Таргетированная доставка артемизинина через Fe(II)-танниновую кислоту-оболочку MOF усиливает ферроптоз в трипл-негативном раке молочной железы

Аннотация

Подавление развития опухоли путем индукции ферроптоза может стать потенциальным средством для трипл-негативного рака молочной железы (ТНРМЖ), который чувствителен к внутриклеточному окислительному дисбалансу. Недавно артемизинин (ART) и его производные изучались как потенциальные противоопухолевые агенты для лечения высокоагрессивных раков через индукцию ферроптоза железо-опосредованным расщеплением эндопероксидного моста. Из-за плохой водорастворимости и ограниченного внутриклеточного содержания железа дальнейшее применение в противоопухолевой терапии затруднено. Здесь мы разработали нанопереносчик с поставкой феррического железа для ART на основе танниновой кислоты (TA) и феррического иона (Fe(II)), покрытых на цеолитико-имидазольном карказе-8 (ZIF) с инкапсулированным ART (TA-Fe/ART@ZIF) через координационно-драйвенную самоассамблею. Эксперименты по выделению препарата показали, что ART почти не выделялся при pH 7,4, в то время как 59% ART выделялось при pH 5,0 через 10 ч, демонстрируя отличный pH-зависимый выброс. В то же время высокий уровень внутриклеточных ROS и MDA, сопровождающийся снижением GSH и GPX4, продемонстрировал, что новая нанолекарственная система явно усиливает ферроптоз. По сравнению с монотерапией, in vitro и in vivo эксперименты по ингибированию опухоли показали более высокую эффективность подавления опухоли TA-Fe/ART@ZIF. Эта работа предоставляет новый подход к повышению потенции ферроптотического нанолекарства и новые направления для терапии ТНРМЖ.

Введение

Ферроптоз, недавно открытый подтип клеточной смерти, может привести к накоплению железо-зависимых липидных гидROPEROXидов (LPO), что наносит ущерб структуре и целостности клетки [1–3]. Новые данные свидетельствуют, что активация ферроптоза несколькими малыми молекулами является эффективным подходом к подавлению опухоли в различных экспериментальных онкологических моделях и создала высокие ожидания для потенциала ферроптоза как новой противоопухолевой терапии [4–6]. Трипл-негативный рак молочной железы (ТНРМЖ) — самый агрессивный подтип рака молочной железы, лишенный таргетированных терапий и часто ассоциированный с рецидивами, дальними метастазами и резистентностью к терапии [7]. Предыдущие исследования указывали, что xCT цистин/глутамат антипортер высоко экспрессируется во многих клетках ТНРМЖ, играя важную роль в поддержании уровня глутатиона (GSH) и окислительно-восстановительного баланса [8]. Снижение внутриклеточного содержания GSH может сделать клетки ТНРМЖ чувствительными к ферроптозу, тем самым убивая опухолевые клетки [8]. Особенно важно, что ферроптоз также может обходить резистентность ТНРМЖ к обычному запрограммированному апоптозу [9]. Следовательно, стратегии или препараты, основанные на индукции ферроптоза, могут иметь терапевтический потенциал для клинического лечения рефрактерного ТНРМЖ.

Артемизинин (ART), сесквитерпеновый лактон, содержащий перекисную группу, был изолирован из традиционного китайского растения Artemisia annua и проявил желательную противоопухолевую активность в множестве клеточных линий рака [10, 11]. Нарастающие доказательства показывают, что раковые клетки содержат значительно больше внутриклеточного пула железа, чем нормальные клетки, в то время как железо-опосредованное расщепление эндопероксидного моста позволяет ART селективно вызывать гибель клеток в множестве клеточных линий рака [12, 13]. Железо-ионно-зависимая противоопухолевая активность привлекла все больше внимания к ART-регулируемому ферроптозу [13]. Механистически ART может индуцировать лизосомальное деградирование ферритина в аутофагии-независимом режиме, повышая клеточный уровень феррических ионов и сенсибилизируя клетки к ферроптозу [11].

