PEG-CoFe₂O₄ наночастицы: оценка токсичности и защитный эффект куркумина

Аннотация

В данной работе наночастицы CoFe₂O₄, покрытые полиэтиленгликолем (PEG), были успешно синтезированы гидротермальным методом. Морфологические исследования подтвердили образование поликристаллических чистофазовых наночастиц PEG-CoFe₂O₄ размером около 24 нм. Была изучена токсичность, индуцируемая наночастицами CoFe₂O₄, и проведены биологические тесты для оценки токсического воздействия. Кроме того, исцеляющий эффект токсичности в живых организмах изучали с использованием куркумина; установлено, что биохимические показатели детоксицировались и улучшились до нормального уровня после введения куркумина. Таким образом, PEG-покрытые наночастицы CoFe₂O₄, полученные гидротермальным способом, могут использоваться в биомедицинских приложениях, а куркумин — натуральное вещество без побочных эффектов — может применяться для лечения токсичности, вызванной наночастицами в живых организмах.

Введение

Использование наночастиц (НЧ) предлагает множество преимуществ благодаря их уникальным химическим и физическим свойствам, существенно отличающимся от свойств объемных материалов [1]. Кобальтовые ферриты (CoFe₂O₄) как один из важнейших магнитных материалов вызывают огромный интерес в наномасштабе из-за широкого спектра применения в современных технологиях [2–5]. Они считаются конкурентоспособными кандидатами для медицинской промышленности благодаря возможности контроля физико-химических свойств в наномасштабе. Более того, CoFe₂O₄ легко и недорого синтезируются с заданным составом, формой и размером. Диаметр наночастиц CoFe₂O₄ для биологических применений ниже 100 нм сильно влияет на фармакокинетику в живых организмах. Частицы больше 100 нм используются как контрастные агенты для МРТ желудочно-кишечного тракта, а частицы меньше ~20 нм — как носители для лечения опухолей. Для клинического применения кобальтовых ферритных наночастиц критически важно исследование биобезопасности in vivo и in vitro [6, 7]. Многие наночастицы, введенные перорально или внутривенно, аккумулируются в печени, почках и легких, вызывая воспаления. Токсичность кобальтовых ферритов изучена недостаточно, особенно в контексте лечения куркумином, хотя есть работы о биобезопасности PEG-покрытых наночастиц.

С точки зрения токсичности, главная проблема — чрезмерное накопление наночастиц в органах и необходимость срочного лечения воспалительных расстройств. Некоторые исследователи изучали противовоспалительные препараты для лечения наночастиц in vivo и обнаружили, что они способствуют выведению накопленных наночастиц, снижая тканевые воспаления [8, 9]. Curcuma longa (куркума) — традиционное лекарственное растение с длительной историей применения при воспалительных заболеваниях в Юго-Восточной Азии. Многочисленные исследования подтвердили антиоксидантные, антимутагенные, антиопухолевые и канцерогенные свойства куркумина [10, 11]. Куркумин заживляет раны, лечит заболевания печени, мочевыделительной системы и гепатит [11]. Он снижает окислительный стресс и воспаление при хронических заболеваниях через путь Nrf2-keap1. Куркумин подавляет про-воспалительные пути, блокирует производство TNF и сигнальные каскады, посредствованные TNF, в различных типах клеток. Кроме того, куркумин может действовать как блокер TNF in vitro и in vivo, связываясь с ним напрямую [12].

В данном исследовании успешно получены PEG-покрытые наночастицы CoFe₂O₄ контролируемой формы и размера ~25 нм гидротермальным методом. После введения различных доз наночастиц проводился анализ крови, ГЭ-окраска, биодистрибуция и изучение лечебного эффекта куркумина на токсичность PEG-CoFe₂O₄. Работа представляет новый подход к исследованию токсичности CoFe₂O₄ и её лечению куркумином in vivo.

