Целевая ко-доставка 5-фторурацила и LY294002 через PEG-липидные наночастицы усиливает антиопухолевую эффективность при плоскоклеточном раке пищевода

Аннотация

Мы спроектировали PEGилированную нанолипосому, ко-инкапсулирующую химиотерапевтический агент 5-фторурацил (5-FU) и ингибитор аутофагии LY294002 (LY) для лечения плоскоклеточного рака пищевода (ПКРП). Комплексная физеохимическая и биологическая характеристика продемонстрировала успешную двойную загрузку лекарств и контролируемый профиль выпуска, причем LY выпускался немного быстрее 5-FU. Липосомы демонстрировали рецептор-медированное поглощение, подтвержденное конфокальной микроскопией и FACS, и доставляли более высокие внутриклеточные концентрации обоих агентов. In vitro нанолипосома (FLNP) индуцировала большую цитотоксичность и апоптоз (~48%) чем каждое лекарство по отдельности или их свободная комбинация, как подтверждено MTT, аннексин V/PI и окраской Hoechst. Вестерн блоттинг выявил регуляцию вверх каспазы-3 и PARP и даун-регуляцию Bcl-2, подтверждая индукцию апоптоза. В ксенограммной модели FLNP достигла превосходного подавления роста опухоли, уменьшая объем опухоли до ~500 мм³ против ~1400 мм³ в контрольных (p < 0,0001). Эти выводы поддерживают перспективу запрограммированной ко-доставки ингибирования аутофагии и химиотерапии через единственный наноносчик для преодоления многолекарственной устойчивости в ПКРП.

Преамбула

Плоскоклеточный рак пищевода (ПКРП) остается серьезным бременем здоровья в Восточной Азии, с 5-летним выживанием всего ~25% (1,2). В то время как хирургия является краеугольным камнем лечения, адъювантная химиотерапия может значительно улучшить исходы (3,4). Однако монотерапия часто терпит неудачу из-за гетерогенности опухоли и врожденной устойчивости (5). Комбинированные схемы, нацеленные на различные клеточные пути, поэтому необходимы для синергетической эффективности (6,7).

Аутофагия, лизосомальный деградативный процесс, часто урегулируется в раковых клетках под стрессом и может защищать их от химиотерапевтических агентов (8). Ингибирование аутофагии показано сенсибилизирует опухолевые клетки к цитотоксичным лекарствам, тем самым преодолевая многолекарственную устойчивость (MDR) (9). LY294002 (LY) — хорошо изученный PI3K ингибитор, эффективно блокирующий аутофагию (9). 5-фторурацил (5-FU), фторированный пиримидиновый аналог, широко используется в плоскоклеточных раках; его цитотоксичность возникает от встраивания в РНК и ингибирования тимидилат синтазы (10–12). И 5-FU, и LY страдают от плохой водорастворимости и быстрого системного клиренса, ограничивая их терапевтическое окно (6,7).

Наноносчики, особенно PEGилированные липосомы, стали клинически валидированными транспортными средствами для доставки лекарств, предлагая улучшенную растворимость, продленное циркулирование и пассивную накопление в опухоли через эффект усиленного проникновения и удержания (EPR) (13–18). Инкапсулируя оба 5-FU и LY в единственную PEG-липосому, мы предполагаем, что ранний выпуск LY разрушит аутофагические пути выживания, делая опухолевые клетки более восприимчивыми к 5-FU и производя синергетический антиопухолевый ответ.

Методы

Материалы

5-FU (Sigma-Aldrich, Китай) и LY294002 (Beijing Huafeng United Technology Corporation, Китай) использовали как получено. Липиды — яйцевая фосфатидилхолин (EPC), DSPE-PEG2000 и холестерин — получены от Avanti Polar Lipids, Китай.

