Токсичность наночастиц CoFe2O4, покрытых ПЭГ, с лечебным эффектом куркумина

Аннотация

В этой работе CoFe ₂ О ₄ наночастицы, покрытые полиэтиленгликолем (ПЭГ), были успешно синтезированы гидротермальным методом. Морфологические исследования образцов подтвердили образование поликристаллической чистой фазы PEG-CoFe ₂ О ₄ наночастицы размером около 24 нм. Токсичность, вызванная CoFe ₂ О ₄ наночастицы были исследованы, и были выполнены биологические анализы для проверки токсичности CoFe ₂ О ₄ наночастицы. Более того, лечебный эффект токсичности, индуцированной у живых организмов, был изучен с использованием куркумина, и было обнаружено, что биохимические показатели детоксикации и улучшаются до своего нормального уровня после приема куркумина. Таким образом, CoFe с покрытием из ПЭГ ₂ О ₄ Синтезированный гидротермальным методом может быть использован в биомедицине, а куркумин, который является природным химическим веществом без побочных эффектов, может использоваться для лечения токсичности, вызванной наночастицами в живых организмах.

Фон

Использование наночастиц (НЧ) дает множество преимуществ благодаря их уникальным химическим и физическим свойствам, которые существенно отличаются от их объемных аналогов [1]. Кобальтовый феррит (CoFe ₂ О ₄ ) как один из наиболее важных магнитных материалов вызвал огромный интерес в наномасштабе из-за его различных применений в новейших технологиях [2,3,4,5]. Он считается одним из конкурентоспособных кандидатов для широкого спектра применений, в основном в медицинской промышленности, из-за его способности обладать желаемыми физическими и химическими свойствами на наномасштабе. Кроме того, CoFe ₂ О ₄ легко и экономично изготавливать с контролируемым составом, формой и размером, необходимыми для конкретного применения. В связи с этим диаметр CoFe ₂ О ₄ наночастицы для биологических применений ниже 100 нм могут сильно влиять на физико-химические свойства и фармакокинетику живых организмов. Более крупные частицы диаметром более 100 нм используются в качестве контрастного вещества для магнитно-резонансной томографии желудочно-кишечного тракта, в то время как более мелкие частицы, менее ~ 20 нм, используются в качестве носителей для лечения опухолей. Для клинического применения наночастиц феррита кобальта очень важно изучить биобезопасность как in vivo, так и in vitro [6, 7]. Многие наночастицы, попадающие в организм перорально или внутривенно, в основном распределяются в печени, почках и легких, что приводит к различным воспалениям в этих органах. По сравнению с другими материалами, феррит кобальта не изучался широко, чтобы изучить его токсичность для живых организмов, а затем его лечебный эффект с использованием куркумина, хотя сообщалось о нескольких других работах по исследованию токсичности и биобезопасности феррита кобальта, покрытого полиэтиленгликолем (PEG). наночастицы.

С точки зрения токсичности, основное беспокойство вызывает чрезмерное воздействие, которое требует удаления накопленных наночастиц из биологических органов, а также требует неотложного лечения воспалительных заболеваний. Некоторые исследователи пытались изучить несколько противовоспалительных препаратов для лечения токсичности наночастиц in vivo, и они обнаружили, что эти противовоспалительные препараты могут способствовать выведению наночастиц, которые накапливаются в организме до определенной степени, чтобы уменьшить или устранить воспалительные эффекты тканей [8, 9]. Куркума длинная (куркума) - традиционное лекарственное растение с довольно долгой историей использования для лечения воспалительных заболеваний в Юго-Восточной Азии. Сообщалось о многочисленных исследованиях антиоксидантных свойств, антимутационных и противоопухолевых эффектов, а также канцерогенных характеристик куркумина [10, 11]. Куркумин обладает способностью заживлять раны, а также лечить заболевания печени, мочевыводящих путей и гепатит [11]. Он снимает окислительный стресс и воспаление при хронических заболеваниях через путь Nrf2-keap1. Куркумин может подавлять провоспалительные пути, связанные с большинством хронических заболеваний, и блокирует как производство TNF, так и передачу клеточных сигналов, опосредованную TNF, в различных типах клеток. Более того, куркумин также может действовать как блокатор TNF in vitro и in vivo, напрямую связываясь с TNF [12].