Методы

Синтез наночастиц кобальтовых ферритов

Наночастицы кобальтовых ферритов синтезировали гидротермально. Нитрат железа и хлорид кобальта растворили в деионизированной воде, смешали с водными растворами PEG и гидроксида натрия (NaOH). В качестве растворителя использовалась двужды дистиллированная деионизированная вода для исключения примесей. Смесь перемешивали магнитным мешалкой 30 мин, затем помещали в автоклав и нагревали 6 ч при 180 °C. После завершения реакции продукт остывали до комнатной температуры, вымывали дважды деионизированной водой и затем этанолом для удаления излишков PEG и нерастворенных солей. Продукт сушили при 80 °C в течение ночи и измельчали в порошок. На этом этапе наночастицы были аморфными (подтверждено XRD, рис. 2a). Для получения кристаллической формы образцы отжигали при 500 °C в течение 6 ч; итоговый продукт — кристаллические наночастицы PEG-CoFe₂O₄ (подтверждено XRD, рис. 2b).

Маркировка ⁹⁹ᵐTc PEG-CoFe₂O₄ наночастиц

Радиомаркировка PEG-покрытых наночастиц CoFe₂O₄ изотопом ⁹⁹ᵐTc проводили с использованием хлорида олова (SnCl₂) в качестве восстановителя. Наночастицы растворяли в деионизированной воде под ультразвуком 0,5 ч. Затем добавляли SnCl₂, аскорбиновую кислоту и ⁹⁹ᵐTcO₄⁻ в суспензию (содержание кобальтовых ферритов ~0,4% по массе). Измерения радиоактивности проводили в течение 24 ч из-за короткого полураспада ⁹⁹ᵐTc (~6 ч). pH смеси корректировали в диапазоне 5–10 раствором NaHCO₃ (1,0 M); затем добавляли суспензию PEG-CoFe₂O₄ и перемешивали при 10 000 об/мин в течение 25 мин при 80 °C. После центрифугирования над supernatант удаляли, а остаток идентифицировали как ⁹⁹ᵐTc PEG-CoFe₂O₄. Выход радиомаркировки составил около 70%, что отражает реальную распределение и метаболизм in vivo.

Биодистрибуция PEG-CoFe₂O₄ наночастиц

Мышей линии Kunming (15–18 г) получали из Лабораторного центра медицинской науки Университета Ланьчжоу. Животные содержали в индивидуальных клетках при 21–22 °C, световой режим 08:00–20:00. Корм и вода соответствовали директиве ЕС 86/609/EEC и одобрены комитетами по биологическим ресурсам провинции Гансу и Университета Ланьчжоу. Мышей случайно распределяли на 7 групп (5 особей/группу), вводили внутривенно раствор ⁹⁹ᵐTc-PEG-CoFe₂O₄ и умиравливали через 1, 6, 16 и 24 ч. Ткани сердца, легких, печени, селезенки и почек изымали, взвешивали и считали радиоактивность ⁹⁹ᵐTc. Данные корректировали на физический распад. Распределение в тканях выражали в % введенной дозы на грамм влажной ткани (%ID/g).

Влияние дозы PEG-CoFe₂O₄ на токсичность у мышей

21 мышь делили на 7 групп (3 особи/группу). PEG-CoFe₂O₄ вводили внутривенно в дозах 125, 250 и 350 мкг/мышь (0,2 мл) с контрольной группой (физраствор 0,9%). В группах лечения вводили куркумин в тех же дозах. Группы повреждения умиравливали через 24 ч, группы лечения — через 3 дня. Кровь центрифугировали 10 мин для получения сыворотки. Определяли содержание общего билирубина (ОБ), АЛТ, АСТ, мочевины (BUN), креатинина (CREA) и цистатина C (Cys-C). Одновременно изымали печень, легкие, селезенку, почки и сердце, фиксировали в 10% буферизованном формалине и окрашивали гемоксилином и эозином. Микроскопию проводили на микроскопе Olympus Microphot-CX41 с цифровой камерой.

Результаты и обсуждение

TEM и XRD анализ

Морфологию изучали на ТЭМ JEOL JEM-1400 и рентгеновском дифрактометре Shimadzu XRD-7000 (Cu Kα). Рис. 1 показывает ТЭМ-изображения PEG-покрытых наночастиц кобальтовых ферритов в разных разрешениях (рис. 1a, b), подтверждающие образование чистофазовых наночастиц размером ~24 нм. Рис. 2 демонстрирует рентгеновскую дифракцию. Рис. 2a — аморфное состояние асинхронизированных образцов. После отжига при 500 °C в течение 6 ч наночастицы кристаллизуются (рис. 2b). Средний кристаллитный размер по уравнению Дебая-Шеррера (D = Kλ / βcosθ) составил ~22 нм. Пики соответствуют кубической шпинельной структуре по карте JCPDF № 20-1086 (вставка на рис. 2b). Примеси отсутствуют. TEM и XRD подтверждают кристаллические наночастицы 22–25 нм.