Однако, индуцирует ли ART ферроптоз в ТНРМЖ, остается неясным. Кроме того, ряд факторов, таких как плохая водорастворимость и недостаточная доступность внутриклеточных феррических ионов, ограничивают дальнейшее применение ART в противоопухолевой терапии [13]. Нанокомплексы ART ожидаются как перспективная нанолекарственная система доставки для ART-базированных противоопухолевых препаратов [14–16]. В последние годы металло-органические каркасы (MOF), класс пористых полимерных материалов, привлекают внимание благодаря демонстрации их больших пор, высокой видимой поверхностной площади и селективному поглощению малых молекул [17–19]. Как представитель MOF-материалов, цеолитико-имидазольный каркас (ZIF-8) широко используется в разработке нанолекарств с характеристиками pH-чувствительности, высокой загрузки препарата и хорошей биосовместимости [20–23]. Кроме того, способность включать настраиваемую поверхность на MOF позволяет контролировать поверхностные свойства и наделять их мультифункциональностью [24, 25]. Супрамолекулярная сборка металло-фенольного координационного покрытия на поверхности MOF недавно привлекла интерес благодаря желательным свойствам, таким как стимуло-отзывчивая дезассамблея, коллоидная стабильность и биосовместимость [26, 27]. Металло-фенольные координационные материалы на MOF могут быть идеальным транспортным средством для доставки гидрофобного ART.

Вдохновленные этим, мы разработали наносистему с координационным покрытием феррического иона — танниновой кислоты на ZIF-8, инкапсулирующую ART (TA-Fe/ART@ZIF) для регуляции ферроптоза в клетках ТНРМЖ, что продемонстрировано на Рис. 1. ZIF-8 выбран как нанопереносчик для инкапсуляции ART благодаря своей хорошей биосовместимости и pH-зависимому выделению. Феррический ион — TA координационное покрытие иммобилизовали на поверхности ART@ZIF для обеспечения дисперсной стабильности и поставки феррических ионов (Fe(II)). После интернализации приготовленной наносистемы в клетки, кислотное деградация транспортных средств способствовала бы выделению ART и накоплению Fe(II). Повышение уровня Fe(II) в клетках расщепляет ART в радикалы через расщепление железо-опосредованного эндопероксидного моста, значительно усиливая эффекты ферроптоза. Таким образом, обнаружение TA-Fe/ART@ZIF-медиации ферроптоза может предложить новые перспективы для разработки новых методов лечения ТНРМЖ.

Материалы и методы

Реактивы

Артемизинин (99%), 2-метилимидазол (98%), нитрат цинка (ZnNO₃; 98%), TA (98%), сульфат железа (FeSO₄; 98%) и безводный метанол предоставлены Aladdin-Reagent Co. Ltd. (Шанхай, Китай).

Фабрикация наночастиц TA-Fe/ART@ZIF

Для приготовления наночастиц ART@ZIF 200 мг ART растворили в 1 мл безводного метанола, и 2 г 2-метилимидазола (растворитель — 8 мл абсолютного метанола) медленно добавили к полученному раствору ART. Под магнитным мешанием 0,2 г нитрата цинка (растворитель — 1 мл абсолютного метанола) медленно добавили. Наконец, объем раствора довели до 15 мл и мешали 10 мин для получения светло-белого раствора. После центрифугирования на 10 000 об/мин образец вымывали трижды метанолом. Супернатант использовали для измерения содержания ART, а осадок сушили лиофилизацией для получения твердого состояния для дальнейшего использования.

Для приготовления наночастиц TA-Fe/ART@ZIF раствор TA (40 мг/мл в деионизированной воде, 2 мл) медленно добавляли к раствору ART@ZIF (10 мг/мл, 4 мл). После мешивания 20 мин 5 мг/мл FeSO₄ медленно добавляли к вышеуказанному раствору. После повторного мешивания 30 мин получали темно-фиолетовый раствор. Наконец, осадок собирали центрифугированием на 10 000 об/мин. Осадок вымывали трижды деионизированной водой и сушили лиофилизацией для получения TA-Fe/ART@ZIF для дальнейшего использования.