В этом исследовании мы успешно приготовили CoFe ₂, покрытый ПЭГ. О ₄ наночастицы с контролируемой формой и размером около 25 нм с использованием гидротермального метода. После введения различных экспозиций (доз) CoFe ₂ О ₄ наночастиц, мы изучили анализ крови, окрашивание HE и биораспределение, а также лечебный эффект куркумина на токсичность, вызванную PEG-CoFe ₂ О ₄ наночастицы. В этом исследовании представлен новый подход к изучению токсического действия CoFe ₂ О ₄ наночастицы, а затем лечение токсичности, вызванной PEG-CoFe ₂ О ₄ наночастицы in vivo с использованием куркумина.

Методы

Приготовление наночастиц феррита кобальта

Наночастицы феррита кобальта были синтезированы гидротермальным методом. Для этого достаточное количество нитрата железа и хлорида кобальта растворяли в деионизированной воде, а затем смешивали с водными растворами ПЭГ и гидроксида натрия (NaOH). Бидистиллированная деионизированная вода использовалась в качестве растворителя, чтобы избежать присутствия каких-либо примесей в конечных наночастицах. Смесь перемешивали в течение примерно 30 минут с использованием магнитной мешалки, затем выливали в автоклав и нагревали в течение 6 часов при 180 ° C для проведения гидротермальной реакции. После завершения реакции продукт охлаждали до комнатной температуры, а затем дважды промывали деионизированной водой, а затем этанолом для удаления избытка PEG и других нерастворенных солей, если они присутствовали в растворе. Наконец, продукт сушили при 80 ° C в течение ночи, а затем измельчали в порошок, чтобы получить желаемые наночастицы феррита кобальта. На этом этапе наночастицы оказались аморфными, что было подтверждено рентгеноструктурным анализом, показанным на рис. 2а. Чтобы получить наночастицы в кристаллической форме, образцы затем отжигали при 500 ° C в течение 6 часов, и конечный продукт был получен в виде кристаллического PEG-CoFe ₂ О ₄ наночастиц, что было подтверждено XRD, показанным на рис. 2b.

Маркировка 99mTc PEG-CoFe ₂ О ₄ Наночастицы

Радиомечение CoFe, покрытого ПЭГ ₂ О ₄ Наночастицы были выполнены с 99mTc с использованием хлорида олова (SnCl ₂ ) в качестве восстановителя и растворял наночастицы в деионизированной воде в условиях ультразвуковой обработки в течение примерно 0,5 часа. SnCl ₂ , аскорбиновая кислота и 99mTcO ₄ затем добавляли в суспензию наночастиц (с ферритом кобальта ~ 0,4% по весу). Для получения точных данных подсчет радиоактивных веществ был измерен в течение 24 часов из-за короткого времени жизни 99mTc (~ 6 часов). PH смеси регулировали в диапазоне 5–10, используя 1,0 M NaHCO ₃. решение; затем суспензия PEG-CoFe ₂ О ₄ к нему добавляли, и полученную смесь затем перемешивали при 10000 в течение 25 минут при 80 ° C. После центрифугирования супернатант декантировали, а оставшийся материал был идентифицирован как 99mTc PEG-CoFe ₂ О ₄ . Бумажная хроматограмма (в хроматографических растворах физиологического раствора и ацетона) использовалась для измерения выходов меченых соединений. Было обнаружено, что выход радиоактивной метки наночастиц составляет около 70%, что отражает реальное распределение и метаболизм in vivo.

