Безрастворительные нанонитротину, функционализированные фолиевой кислотой, для таргетированной доставки 10-гидроксикамптотецина

Аннотация

Традиционные наночастицы для гидрофобных противоопухолевых препаратов часто требуют органических растворителей, что вызывает опасения по поводу остаточной токсичности. В данной работе представлен полностью «зеленый» синтез нанонитротину 10-гидроксикамптотецина (HCPT), модифицированных фолиевой кислотой (HFND), который исключает использование органических растворителей и обеспечивает высокую загрузку препарата (70,2 %) и надежную таргетирующую способность. In vitro HFND демонстрируют превосходное клеточное поглощение в клетках HeLa по сравнению с нетаргетированными нанонитротину хитосан-HCPT, а тесты MTT показывают усиленную цитотоксичность при эквивалентных дозах HCPT. In vivo визуализация подтверждает преференциальное накопление HFND в опухоли, а терапевтические исследования на ксенотрансплантах HeLa показывают выраженное подавление роста опухоли при минимальной системной токсичности. Этот безрастворительный подход открывает перспективную платформу для безопасной и эффективной доставки химиотерапевтических препаратов и визуализации.

Введение

За последние два десятилетия исследования сосредоточены на преодолении фармакокинетических ограничений классической химиотерапии через наночастицевые системы доставки, обеспечивающие длительное циркулирование, активную таргетировку и мультимодальную визуализацию [1, 2]. Недавние достижения подчеркнули важность формы частиц: высокоаспектные наноструктуры показывают улучшенную клеточную интернализацию и проникновение в опухоль [10, 26]. Однако большинство стратегий всё ещё зависят от органических растворителей для растворения гидрофобных препаратов, что ведет к накоплению остаточных растворителей в организме и создает риски безопасности [27]. Наше исследование устраняет этот пробел, разрабатывая нанонитротину HCPT, модифицированные фолиевой кислотой, полностью «зеленым», безрастворительным методом, сочетая высокую загрузку препарата, таргетированную доставку и визуализационный потенциал.

Методы

Материалы

Все реактивы были аналитического чистоты и использованы без дополнительной очистки. В качестве растворителя использовалась деионизированная вода. Фолиевую кислоту (FA) приобрели в Bio Basic Inc.; HCPT (чистота > 99 %) — в Lishizhen Pharmaceutical Co.; хитосан (молекулярная масса 70 кДа, степень деацетилирования 90 %) — в Zhejiang Aoxing; NHS и EDC — в Sigma‑Aldrich.

Синтез конъюгата FA-хитосан

FA (10 мг), хитосан (20 мг), EDC (4 мг) и NHS (4 мг) помешивали в 2 мл фосфатно-буферного раствора (pH 5,5) при комнатной температуре в течение 12 ч. Смесь диализировали против буфера pH 10 для удаления избытка FA, затем центрифугировали (5000 об/мин) и лиофилизировали 24 ч для получения порошка CS-FA.

Подготовка HFND

HCPT (10 мкг) растворяли в 200 мкл 0,1 М NaOH (раствор А); CS-FA (10 мкг) — в 200 мкл 0,1 М HCl (раствор Б). Растворы А и Б капельно добавляли в 1 мл чистой воды при интенсивном помешивании в течение 30 с, затем ультразвуковой обработкой (200 Вт, ледяная баня) в течение 6 мин. Полученную суспензию центрифугировали (10 000 об/мин, 5 мин) и лиофилизировали 24 ч. Для сравнения вместо CS-FA в растворе Б использовали чистый хитосан для получения нетаргетированных нанонитротину (ND).

Характеризация

Морфологию изучали с помощью СЭМ (UV‑70, 15 кВ). Размер частиц и дзета-потенциал измеряли на Malvern Zetasizer Nano‑ZS. Рентгеновская дифракция (XRD, X’pert PRO) оценивала кристалличность. Содержание FA определяли УФ-спектроскопией при 281 нм; загрузку HCPT — флуоресценцией при 383 нм. Эффективность загрузки и инкапсуляции рассчитывали по формулам (1)–(4).

Исследование выделения препарата in vitro

HFND диспергировали в 10 мл ФБР и поместили в диализационный мешок (MWCO 3 кДа), затем погрузили в 200 мл ФБР (pH 7,4) при 37 °C, 100 об/мин. Пробы забирали в течение 48 ч и анализировали флуоресценционной спектроскопией.

Конфокальная визуализация клеток

Клетки HeLa посеяли и инкубировали 24 ч перед воздействием HFND в течение 8 ч. Визуализацию проводили на конфокальном микроскопе Leica (возбуждение HCPT 382 нм, эмиссия 500–550 нм).

Количественная оценка клеточного поглощения

После 6-часовой инкубации с ND или HFND (эквівалентные дозы HCPT) клетки промывали, трипсинизировали и ультразвуково обрабатывали. Содержание HCPT определяли флуоресценцией при 382 нм.

Тесты цитотоксичности (MTT)

Клетки HeLa посеяли в 96-колончатых пластинках. После 24-часового воздействия препарата добавляли 20 мкл 5 мг/мл MTT на 4 ч, затем 150 мкл DMSO. Абсорбцию измеряли при 570 нм.

Биодистрибуция

DiR-загруженные ND и HFND внутривенно вводили мышам-нудам с ксенотрансплантами HeLa. Флуоресценционную визуализацию проводили на системе Maestro в 1, 4, 8, 12 и 24 ч. Экзовиво-анализ опухоли и основных органов выполняли в 24 ч.