Приготовление двойной-загруженных нанолипосом

Фосфолипиды и холестерин растворили в метанол-хлороформ смеси (молярное соотношение 10:4:1, всего 10 мг). 5-FU и LY (по 1,5 мг) добавили, и растворитель испаряли при 60 °C под сниженным давлением для формирования тонкой пленки. Гидратация фосфатно-буферным раствором (PBS) в течение 1 ч с последующей экструзией через 200 нм поликарбонатную мембрану дала FLNP. Неинкапсулированное лекарство kvantифицировали HPLC. Загрузка лекарства (DL) и эффективность инкапсуляции (EE) рассчитывали: DL (%) = (Вес инкапсулированного лекарства / Вес липосомы) × 100; EE (%) = (Вес инкапсулированного лекарства / Начальный вес лекарства) × 100.

Анализ размера частиц

Динамическое световое рассеяние (DLS) с Malvern Zetasizer Nano ZS измеряло размер частиц и индекс полидисперсности (PDI) при 25 °C.

Морфологический анализ

Передающая электронная микроскопия (TEM, Hitachi H-7600) и атомно-силовая микроскопия (AFM) характеризовали морфологию.

In vitro исследование выпуска

Выпуск лекарств из FLNP оценивали в PBS (pH 7,4) при 37 °C с использованием диализационной мембраны (MW ≈ 3500). Образцы забирали в предопределенные интервалы и анализировали HPLC (Hitachi L-2200 автосэмплер, L-2420 UV-Vis детектор; Inertsil C18 колонка, 150 × 4,6 мм, 5 мкм). Линейная калибровка 0,025–2 мкг/мл (r² ≈ 0,9995).

Клеточная культура

Человеческая клеточная линия ПКРП EC 9706 содержали в RPMI 1640 с 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в 5% CO₂ увлажненном инкубаторе.

Анализ клеточного улавливания

Флуоресцентные роджамин B-загруженные FLNP инкубировали с EC 9706 клетками (10 мкг/мл) в течение 2 ч. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM, Nikon TE2000-E) визуализировала внутриклеточное распределение. Потоковая цитометрия (BD FACSCALibur) kvantифицировала улавливание в 1 ч и 2 ч временных точках.

Цитотоксичность анализ

MTT тесты жизнеспособности выполняли на 1×10⁴ клеток/колба (96-колбовая пластина). Клетки обрабатывали свободным 5-FU, LY, 5-FU + LY или FLNP в течение 24 ч. Абсорбция при 570 нм измеряли считывателем Synergy HTX.

Апоптоз анализ

Аннексин-V/PI окраска (BD Biosciences) с последующей потоковой цитометрией kvantифицировала ранний и поздний апоптоз после 24 ч обработки (1 мкг эквивалентное лекарство).

Hoechst 33342 анализ

Hoechst 33342 (1 мкг/мл) окраска зафиксированных клеток визуализировала ядерную конденсацию под флуоресцентным микроскопом.

Вестерн блоттинг

Белковые экстракты разделяли SDS-PAGE и переносили на PVDF мембраны. Блоты зондировали на клеaved каспазу-3, PARP, Bcl-2 и p53 (AbClon). Детекция использовала ECL и Kodak M35-A обработку.

In vivo подавление роста опухоли

Самки атопных голых мышей (6 недель) получали подкожные инъекции 1×10⁶ OE-19 клеток (100 мкл). Когда опухоли достигали ~80 мм³ (день 10), мышей (n = 6 на группу) обрабатывали 5 мг/кг FLNP, свободными комбинациями лекарств или контролями через внутрибрюшинные инъекции трижды за 10 дней. Объем опухоли (V = ½ × длина × ширина²) измеряли штангенциркулем в течение 20 дней.

Статистический анализ

Данные выражали как среднее ± SD. Значимость оценивали t-тестом или ANOVA (p < 0,05).

Результаты и обсуждение

Ко-доставка 5-FU и LY внутри PEG-липосом достигла синергетического антиопухолевого эффекта, превосходящего эффективность каждого агента по отдельности или их свободной комбинации. Этот синергизм атрибутируется последовательному выпуску LY, который нарушает аутофагические пути выживания, сенсибилизируя клетки к 5-FU-индуцированному ДНК повреждению.

Схематическая иллюстрация приготовления 5-фторурацила и LY-загруженных PEGилированных нанолипосом.