Биораспределение PEG-CoFe ₂ О ₄ Наночастицы

Мышей Kunming массой 15–18 г были предоставлены Лабораторным центром медицинских наук Университета Ланьчжоу, Ганьсу, Китайская Народная Республика. Все животные содержались в индивидуальных клетках с системой контроля температуры (от 21 до 22 ° C), а свет был включен с 08:00 до 20:00 часов. Мышам давали надлежащий корм и воду, как рекомендовано в соответствии с протоколами о животных Директивой Совета Европейских сообществ от 24 ноября 1986 г. (86/609 / EEC) и одобрено комитетами по уходу за животными и их использованию Центра медицинских животных провинции Ганьсу. и Рекомендации комитетов по животным при университете Ланьчжоу (Китай). Мышей случайным образом разделили на семь групп (по пять мышей в группе), которым внутривенно вводили 99mTc-PEG-CoFe ₂ О ₄ раствора, а затем убивали через 1, 6, 16 и 24 ч после инъекции. Ткани сердца, легких, печени, селезенки и почек были немедленно вскрыты, а затем было собрано значительное количество крови. Каждую ткань завернули в фольгу, правильно взвесили и подсчитали на 99mTc. Точки данных были скорректированы на физический распад радиоактивности. Распределение ткани было представлено в процентах введенной дозы на грамм влажной ткани (% ID / г), который можно было рассчитать как процент введенной дозы (активность ткани / общая доза активности) на грамм влажной ткани.

Влияние дозировки на токсичность PEG-CoFe ₂ О ₄ в мышах

В этом эксперименте 21 мышь была разделена на семь групп (по три мыши на группу). ПЭГ-CoFe ₂ О ₄ наночастицы вводили мышам внутривенно в различных дозах 125, 250 и 350 мкг / мышь (0,2 мл) с контрольной группой, которую лечили физиологическим раствором 0,9%. В группе лечения мышам также внутривенно вводили различные дозы куркумина в 125, 250 и 350 мкг / мышь. Группы повреждений были убиты через 24 часа, в то время как группы обработки были убиты через 3 дня. У мышей собирали кровь и центрифугировали примерно 10 мин для получения сыворотки. Измеряли содержание в сыворотке крови общего билирубина (TB), аланинаминотрансферазы (ALT), аспартаттрансаминазы (AST), азота мочевины крови (BUN), креатинина (CREA) и цистатина C (Cys-C). В то же время сразу были взяты печень, легкие, селезенка, почки и сердце. Эти ткани фиксировали в 10% забуференном формалине и обрабатывали для рутинной гистологии гематоксилином и эозином. Микроскопическое исследование тканей проводилось с использованием микроскопа Olympus Microphot-CX41, соединенного с цифровой камерой.

Результаты и обсуждение

Анализ ПЭМ и XRD

Морфологические характеристики проводились с использованием просвечивающего электронного микроскопа JEOL JEM-1400 и рентгеновского дифрактометра (Shimadzu XRD-7000) с медью K _α как источник излучения. На рис. 1 представлены ПЭМ-изображения наночастиц феррита кобальта, покрытых ПЭГ, с различным разрешением (рис. 1а, б), что подтверждает успешное формирование чистофазных наночастиц феррита кобальта, покрытых ПЭГ, с размером частиц около 24 нм. На рис. 2 представлен рентгеноструктурный анализ полученных наночастиц. На рис. 2а показаны результаты XRD свежеприготовленных образцов, которые показывают, что наночастицы в основном находятся в аморфной форме. Однако, когда образцы были отожжены при высокой температуре (т.е. 500 ° C) в течение 6 часов, было обнаружено, что наночастицы превратились в кристаллическую форму, что можно увидеть на рентгенограмме, представленной на рис. 2b. Средний размер кристаллитов был рассчитан по уширению линии самого сильного пика в рентгеноструктурном анализе (рис. 2b) с использованием уравнения Дебая-Шеррера ( D = Kλ / β cos θ ) [13], что составляет ~ 22 нм. Положения и относительные интенсивности всех наблюдаемых пиков на рентгенограмме указывают на то, что кристаллическая структура способствует образованию кубической шпинельной структуры наночастиц в соответствии с картой JCPDF (карта № 20-1086), показанной на вставке к фиг. 2b. Все пики проиндексированы правильно, и на рентгенограмме не видно никаких дополнительных пиков, что указывает на отсутствие примесей в образцах. Результаты как ПЭМ, так и рентгеновской дифракции подтверждают успешное образование кристаллических наночастиц размером около 22–25 нм.