Характеризация

TEM (JEM-1230; JEOL, Токио, Япония) использовали для определения морфологии и элементного состава каждой части наночастицы. Динамическое световое рассеяние и дзета-потенциал (DLS; Zetasizer Nano system Malvern Instruments, Malvern, UK) применяли для оценки размера частиц и электрической стабильности наночастиц. Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии (VERTEX 70; Bruker, Бремен, Германия) и термогравиметрический анализ использовали для анализа состава наночастиц. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) измеряли на PHI 5000 Versa Probe III (Physical Electronics). Элементный состав материала TA-Fe/ART@ZIF определяли с помощью EDX (Carl Zeiss Model: Neon-40).

Измерение эффективности инкапсуляции и загрузочной способности

Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC) (Agilent 1200; Agilent Technologies, Санта-Клара, CA) использовали для измерения количества ART в супернатанте. Загрузочную способность и эффективность инкапсуляции ART можно рассчитать как:

Загрузка препарата (%) = (Фактическое количество препарата, инкапсулированного в НЧ) / (Количество НЧ) × 100%

Эффективность инкапсуляции (%) = (Фактическое количество препарата, инкапсулированного в НЧ) / (Начальное количество препарата) × 100%

In Vitro выделение и pH-ответ TA-Fe/ART@ZIF наночастиц

Обработанная диализационная мембрана, завернутая с 2 мг наночастиц, помещали в 50 мл фосфатно-буферного раствора (PBS) с pH 7,4 и 5,0 соответственно, и непрерывно взбалтывали при 37 °C. Раствор снаружи диализационной мембраны пробовали через 15 мин, 30 мин, 45 мин, 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч и 10 ч после начала эксперимента. Содержание ART в буферном растворе измеряли HPLC.

Клеточная культура

Клеточные линии MDA-MB-231 и L929 получены из American Type Culture Collection (Manassas, VA, США). Клетки культивировали при 37 °C и 5% CO₂ влажности в среде RPMI-1640 (Solarbio, Пекин, Китай), дополненной 10% фетальной телячьей сывороткой (Cyclone, Юта, США), 100 мкг/мл пирувата натрия, пенициллином и стрептомицином (Solarbio, Пекин, Китай).

Тест клеточной токсичности In Vitro

Живучесть клеток определяли тестом MTT (3-(4,5-диметилтиазол-2-il)-2,5-дифенилтетразолиевый бромид) согласно литературным процедурам [28, 29].

Клетки MDA-MB-231 и L929 культивировали в стандартных средах в 96-колбовых пластинках (5000 клеток на колбу) и инкубировали в 5% CO₂ при 37 °C 24 ч. Жидкость в колбе удаляли, и 100 мкл на колбу безсывороточной среды с ПБС и разными концентрациями ART, TA-Fe/ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, дефероксамина (DFO, MedChemExpress, Шанхай, Китай), N-бензилоксикарбонил-Вал-Ала-Асп(O-Me) фторметил кетона (Z-VAD-FMK, MedChemExpress, Шанхай, Китай) и ферростатина-1 (Fer1, MedChemExpress, Шанхай, Китай) добавляли в 96-колбовые пластинки. Через 48 ч добавляли 10 мкл MTT (5 мг/мл) и инкубировали еще 4 ч. Наконец, автоматический ферментный маркер (BioTek Instruments Inc., США) измерял абсорбцию в каждой колбе. Результаты выражали в процентах живучести клеток.