Подавление роста опухоли in vivo

При достижении объема опухоли ~60 мм³ мышам внутривенно вводили физраствор, свободный HCPT, ND или HFND (80 мкг HCPT на мышь) каждые 3 дня. Объем опухоли (0,5×L×W²) и масса тела отслеживали 21 день. После эвтаназии опухоли взвешивали и окрашивали гемоксилином-эозином для гистологии.

Статистический анализ

Данные анализировали двусторонним t-критерием Стьюдента; значимость при p < 0,05 (95 % доверительный интервал).

Результаты и обсуждение

Синтез конъюгата FA-хитосан

FA ковалентно связали с хитосаном через EDC/NHS-amediрованную амидацию (рис. 1). ФТИР-спектры (рис. 2) показали выраженный пик C=O при 1605 см⁻¹, подтверждающий образование амидной связи. УФ-квантификация дала загрузку FA 23,4 ± 2,5 % в конъюгате.

Подготовка HFND

Использовали нерастворимость HCPT в воде и растворимость хитосана в кислоте: HCPT растворяли в NaOH, CS-FA — в HCl. Нейтрализация двух растворов создавала плохой растворитель для обоих компонентов, вызывая выпадение HCPT и одновременную инкапсуляцию CS-FA в нанонитротину (рис. 3a). Ультразвук и стерическая стабилизация CS-FA предотвращали рост массовых кристаллов, формируя высокоаспектные нанонитротину (рис. 3b–c). Планирование эксперимента (табл. 1) оптимизировало соотношение HCPT:CS-FA, ультразвуковую мощность, pH и концентрацию для получения нужной морфологии.

СЭМ-анализ (рис. 4) показал: избыток CS-FA покрывает поверхность частиц, дефицит — приводит к агрегации. Нейтральный pH критичен для сохранения целостности нанонитротину, ультразвуковая мощность влияет на агрегацию и фрагментацию. Повышение концентрации смеси уменьшает размер частиц, что подтвердило ДЛС (рис. 4f). Оптимизированные HFND имели среднюю длину ~800 нм, ширину ~80 нм, гидродинамический диаметр 104,3 ± 5,7 нм и дзета-потенциал +16,3 ± 1,9 мВ. 2 % дисперсия оставалась стабильной ≥2,5 суток.

Загрузка препарата составила 70,2 ± 3,1 %, эффективность инкапсуляции — 83,1 %. FA составлял 7,0 % от общей массы, рассчитано из процента FA в конъюгате.

Рентгеновская дифракция

XRD-паттерны (рис. 5) подтвердили, что HCPT остается кристалличным в HFND, а полукристалличный хитосан дает широкие пики. В то же время массовые кристаллы HCPT (рис. 6) были стержневидными и >10 мкм, что подчеркивает роль CS-FA в модуляции кинетики роста HCPT.

Выделение препарата in vitro

Свободный HCPT выделял 30 % за 1 ч и почти 100 % к 18 ч. HFND демонстрировали заметно более медленное, устойчивое выделение в течение 48 ч (рис. 7), что объясняется диффузионным барьером оболочки CS-FA. Такой профиль идеален для поддержания терапевтических концентраций при минимизации пиковых токсичностей.

Клеточное поглощение

Конфокальная визуализация (рис. 8) выявила более сильную флуоресценцию HCPT в клетках HeLa, обработанных HFND, по сравнению с нетаргетированными ND, что указывает на фолиат-медированное поглощение. Количественная флуоресценция (рис. 9) подтвердила более высокую скорость интернализации HFND, валидируя таргетирующую стратегию.

Цитотоксичность

Результаты MTT (рис. 10) показали, что HFND обеспечивают более выраженное убийство клеток, чем свободный HCPT или ND, при эквивалентных концентрациях HCPT, подтверждая двойную выгоду таргетированной доставки и устойчивого выделения. Усиленная цитотоксичность связана с эффективной рецептор-медированной интернализацией и пролонгированным внутриклеточным выделением препарата.

Биодистрибуция

In vivo визуализация (рис. 11a) показала пренебрежимо малое сигнал от DiR-ND в опухоли, тогда как DiR-HFND демонстрировали яркое, время-зависимое накопление с пиком в 12 ч. Экзовиво-анализ (рис. 11b–c) подтвердил более высокую флуоресценцию опухоли для HFND, свидетельствуя об успешной фолиат-медированной таргетировке.

Подавление роста опухоли in vivo

HFND обеспечили наиболее значимое подавление роста опухоли, конечные массы опухолей были существенно ниже, чем при свободном HCPT или ND (рис. 12c). Гистология (рис. 12d) выявила обширный некроз в опухолях, обработанных HFND. Важно, HFND не вызывали потери массы тела или явной токсичности, в отличие от выраженных побочных эффектов свободного HCPT (рис. 12b). Эти данные демонстрируют, что HFND сочетают мощную противоопухолевую активность с благоприятным профилем безопасности.

Заключение

Мы представили полностью «зеленый», безрастворительный метод получения фолиат-функционализированных нанонитротину HCPT, сочетающих высокую загрузку препарата, таргетированное клеточное поглощение и устойчивое выделение. In vitro и in vivo данные подтверждают превосходную противоопухолевую активность и сниженную системную токсичность по сравнению с обычными формуляциями. Эта платформа иллюстрирует, как экологически ответственная химия может двигать вперед наночастицевую терапевтику.