а , b Изображения наночастиц феррита кобальта, покрытых ПЭГ, полученные с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ), полученные при разном разрешении

Результаты XRD образцов a как подготовлено и б отожженный при 500 ° C. На вставке показана карта JCPDF для феррита кобальта. В полученных данных XRD не видно дополнительных пиков

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье, анализ комбинационного рассеяния света и ТГ

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR) была использована для исследования структурных свойств и распределения катионов наночастиц феррита кобальта. На рис. 3 показан инфракрасный спектр образцов, отобранных при комнатной температуре. Как правило, феррит кобальта имеет две сильные полосы поглощения, ʋ ₁ и ʋ ₂ , которые находятся в диапазоне 400–600 см ⁻¹ [14,15,16], что в нашем случае совершенно очевидно. Верхняя полоса ( ʋ ₁ ) соответствует собственным валентным колебаниям металла (M – O) в узлах тетраэдрической решетки, тогда как нижняя полоса ( ʋ ₂ ) представляет собой валентные колебания ионов металлов в октаэдрических позициях [14,15,16]. Эти результаты показывают успешное формирование наночастиц феррита кобальта с кубической структурой. По данным FTIR, пик равен ~ 3400 см ^-1 четко указывает пик ПЭГ, который подтверждает успешное связывание ПЭГ с наночастицами феррита кобальта.

Инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье (FTIR), используемая в диапазоне 500–4000 см ⁻¹ исследовать структурные свойства образцов. Данные подтверждают наличие наночастиц феррита кобальта, покрытых ПЭГ

Рамановский спектр образцов при комнатной температуре показан на рис. 4, который представляет различные пики в диапазоне 190–684 см ⁻¹ . . Основной пик на высокой частоте (684 см ⁻¹ ) - характерный пик феррита шпинели, относящийся к A _1g мода, соответствующая симметричному растяжению ионов кислорода по связям Fe – O в тетраэдрических узлах [17]. Более низкочастотные пики также принадлежат ферриту кобальта со структурой шпинели. Появление всех этих пиков в спектре комбинационного рассеяния при соответствующих энергиях подтверждает успешное образование кубического CoFe с покрытием из ПЭГ ₂ О ₄ наночастицы.

Рамановский спектр при комнатной температуре образцов, собранных в диапазоне 190–1000 см ⁻¹ частотный диапазон

Термогравиметрический анализ (ТГА) образцов (CoFe ₂ О ₄ , ПЭГ и ПЭГ-CoFe ₂ О ₄ ) проводили при температуре от 50 до 600 ° C, и результаты показаны на рис. 5. Эти термограммы показывают, что CoFe ₂ О ₄ наночастицы теряют свой вес в диапазоне 200–300 ° C, ПЭГ теряет свой вес при температуре ниже 400 ° C, а ПЭГ-CoFe ₂ О ₄ теряет вес в диапазоне температур 200–400 ° C. Видно, что термостабильность ПЭГ относительно низкая (показано справа на рисунке); однако термостабильность PEG-CoFe ₂ О ₄ вроде бы больше 80%. Наночастицы чистого феррита кобальта нерастворимы в воде; однако его можно легко растворить в воде после покрытия PEG из-за его гидрофильной природы, как показано на рис. 6. На рисунке видно, что с течением времени частицы оседают на дне бутылки, что вероятно, это связано с гравитацией наночастиц. На рис. 6 показано изменение во времени растворения наночастиц феррита кобальта, покрытых ПЭГ. В нашем случае мы полностью диспергировали наночастицы в физиологическом растворе перед инъекцией в организм мышей, чтобы обеспечить их правильную доставку в разные органы мышей.

Термогравиметрический анализ (ТГА) чистого CoFe ₂ О ₄ , PEG и CoFe с покрытием PEG ₂ О ₄ взяты в диапазоне температур 50–600 ° C

Растворимость PEG-CoFe ₂ О ₄ наночастицы в деионизированной воде через разные промежутки времени (5, 10, 30 и 60 мин)