Тест окраски Calcein-Acetoxymethyl (Calcein-AM)

Клетки MDA-MB-231 культивировали в 24-колбовых пластинках (2 × 10⁴ клеток на колбу) и инкубировали 24 ч. Затем клетки обрабатывали разными концентрациями наночастиц TA-Fe/ART@ZIF 24 ч. После удаления среды клетки окрашивали Calcein-AM (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай) в темноте при 4 °C 20 мин и наблюдали под флуоресцентным инвертированным микроскопом (Olympus, Токио, Япония).

Потоковая цитометрия для апоптоза

Клетки MDA-MB-231 размещали в 6-колбовой пластинке при плотности 2,5 × 10⁵ клеток на колбу при тех же условиях. После обработки ПБС, ART, TA-Fe/ZIF и TA-Fe/ART@ZIF применяли 24 ч. Затем клетки центрифугировали и собирали из 6-колбовой пластинки. После двойной окраски йодидом пропидия и Аннексин-V (Набор Аннексин V-FITC; Beckman Coulter, Марсель, Франция) использовали потоковую цитометрию для детектирования.

In vitro определение реактивных форм кислорода (ROS)

Содержание ROS в клетках определяли с помощью флуоресцентного зонда ROS (дихлоро-дигидро-флуореcein диацетат (DCFH-DA, Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай). Клетки MDA-MB-231 культивировали в 6-колбовых пластинках (2,5 × 10⁵ клеток на колбу) и инкубировали в 5% CO₂ при 37 °C 24 ч. Жидкость из колб удаляли, клетки обрабатывали следующим образом: контрольная группа без обработки (безсывороточная среда), положительная контрольная группа и экспериментальная группа (разные концентрации наночастиц). После инкубации 8 ч при 37 °C добавляли 0,1% DCFH-DA в каждую колбу и инкубировали 30 мин. Клетки, нереагирующие на DCFH-DA, удаляли ПБС и наблюдали под флуоресцентным инвертированным микроскопом (Olympus, Токио, Япония).

Определение содержания малатуальдегида (MDA) и GSH

Набор для определения MDA (TBA метод; Jiancheng Bioengineering, Нанкин, Китай) и набор для определения GSH (Beyotime Biotechnology, Шанхай, Китай) использовали для измерения внутриклеточных уровней MDA и GSH. После обработки ПБС, ART, TA-Fe/ZIF и TA-Fe/ART@ZIF клетки MDA-MB-231 собирали и считали. Внутриклеточное содержание MDA и GSH определяли согласно инструкциям в наборах.

Вестерн-блот анализ

Клетки MDA-MB-231, обработанные разными наночастицами, лизировали RIPA лизисным буфером. После определения концентрации белка белки разных образцов разделяли на 10% SDS-PAGE геле и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. Нитроцеллюлозная мембрана с загруженными белками образцов блокировали 0,5% раствором БСА 1 ч, и нитроцеллюлозная мембрана с первичными антителами инкубировали 24 ч при 4 °C. Промывали первичные антитела с нитроцеллюлозной мембраны TBST и продолжали инкубацию с соответствующими вторичными антителами при комнатной температуре 2 ч. После смывания вторичных антител на мембране использовали хэмилюминесцентный раствор и наблюдали под системой гель-образа.

In vivo противоопухолевой эксперимент

Все животные эксперименты одобрены Этический комитетом Вейфанского медицинского университета. Здоровые самки голых мышей (возраст: 4 недели; вес: 13–17 г; Vital River, Пекин, Китай) вводили 5 × 10⁶ клеток MDA-MB-231 в 150 мкл фосфатно-буферного раствора. Когда объем опухоли увеличивался до 70–120 мм³, мышей случайно делили на четыре группы. Каждую группу мышей отдельно лечили ПБС, ART (20 мг/кг), TA-Fe/ZIF (80 мг/кг) и TA-Fe/ART@ZIF (100 мг/кг). Каждую мышь лечили внутрибрюшинными инъекциями каждые три дня. Через 14 дней всех мышей усыпляли. Опухолевые ткани и важные органы собирали для гемоксилин-эозиновой окраски.

