет обширно влиять на его плохой прогноз [3, 49]. Как желательный терапевтический подход, SDT может служить за свою высокую эффективность и способность глубокого проникновения, что было обширно подтверждено [11, 50]. Признается, что поскольку существуют определенные ограничения в единичном применении сонически чувствительных веществ, использование только SDT все еще может быть менее достаточным в дальнейшем исследовании рака. Развитие нанотехнологий в сочетании с клинической медициной было значительно продвинуто в последние годы, благодаря вдохновляющим достоинствам, таким как пренебрежимая токсичность, неинвазивность и отличная биосовместимость. Используя этот новый подход, исследователи прилагали много усилий в исследовании многофункциональных терапевтических стратегий для усиления противоопухолевой эффективности.

Биобезопасность является приоритетом нано-агентов. Как широко признанный материал, сертифицированный Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA), подчеркивается, что PLGA может выполняться как желательный носитель в приложении [51, 52]. Основываясь на его преимуществах, мы создали наносистему для реализации многофункциональной терапевтической эффективности, используя PLGA как внешнюю структуру для инкапсуляции сонически чувствительного вещества Ce6, фазово-переходного материала PFP и химиотерапевтического агента DTX. Наночастицы CPDP (CPDP NPs) в первую очередь наблюдались по структуре ядро-оболочка и подходящему размеру, так что желательная агрегация через эффект EPR могла быть достигнута. Жизнеспособность клеток CPDP NPs была доказана выше 80% после 24-часовой ко-инкубации, указывая на хорошую безопасность этой наноплатформы. Кроме того, фазовое превращение инкапсулированного PFP также гарантировало CPDP NPs как контраст-усиливающий агент при активации LIFU. Усиленная способность ультразвуковой визуализации не только обеспечит идеальное терапевтическое окно, но также продвинет перспективное будущее для CPDP NPs для реализации интеграции точной диагностики и точного лечения.

Ключевая стратегия в SDT — генерация РФК. По сравнению с единичным применением Ce6, инкапсулированный в PLGA Ce6 оказывал желательную защиту, что могло быть верифицировано результатом РФК. В нашем исследовании генерировалось только пренебрежимое количество РФК при единичном использовании Ce6, в то время как наночастицами-инкапсулированный Ce6 производил значительное количество РФК, что дополнительно доказывалось эффективностью SDT. Результат указывал, что генерация РФК сохранялась инкапсулированным Ce6 в CPDP NPs, что могло заложить прочную основу для последующего ингибирования опухоли. Кроме того, скорость высвобождения препарата показывала, что даже при pH 5,5 малое количество Ce6 высвобождалось из наночастиц, демонстрируя хорошую защиту сонически чувствительного вещества PLGA, что дополнительно доказывалось производством РФК и результатом SDT с высокой эффективностью. Интересно, что эффективность высвобождения DTX и Ce6 при pH 5,5 была довольно разной согласно результатам (более 40% и около 20% соответственно), что может быть вызвано разной эффективностью инкапсуляции двух препаратов. Незначительная скорость высвобождения Ce6 демонстрировала, что он может быть эффективно защищен в PLGA, так что существенное генерирование РФК через стимуляцию LIFU может быть достигнуто для получения более убедительной эффективности SDT. Другая причина этой разницы может быть связана с разными растворителями двух препаратов в процессе приготовления. Конкретно, DTX и PLGA напрямую растворяли в дихлорметане, в то время как Ce6 нужно было сначала растворить в метаноле, а затем добавлять капельно в дихлорметан из-за его плохой растворимости в последнем [53]. Поскольку высвобождение препарата в наночастицах напрямую связано с эффективностью последующей комбинированной терапии, оценка скорости высвобождения препарата, а также результат генерации РФК взаимно доказали этот пункт. Текущие исследования предполагали, что использование только химиотерапии может не значительно обратить прогрессию опухоли [41]. В этом исследовании наноплатформа, которую мы спроектировали, продемонстрировала сильные доказательства того, что по сравнению с единичным применением химиотерапии, синергетическое лечение замечательно повысило терапевтическую эффективность как in vitro, так и in vivo. Поскольку стимуляция LIFU оптимизировала терапевтическую стратегию, скорость апоптоза клеток была замечательно повышена. Стоит отметить, что благодаря этой синергетической стратегии метастазирование легких могло быть значительно ингибировано как на уровне опухолевых клеток, так и в модели инокулированных мышей, что согласуется с предыдущими отчетами [16, 52].

Заключение

В заключении, безопасные и стабильные CPDP NPs, которые мы спроектировали и приготовили, плюс облучение LIFU могли замечательно устранить прогрессирование опухоли груди и ее метастазирование легких. С усиленной способностью визуализации, данная наноплатформа также считалась перспективным контраст-усиливающим агентом в клинике. Следовательно, новая синергетическая стратегия в сочетании с LIFU может быть рассмотрена как эффективное терапевтическое приложение для обращения плохого исхода метастатического рака груди.

Аббревиатуры

LIFU:

Низкоинтенсивный сфокусированный ультразвук

SDT:

Сонидинамическая терапия

PFP:

Перфторпентан

EPR:

Эффект усиленной проницаемости и удержания

DCFH-DA:

Дихлородигидрофлуоресцеин диацетат

PI:

Пропидиев йодид

TEM:

Проходящий электронный микроскоп

ROS:

Реактивные формы кислорода

Ce6:

Хлорин e6

DTX:

Докetakсeл

FBS:

Фетальная телячья сыворотка

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

CPDP NPs:

Наночастицы Ce6/PFP/DTX/PLGA

PDP NPs:

Наночастицы PFP/DTX/PLGA