Исследования биораспространения

Чтобы точно определить количество наноносителя в каждом органе после введения в живой организм, биораспределение 99mTc PEG-CoFe ₂ О ₄ проводился на нормальных мышах. Видно, что поглощение PEG-CoFe ₂ О ₄ выше в печени и селезенке, как показано на рис. 7, и эти результаты совпадают с данными [18], где поглощение радиоактивно меченного феррита кобальта через 1 час после инъекции в три раза выше в печени и селезенке, чем у других магнитных наночастицы. Причина в том, что ткани, которые связаны с ретикулоэндотелиальными системами, такими как печень и селезенка, в значительной степени поглощают эти инородные частицы, поскольку в этих органах есть клетки Купфера, которые действуют как очищающая функция и играют важную роль в удалении нано- и микроматериалов из кровообращение за счет фагоцитоза [19]. В этой работе наблюдается, что распределение PEG-CoFe ₂ О ₄ в тканях уменьшается с течением времени, это означает, что PEG-CoFe ₂ О ₄ наночастицы со временем выводятся из организма в процессе мочеиспускания. Почки - это система, выделяющая наночастицы с мочой. На рис. 7 максимальное биораспределение в почке наблюдается через 1 ч [20]. Накопление крови было высоким только сразу после инъекции, что указывает на относительно быстрое выведение радиоактивности из пула крови организма, как показано на рис. 7, что аналогично случаю с наночастицами оксида железа, несущими цепи ПЭГ, которые имеют длительное присутствие в крови. бассейн [21, 22]. Кроме того, было обнаружено, что биораспределение в сердце очень низкое, что совпадает с данными, указанными в ссылке [23]. Примечательно, что селезенка является первичным местом разрушения старых красных кровяных телец и последующей рециркуляции связанных с гемоглобином FE [18, 24]. Было замечено, что с течением времени в селезенке активны более медленные, но более эффективные процессы, и они более способны выводить наночастицы из кровотока, что приводит к увеличению концентрации радиоактивности в тканях через 1 час после инъекции. Поглощение легкими PEG-CoFe ₂ О ₄ было незначительным на протяжении всего нашего исследования, как показано на рис. 7. О подобной работе сообщалось в ссылке [23]. Это указывает на то, что никакие микроагрегаты не могут быть необратимо захвачены в капиллярах легких [23, 25, 26].

Биораспределение PEG-CoFe ₂ О ₄ наночастицы в крови, сердце, печени, селезенке, легких и почках после различных интервалов (1, 6, 16 и 24 ч) воздействия на мышей. Планки погрешностей в полученных данных показаны на рисунке

Эффект дозировки PEG-CoFe ₂ О ₄ о токсичности

Чтобы выявить возможные токсические эффекты PEG-CoFe ₂ О ₄ , мы провели биохимический тест на мышах in vivo. Для этого вводили смешанный раствор физиологического раствора и PEG-CoFe ₂. О ₄ различных количеств (150, 250 и 350 мкг) и умерщвляли мышей через 24 часа. Для анализа крови кровь собирали и центрифугировали в течение примерно 10 мин для получения сыворотки. Были протестированы различные параметры с акцентом на маркеры функции печени и почек, включая Cys-C, CREA, ALT, AST, TB и BUN. Затем эти параметры сравнивали с контрольными группами с помощью программного обеспечения SPSS ( p <0,05 обозначает значительную разницу), и результаты показаны на рис. 8. Значительную разницу можно увидеть в ALT, BUN и CREA-A между экспериментальной и контрольной группами. Видно, что TB и Cys-C, которые в основном отвечают за биомаркер функционального состояния почек, значительно уменьшились при воздействии 150 мкг на мышь PEG-CoFe ₂ О ₄ и было обнаружено, что он увеличивается на 250 мкг на дозу мыши, тогда как нормальный уровень составляет 350 мкг на мышь. Это говорит о том, что в определенной степени на функцию почек влияет воздействие PEG-CoFe ₂ О ₄ но не повредил ткани значительно. AST, который является биомаркером здоровья печени, значительно снизился при воздействии всех доз, что указывает на то, что он может влиять на функцию печени в большей степени по сравнению с мышами контрольной группы. Из всех этих результатов ясно, что PEG-CoFe ₂ О ₄ дозировка 250 мкг / мышь вызывает относительно большее повреждение. Поэтому для дальнейших анализов и тестов в нашем эксперименте мы использовали 250 мкг / мышь PEG-CoFe ₂ О ₄ дозировка.