Статистический анализ

Все эксперименты повторяли минимум трижды. Все данные статистически анализировали с помощью ПО SPSS версии 22.0 (IBM Corp., Армонк, США). Результаты выражали как среднее ± стандартное отклонение. P значения < 0,05 считали статистически значимыми.

Результаты и обсуждение

Характеристика наночастиц TA-Fe/ART@ZIF

Сначала наночастицы ART@ZIF синтезировали при комнатной температуре из метанола, ацетата цинка, 2-метилимидазола и ART согласно литературным процедурам [30]. Стабильные супрамолекулярные металло-полифенольные пленки затем быстро формировали вокруг шаблонов ART@ZIF вихреванием TA и феррических ионов. По сравнению с сообщенными магнитными наночастицами [31–33], TA-Fe/ART@ZIF приготовили методом самоассамблеи, формирующим TA-Fe мембрану на поверхности MOF без участия суровых химических или гидротермических реакций. Что еще важнее, нанопереносчик TA-Fe/ART@ZIF может быть запущен низким pH для выделения ART и Fe(II), что дополнительно катализируется эндопероксидом ART для генерации С-центрированных свободных радикалов, значительно усиливая ферроптоз. Эффективность инкапсуляции, измеренная HPLC с использованием супернатанта из первой центрифугировки, составила 66,7%. Супернатант получен из наночастиц TA-Fe/ART@ZIF, и расчетная загрузка ART составила 11,4%. Согласно ИК-спектроскопии (Рис. 2a), характерные пики поглощения ART, а именно карбонильная связь на 1738 см⁻¹ и перекисный мост на 724 см⁻¹ [34], наблюдались в наночастицах TA-Fe/ART@ZIF, указывая на успешную инкапсуляцию ART. Далее, результаты термогравиметрического анализа показали, что ART полностью исчезал при повышении температуры до примерно 400 °C (Рис. 2b). По сравнению с наночастицами TA-Fe/ZIF, обнаружили, что ART составляет 7,1% от общей массы наночастиц TA-Fe/ART@ZIF, что в основном согласуется с результатами HPLC.

Результаты TEM показали, что ZIF-8 и ART@ZIF демонстрировали схожую однородную шестиугольную конфигурацию, а распределение размера частиц определялось примерно в 100 нм (Рис. 3a, b). Наночастицы TA-Fe/ART@ZIF имели сферическую конфигурацию, распределение размера — 150 нм. По сравнению с полными ART@ZIF, TA-Fe/ART@ZIF, покрытые Fe(II) и TA, демонстрировали очевидную обычную ядро-оболочечную структуру, размер TA-Fe мембраны составлял примерно 30 нм (Рис. 3a). Кроме того, провели анализ площадного элементного маппинга сформированных наночастиц. Площадной элементный маппинг подтвердил, что периферия наночастиц TA-Fe/ART@ZIF обрамлена элементом Fe, указывая на успешное покрытие Fe(II) и TA (Рис. 3b). XPS измерения проводили для исследования поверхностного элементного состава и взаимодействия в композите TA-Fe/ART@ZIF. Широкий XPS спектр TA-Fe/ART@ZIF изображен в Доп. файле 1: Рис. 1s. Основные пики около 285, 408, 531, 737 и 1036 эВ относились к C 1s, N 1s, O 1s, Fe 2p и Zn 2p соответственно, демонстрируя формирование нанокомпозита TA-Fe/ART@ZIF. Кроме того, EDX маппинговые изображения TA-Fe/ART@ZIF показаны в Доп. файле 1: Рис. 2s. Четко видно, что пики, соответствующие элементам углерод (C), азот (N), кислород (O), железо (Fe) и цинк (Zn), в хорошем согласии с XPS спектром. Увеличением количества Fe(II) обнаружили, что гидродинамический диаметр наночастиц TA-Fe/ART@ZIF увеличивался (Доп. файл 1: Рис. 3s). Для дальнейшего подтверждения покрытия измеряли дзета-потенциал различных наночастиц. Формирование TA-Fe(II) слоя на частицах ART@ZIF сместило поверхностный дзета-потенциал с +21 мВ до −19,5 мВ из-за кислотной природы TA (Доп. файл 1: Рис. 4s). Как сообщалось ранее [30], обилие полифенольных групп в структуре TA не только наделяет способностью покрытия субстрата, но и способно координироваться с ионами переходных металлов (Fe, Zn) для формирования металло-фенольных комплексов. Когда Zn²⁺ и Hmim смешивают для формирования раствора, масса ионов Zn²⁺ координировалась бы на поверхности частиц ART@ZIF; таким образом, дзета-потенциал ART@ZIF составляет +21 мВ. Фенольные группы TA (pKa 8,5) были депротонированы негативно и поэтому могли взаимодействовать с положительно заряженными Zn²⁺, способствуя росту TA-Fe пленки на поверхности ART@ZIF. Поскольку доставка лекарств благоприятствует переносчикам, стабильность важна для их медицинского применения. Стабильность наночастиц демонстрировалась диспергированием в PBS в течение одной недели. Как показано в Доп. файле 1: Рис. 5s, размер частиц представлял желаемый размер и стабильность в ходе временного исследования.

