Таргетированные фолиево-конъюгированные хитосановые наночастицы доставляют генистеин, повышая противоопухолевую эффективность при раке шейки матки

Аннотация

В этой работе мы спроектировали фолиево-конъюгированные хитосановые наночастицы (FGCN) для доставки натурального изофлавона генистеина (GEN) специфически в клетки рака шейки матки. По сравнению с обычными GEN-загруженными хитосановыми наночастицами (GCN), FGCN имели слегка больший гидродинамический диаметр (~165 нм) и умеренно сниженный заряд поверхности (+21,5 мВ). Обе системы достигали >95 % инкапсуляции препарата и контролируемого выделения в фосфатно-буферном растворе (pH 7,4), высвобождая ~90 % GEN за 24 ч. Исследования клеточного поглощения в клетках HeLa показали статистически значимый (p < 0,05) 2–3-кратный рост интернализации для FGCN по сравнению с GCN, что объясняется высокой аффиностью фолиевой кислоты к переэкспрессированному фолиевому рецептору-α (FR-α). Цитотоксичность: IC₅₀ GEN снизился с 33,8 мкг/мл (свободный препарат) до 14,6 мкг/мл при доставке через FGCN, в то время как GCN снизил до 26,5 мкг/мл. Анализ апоптоза показал, что FGCN индуцируют >55 % апоптотического гибели клеток, заметно выше, чем GCN (~22 %) и свободный GEN. Эти данные подтверждают, что фолиатная конъюгация улучшает доставку GEN, клеточное поглощение и противоопухолевую эффективность в клетках рака шейки матки.

Введение

Рак шейки матки остается ведущей причиной заболеваемости среди женщин во всем мире, в основном из-за высокорискового вируса папилломы человека (ВПЧ). Хотя профилактические вакцины (Gardasil, Cervarix) и стандартные терапии — хирургия, лучевая терапия, химиотерапия — доступны, они недостаточны для многих пациенток, особенно в условиях ограниченных ресурсов. Натуральные соединения, такие как флавоноиды, обладают противоопухолевой активностью при более низкой системной токсичности. Генистеин, соевый изофлавоин, ингибирует протеин-тирозин-киназы и NF-κB, арестовывает клеточный цикл в G2/M и индуцирует апоптоз; однако его клиническая применимость ограничена плохой водорастворимостью (~1,45 мкг/мл) и низкой биодоступностью. Наноинкапсуляция может улучшить эти физико-химические свойства, усилить накопление в опухоли за счет эффекта усиленного проникновения и удержания (EPR) и преодолеть мультилекарственную резистентность.

Хитосан, биоразлагаемый полисахарид, богатый первичными аминами, биосовместим и поддается поверхностной модификации. Конъюгация фолиевой кислоты (FA) с хитосаном таргетирует FA-рецептор-α, переэкспрессированный на многих клетках рака шейки матки, обеспечивая рецептор-медированную эндоцитозу и селективную доставку.

Методы

Материалы

Генистеин (Aladdin Chemicals, Шанхай), хитосан (85 % деацетилированный, Sigma‑Aldrich), фолиевая кислота, EDC, NHS (Sigma‑Aldrich) использовали как получено.

Подготовка GEN-загруженных FA-конъюгированных хитосановых наночастиц

Фолиевую кислоту сначала активировали EDC/NHS в DMSO и конъюгировали с хитосаном (0,5 % масс.) при помешивании при pH 8. Полученный FA-хитосановый конъюгат очищали диализом. GEN, хитосан и FA-хитосан (10:1 масс.) растворяли в DMSO и капельно добавляли в 0,5 % Tween-80 с помешиванием 3 ч. Растворитель удаляли испарением, суспензию центрифугировали 10 000 об/мин (4 °C) 30 мин. Загрузка препарата (DL%) и эффективность инкапсуляции (EE%) рассчитывали по HPLC (Agilent LC-1100, колонка C18, 60 % MeOH/40 % H₂O, 1 мл/мин).

Размер частиц и поверхностная морфология

Динамическое рассеяние света (Malvern Zetasizer Nano ZS90) измеряло размер и полидисперсность. Трансмиссионная электронная микроскопия (JEOL JEM-1230, 100 кВ) визуализировала морфологию.

In vitro выделение препарата

Выделение оценивали диализом (MWCO 3500) в ФБР (pH 7,4) при 37 °C с мягким помешиванием. Пробы забирали в заданные интервалы и анализировали HPLC.

Клеточная культура и поглощение

Клетки HeLa (ATCC) культивировали в DMEM + 10 % FBS. Клеточное поглощение кумарин-6-загруженных GCN и FGCN количественно определяли флуоресценцией на микропластинке (возбуждение 430 нм, эмиссия 485 нм) и визуализировали конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (Olympus Fluoview).

Цитотоксичность, Live/Dead и апоптоз

Жизнеспособность измеряли MTT (5 мг/мл); IC₅₀ подбирали в GraphPad Prism. Live/Dead окраску проводили кальцеином AM/этидиумом гомидимером. Апоптоз количественно оценивали окраской аннексин V/PI и потоковой цитометрией.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± SD (n = 3). Статистическая значимость оценивали t-критерием Стьюдента (p < 0,05).

Результаты и обсуждение

Физико-химическая характеристика

GCN показали средний диаметр 140 нм (+26 мВ), FGCN — 165 нм (+21,5 мВ). Обе имели EE% >95 % и DL% в пределах 10–12 %. Размер и дзета-потенциал оставались стабильными после 3 месяцев хранения при 4 °C.

Кинетика выделения in vitro

И GCN, и FGCN высвобождали ~35–40 % GEN за первые 4 ч, достигая ~90 % кумулятивного выделения за 24 ч. Небольшая задержка выделения у FGCN связана с FA-покрытием, удлиняющим диффузию препарата.

Клеточное поглощение

Флуоресценционные тесты показали 2–3-кратно более высокое поглощение FGCN по сравнению с GCN через 4 ч (p < 0,05). Конфокальные изображения подтвердили интенсивную внутриклеточную флуоресценцию для FGCN, указывая на успешную FA-медированную эндоцитозу.

Цитотоксичность

IC₅₀: свободный GEN 33,8 мкг/мл → GCN 26,5 мкг/мл → FGCN 14,6 мкг/мл (24 ч). Превосходная эффективность FGCN связана с усиленным поглощением и контролируемым выделением, снижающими P-гликопротеин-медированный эффлюкс.

Апоптоз

Аннексин V/PI окраска выявила апоптоз: 0 % (свободный GEN), 22 % (GCN), 55 % (FGCN), подчеркивая силу таргетированной доставки.

Live/Dead анализ

Клетки, обработанные FGCN, демонстрировали минимальную зеленую флуоресценцию и обильное красное окрашивание, согласующееся с высокой гибелью клеток, тогда как клетки с свободным GEN оставались в основном живыми.

Заключение

FA-конъюгированные хитосановые наночастицы значительно улучшают доставку генистеина в клетки HeLa рака шейки матки, усиливают клеточное поглощение, снижают IC₅₀ до 14,6 мкг/мл и индуцируют >55 % апоптоза. Эти результаты поддерживают дальнейшую доклиническую оценку FGCN как перспективной таргетированной противоопухолевой платформы.

Аббревиатуры

EPR

Эффект усиленного проникновения и удержания

FGCN

Фолиево-конъюгированные GEN-загруженные хитосановые наночастицы

FR

Фолиевый рецептор

GCN

GEN-загруженные хитосановые наночастицы

GEN

Генистеин