Биохимические показатели содержания в сыворотке крови после различных дозировок (в мкг) PEG-CoFe ₂ О ₄ воздействие на мышей с полосами ошибок, показанными на рисунке

Влияние куркумина на токсичность PEG-CoFe ₂ О ₄

В этом исследовании куркумин использовался для уменьшения воспаления и повреждения эффекта PEG-CoFe ₂ О ₄ . Чтобы изучить влияние куркумина на токсичность PEG-CoFe ₂ О ₄ , измеряли биохимические показатели и гистологию тканей мышей. Эти биохимические индексы включают BUN, CREA, Cys-C, ALT, AST и TB в сыворотке мышей экспериментальной группы. Видно, что BUN, CREA, Cys-C и AST показывают значительное снижение различных доз куркумина по сравнению с группой воздействия, тогда как при дозировке куркумина 150 мкг / мышь ALT, AST и CREA приходят к нормальный уровень по сравнению с контрольной группой, как показано на рис. 9. При содержании ТБ и АЛТ все дозы куркумина показывают значительное снижение по сравнению с группой воздействия PEG-CoFe ₂ О ₄ . На рис. 9 результаты показывают, что куркумин оказывает положительный лечебный эффект на повреждение PEG-CoFe ₂. О ₄ у мышей и разные дозировки куркумина показывают лучший лечебный эффект. В этой работе исследуется защитный эффект куркумина против сывороточного уровня ферментов печени (АЛТ и АСТ) и ферментов почек (АМК, CREA, Cys-C и TB). В этом исследовании PEG-CoFe ₂ О ₄ значительно увеличил сывороточный уровень ферментов ALT, AST, BUN, CREA, Cys-C и TB по сравнению с контрольной группой, который в основном приблизился к нормальному уровню после введения куркумина. Некроз или повреждение клеточной мембраны могут вызвать выброс этих ферментов в кровь. Однако уровень этих ферментов в сыворотке крови связан с работой печени и почек. В группах, получавших куркумин, количество этих ферментов было снижено, что указывает на защитные эффекты куркумина против токсичности PEG-CoFe ₂ О ₄ наночастицы. Это связано с антиоксидантным действием куркумина, который снижает окислительный стресс. Более того, TNF-α и IL-1 играют роль в индукции некроза печени. Таким образом, куркумин может снизить эффект токсичности, подавляя секрецию макрофагами TNF-α и IL-1 [11]. Эти результаты согласуются с другими результатами, приведенными в ссылке [27].

Биохимические показатели содержания в сыворотке мышей, получавших куркумин, с полосами ошибок, указанными на графике

Гистопатологический анализ печени, почек и селезенки также был проведен, чтобы проверить возможные токсические эффекты, вызванные введением наночастиц. У каждой мыши удаляли органы, обрабатывали 10% формалином и заливали парафином. Пятимикронные срезы окрашивали гематоксилин-эозином (H&E) и исследовали под микроскопом. Результаты показывают, что никаких соответствующих гистопатологических изменений не было зарегистрировано в проанализированных органах, которые показаны на рис. 10. Исследования печени и селезенки показали, что введение наночастиц феррита кобальта не повлияло на архитектуру органа. Это связано с двумя возможными причинами:во-первых, размер наночастиц относительно больше (например, 24 нм), а во-вторых, мы дали небольшую дозу наночастиц феррита кобальта (например, 150, 250 и 350 мкм) и убили мышей через 24 ч. Таким образом, это влияет только на функцию органов, но не влияет на его архитектуру. Это похоже на случай, описанный авторами в ссылке [28], где они давали 20 мг / кг (выше, чем в нашем случае) в течение 7 дней. Точно так же в другом случае, описанном в [29], не было обнаружено гистопатологических изменений в органах.

Гистологические срезы тканей после воздействия PEG-CoFe ₂ О ₄ или куркумин мышам

Заключение

В этой работе мы успешно изготовили 24 нм наночастицы феррита кобальта, покрытые ПЭГ, с использованием гидротермального метода. Токсичность, индуцированная в различных органах мышей при использовании различных доз наночастиц феррита кобальта ПЭГ, была подробно исследована, а затем изучено ее лечебное действие с использованием куркумина. Были проведены биологические анализы для проверки токсичности CoFe ₂ О ₄ наночастицы. Положительные изменения наблюдались в биохимических показателях после лечения куркумином, которые либо пришли к норме, либо существенно снизились. Это исследование показывает, что CoFe с покрытием из ПЭГ ₂ О ₄ Синтезированный с помощью гидротермального метода является хорошей моделью для носителя лекарства, а куркумин, который является природным химическим веществом и не имеет побочных эффектов, может быть использован для лечения токсичности, а также других заболеваний живых организмов.