Выделение и цитотоксичность TA-Fe/ART@ZIF In Vitro

Далее, чтобы изучить, обладает ли TA-Fe/ART@ZIF pH-чувствительным поведением декомпозиции, изучали выделение ART из наночастиц при нейтральных и кислых условиях. Как показано на Рис. 4a, в кислых условиях наночастицы могут быстро выделить примерно 58% ART в течение 1 ч. Однако в нейтральных условиях наночастицы могут только медленно выделить ничтожное количество ART. Кроме того, во время обработки внешнего раствора диализационной мембраны гидроксидом натрия, раствор группы pH = 5,0 реагировал с гидроксидом натрия с образованием значительного белого осадка. Однако это явление не наблюдалось в группе pH = 7,4.

Согласно нашей гипотезе, белый осадок — это осадок гидроксида цинка, образованный диссоциацией ионов цинка и щелочи из наночастиц в кислых условиях. Совокупность этих доказательств успешно показывает, что наши наночастицы обладают способностью диссоциировать в кислых условиях.

В дизайне наносистемы TA-Fe/ART@ZIF структуры TA-Fe(II) и ZIF аблируются для выделения инкапсулированных ART и Fe(II) в кислых условиях микросреды опухоли. Повышение уровня Fe(II) в клетках расщепляет ART в радикалы через расщепление железо-опосредованного эндопероксидного моста, значительно усиливая эффекты ферроптоза. Соответственно, тесты MTT проводили для изучения цитотоксичности наносистемы для клеток MDA-MB-231 и L929. По сравнению с ART, наночастицы TA-Fe/ART@ZIF проявили большую цитотоксичность к клеткам MDA-MB-231 (Рис. 4b) и низкую цитотоксичность к нормальным клеткам (Рис. 4c). Наночастицы TA-Fe/ART@ZIF ингибировали активность клеток MDA-MB-231 на 53,9%, в то время как ART при той же концентрации ингибировал только 24,1% клеток. Результаты эксперимента окраски calcein-AM подтвердили, что количество живых клеток MDA-MB-231 постепенно уменьшалось с увеличением концентрации наночастиц TA-Fe/ART@ZIF (Рис. 4d).