Приготовление и характеристика 5-FU и LY-загруженных нанолипосом

Пустые липосомы демонстрировали средний диаметр ~110 нм (PDI ≈ 0,15). Двойная загрузка лекарств увеличила размер до ~150 нм (PDI ≈ 0,18), размер, благоприятный EPR-медированному накоплению в опухоли (17,18). Поверхностный заряд был +25 мВ, обеспечивая коллоидную стабильность и минимизируя неспецифическую адсорбцию белков.

Физикохимическая характеристика FLNP. а DLS распределение размера; б TEM изображение; в AFM изображение.

Загрузка лекарств и in vitro выпуск

Эффективность инкапсуляции составила 92,5% для 5-FU и 86% для LY, с грузоподъемностью ~16% вес/вес. Профили выпуска в PBS (pH 7,4) выявили бифазный паттерн: ~30% 5-FU и ~40% LY выпущено за 24 ч, с последующим постепенным выпуском до ~60% 5-FU и ~75% LY к 90 ч (Рис. 3). Более быстрый выпуск LY способствует раннему ингибированию аутофагии, праймируя клетки для последующей 5-FU цитотоксичности.

Профили выпуска 5-FU и LY из FLNP в PBS (pH 7,4). Количества лекарств kvantифицированы HPLC.

Исследование клеточной интернализации

CLSM выявила интенсивную красную флуоресценцию в перинуклеарном цитоплазме после 2 ч, указывающую на рецептор-медированный эндоцитоз. Потоковая цитометрия подтвердила время-зависимое улавливание, с заметным увеличением между 1 ч и 2 ч (Рис. 4).

а CLSM изображение EC 9706 клеток после 2 ч инкубации FLNP. б Потоковая цитометрия анализ в 1 ч и 2 ч.

In vitro антиопухолевой эффект

MTT анализы продемонстрировали доза-зависимую цитотоксичность для всех формуляций. FLNP достигло IC₅₀ 0,58 мкг/мл, заметно ниже свободного 5-FU (2,68 мкг/мл), LY (5,98 мкг/мл) и свободной комбинации (1,54 мкг/мл). Усиленная эффективность атрибутируется улучшенной доставке лекарств и последовательному выпуску (Рис. 5).

Жизнеспособность EC 9706 клеток после 24 ч воздействия свободного 5-FU, LY, 5-FU + LY и FLNP (MTT анализ).

Оценка апоптоза

Аннексин-V/PI окраска выявила 48% апоптоза в FLNP-обработанных клетках, по сравнению с 20% для 5-FU в одиночку и 30% для свободной комбинации (Рис. 6). Hoechst окраска подтвердила ядерную конденсацию в FLNP-обработанных клетках.

Потоковая цитометрия апоптоза в EC 9706 клетках после 24 ч FLNP обработки.

Вестерн блот анализ

FLNP заметно увеличил клеaved каспазу-3 и PARP в то время как снизил экспрессию Bcl-2 и p53, подтверждая активацию внутреннего апоптотического пути (Рис. 7).

Вестерн блот апоптоз-связанных белков после FLNP обработки.

In vivo антиопухолевая эффективность: FLNP снизила объем опухоли до ~500 мм³ против ~1400 мм³ в контроле (p < 0,0001).

In vivo анализ подавления роста опухоли

FLNP последовательно подавляла прогрессию опухоли в течение 20 дней, достигая >60% снижения финального объема опухоли относительно свободных лекарственных групп. Улучшенный терапевтический исход атрибутируется опухоль-селективной аккумуляции (EPR) и устойчивому выпуску лекарств.

Заключение

Наша PEG-липосомная платформа успешно ко-доставляет 5-FU и LY, достигая контролируемого последовательного выпуска, усиливающего цитотоксичность и апоптоз при ПКРП. FLNP превзошла свободные комбинации лекарств in vitro и in vivo, подчеркивая потенциал ингибирования аутофагии для преодоления химиостойчивости. Будущие исследования расширят эту стратегию на другие плоскоклеточные мальignancies и оценят ортотопические и пациент-производные ксенограммные модели.

Аббревиатуры

5-FU:

5-фторурацил

EPR:

Эффект усиленного проникновения и удержания

ESCC:

Плоскоклеточный рак пищевода

FLNP:

5-FU и LY-загруженные липидные наночастицы