TA-Fe/ART@ZIF усиливает генерацию ROS в клетках MDA-MB-231

Известно, что ART проявляет свою противоопухолевую активность через генерацию ROS, производимую железо-опосредованным расщеплением эндопероксидного моста [35, 36]. Поэтому мы изучали эффективность TA-Fe/ART@ZIF индуцировать генерацию ROS зондом 2′,7′-дихлоро-дигидрофлуореcein диацетат (DCHF-DA) [37]. Как показано на Рис. 5, слегка более сильный флуоресцентный сигнал наблюдался в клетках, обработанных ART и TA-Fe/ZIF, по сравнению с необработанными группами, указывая на то, что ART и ионы Fe(II) могли индуцировать генерацию ROS. Напротив, сильный флуоресцентный сигнал при воздействии нанолекарства TA-Fe/ART@ZIF обнаруживался в клетках как доказательство желаемого выхода ROS, генерируемого расщеплением Fe(II)-опосредованного эндопероксида ART. Приготовленная наносистема в клетках деградировала и вызывала накопление Fe(II), заметно усиливая генерацию ROS. Противоопухолевой эффект ART и его производных атрибутируют их способности индуцировать апоптоз различными клеточными процессами, от ответа на повреждение ДНК, лизосомально-медиации катаболического процесса макрофагии и окислительного стресса [13, 35, 38]. Также сообщалось, что железо-опосредованное расщепление эндопероксидного моста в ART может влиять на внутриклеточный окислительный баланс к ферроптозу во многих типах раковых клеток [11]. Эта индукция ферроптоза на основе окислительного дисбаланса может быть дополнительно усилена добавлением Fe(II). Пока Fe(II) активирует ART, он также может реагировать с внутриклеточным перекисью водорода для генерации гидроксильных свободных радикалов через реакцию Фентона, что усиливает эффект индукции апоптоза ART в опухолевых клетках.

TA-Fe/ART@ZIF индуцирует апоптоз и ферроптоз в клетках MDA-MB-231

Параллельно, для исследования клеточной гибели и роли Fe(II), мы использовали хелатор железа дефероксамин, ингибитор апоптоза Z-VAD-FMK и ингибитор ферроптоза ферростатин-1 для спасения этих клеток. Как предсказано, дефероксамин, склавенитель Fe(II), мог явно блокировать гибель клеток, указывая на важную роль Fe(II). Более того, выживаемость клеток MDA-MB-231 значительно улучшалась ингибиторами апоптоза и ферроптоза с 31,4% до 56,3% и 76,0% соответственно (Рис. 6a), подчеркивая важность апоптоза и ферроптоза в TA-Fe/ART@ZIF наночастицах-медиации гибели клеток. Кроме того, мы применяли анализ на основе Аннексин V-FITC через потоковую цитометрию для количественного определения степени апоптоза. Результаты показывают, что наночастицы TA-Fe/ART@ZIF могут индуцировать апоптоз в 21,8% клеток MDA-MB-231 (Доп. файл 1: Рис. 6s). Этот процент был выше, чем для ART, что означает, что апоптоз участвует в TA-Fe/ART@ZIF наночастицах-медиации, но не является основной причиной.

Общая черта ферроптоза — эндогенная липидная перекисная окисленность [39]. MDA, продукт липидной перекисного окисления [40], исследовали для оценки степени ферроптоза. Результаты показали, что наночастицы TA-Fe/ART@ZIF имели примерно в 2,5 раза более высокий уровень MDA, чем контрольная группа (Рис. 6b). Это предположительно из-за наличия нанопереосчика, обогащенного Fe(II), и соответствующего повышения уровня липидных радикалов. Как один из основных антиоксидантных компонентов в клетках, внутриклеточный GSH снижается при ферроптозе [41]. Учитывая важную роль GSH в ферроптозе, мы оценили внутриклеточный уровень GSH после обработки наночастицами TA-Fe/ART@ZIF. GSH значительно снизился по сравнению с контрольными клетками (Рис. 6c). Это дало сильное доказательство истощения GSH и окислительного дисбаланса, центрированного на Fe(II)-опосредованной активации ART наночастицами TA-Fe/ART@ZIF. Далее, вестерн-блот проводили для понимания влияния наночастиц TA-Fe/ART@ZIF на активность GPX4 [42]. Наблюдали, что наночастицы TA-Fe/ART@ZIF вызвали более значимое ингибирование активности GPX4, чем ART (Рис. 6d). Эти данные также хорошо согласовывались с наибольшей степенью истощения GSH.

In vivo противоопухолевой эксперимент

Мы оценили противоопухолевую эффективность наших наночастиц к клеткам MDA-MB-231 in vivo путем ингибирования субкутанных ксенографтных опухолей у опухоленосущих голых мышей. В течение 14-дневного лечения, относительно других групп, наночастицы TA-Fe/ART@ZIF могли значительно ингибировать рост ксенографтных опухолей MDA-MB-231 в результате обильной генерации ROS через реакцию Fe(II)-ART (Рис. 7a). Кроме того, не было значимой разницы в массе тела во всех экспериментальных группах (Рис. 7b), проявляя, что TA-Fe/ART@ZIF имел пренебрежимо малые побочные эффекты. Для дальнейшего изучения терапевтического эффекта опухоль и другие нормальные ткани исследовали H&E окраской после 14-дневного лечения. Как показано на Рис. 8, TA-Fe/ART@ZIF вызвал наибольшую область гибели клеток в опухолевой ткани, в то время как в нормальных тканях не было явного повреждения и апоптоза. В целом, эти результаты продемонстрировали, что TA-Fe/ART@ZIF-медиации терапия не только привела к противоопухолевой эффективности, но и имела низкий уровень острой системной токсичности в SFT-MB-медиации терапии.

Заключение

Подводя итог, ферроптоз предоставляет потенциальное средство для терапии ТНРМЖ, поскольку он имеет исключительные преимущества для преодоления неизбежных барьеров современной превалирующей терапии. Здесь мы спроектировали нанопереносчик с поставкой феррического железа для ART на основе TA-Fe(II) покрытия на наночастицах ZIF с инкапсулированным ART через координационно-драйвенную самоассамблею для усиленного ферроптоза. Нанопереносчик мог растворяться в слабокислой микросреде для выделения ART и Fe(II), что дополнительно вызывало высокий уровень внутриклеточных ROS и MDA, сопровождающийся снижением GSH и GPX4, ведущее к мощному ингибированию роста опухоли и противоопухолевой эффективности in vitro и in vivo. Эта работа предоставляет новый подход к повышению потенции ферроптотического нанолекарства и новые направления для терапии ТНРМЖ. Биосовместимость и всесторонние механизмы TA-Fe/ART@ZIF-индуцированного ферроптоза должны быть обеспечены для дальнейшего исследования.

Доступность данных и материалов

Все данные полностью доступны без ограничений.

Аббревиатуры

MOF:

Металло-органические каркасы

TNBC:

Трипл-негативный рак молочной железы

ART:

Артемизинин

TA:

Танниновая кислота

ZIF:

Цеолитико-имидазольный каркас-8

TA-Fe/ART@ZIF:

Танниновая кислота и феррический ион, покрытые на цеолитико-имидазольном каркасе-8 с инкапсулированным артемизинином

ROS:

Реактивные формы кислорода

LPO:

Липидные гидропероксиды

GSH:

Глутатион

TEM:

Трансмиссионная электронная микроскопия

FTIR:

Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии

HPLC:

Высокоэффективная жидкостная хроматография

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

MTT:

3-(4,5-Диметилтиазол-2-il)-2,5-дифенилтетразолиевый бромид

DFO:

Дефероксамин

Fer-1:

Ферростатин-1

Z-VAD-FMK:

N-Бензилоксикарбонил-Вал-Ала-Асп(O-Me) фторметил кетон

Calcein-AM:

Calcein-ацетоксиметил

DCFH-DA:

Дихлоро-дигидро-флуореcein диацетат

MDA:

Малатуальдегид

BSA:

Бов sierum альбумин

TBST:

Трис-буферный раствор Твеен

SDS-PAGE:

Полиакриlamide гель электрофорез

GPX4:

Глутатион пероксидаза 4