FTIR, Раман и ТГ анализ

ФТИР-спектроскопия использовалась для изучения структурных свойств и катионного распределения. Рис. 3 — ИК-спектр при комнатной температуре. Кобальтовый феррит имеет две сильные полосы поглощения ν₁ и ν₂ в диапазоне 400–600 см⁻¹ [14–16], четко наблюдаемые в нашем случае. Высокая полоса (ν₁) соответствует растягивающим колебаниям металл-кислород (M–O) в тетраэдрических узлах, низкая (ν₂) — в октаэдрических [14–16]. Результаты подтверждают кубическую структуру наночастиц. Пик при ~3400 см⁻¹ указывает на PEG, подтверждая успешное покрытие.

Рамановский спектр (рис. 4) показывает пики в диапазоне 190–684 см⁻¹. Основной пик 684 см⁻¹ характерен для шпинельных ферритов (мода A₁g), соответствующий симметричному растяжению ионов кислорода вдоль связей Fe–O в тетраэдрических позициях [17]. Остальные пики также принадлежат шпинельной структуре CoFe₂O₄. Наличие всех пиков подтверждает формирование PEG-покрытых кубических CoFe₂O₄.

Термогравиметрический анализ (ТГА) образцов (CoFe₂O₄, PEG, PEG-CoFe₂O₄) в диапазоне 50–600 °C представлен на рис. 5. CoFe₂O₄ теряет массу при 200–300 °C, PEG — ниже 400 °C, PEG-CoFe₂O₄ — 200–400 °C. Термическая стабильность PEG-CoFe₂O₄ превышает 80%. Чистый CoFe₂O₄ нерастворим в воде, но после покрытия PEG растворяется благодаря гидрофильности (рис. 6). Со временем частицы осаждаются на дно под действием гравитации. Рис. 6 показывает динамику растворения. Перед инъекциями наночастицы полностью диспергировали в физрастворе для равномерной доставки в органы мышей.

Исследования биодистрибуции

Для точной квантификации наноносителей в органах проводили биодистрибуцию ⁹⁹ᵐTc PEG-CoFe₂O₄ у нормальных мышей. Наблюдается высокая аккумуляция в печени и селезенке (рис. 7), что согласуется с данными [18], где аккумуляция радиомаркированных кобальтовых ферритов в печени и селезенке в 3 раза выше, чем других магнитных наночастиц. Причина — ретикулоэндотелиальная система (ретикулоциты, купферовские клетки) в печени и селезенке fagоцитирует чужеродные частицы [19]. Распределение PEG-CoFe₂O₄ в тканях со временем уменьшается, что указывает на выведение с мочой. Максимальная биодистрибуция в почках наблюдается через 1 ч [20]. Накопление в крови высоко только сразу после инъекции, указывая на быстрый клиренс из кровотока (рис. 7), аналогично оксиду железа с PEG-цепочками [21, 22]. В сердце биодистрибуция очень низка [23]. Селезенка — первичный центр разрушения старых эритроцитов и переработки гемоглобина [18, 24]. Со временем в селезенке активируются более медленные, но эффективные процессы устранения наночастиц, что приводит к увеличению радиоактивности после 1 ч. Захват в легких незначителен (рис. 7), что исключает необратимое застревание микроагрегатов в легочных капиллярах [23, 25, 26].

Дозозависимый эффект токсичности PEG-CoFe₂O₄

Для выявления потенциальной токсичности проводили биохимические тесты in vivo. Вводили смесь физраствора и PEG-CoFe₂O₄ в дозах 150, 250 и 350 мкг, умиравливали мышей через 24 ч. Для анализа крови сыворотку отделяли центрифугированием 10 мин. Тестировали маркеры функции печени и почек: Cys-C, CREA, АЛТ, АСТ, ОБ, BUN. Результаты сравнивали с контролем (SPSS, p < 0,05), рис. 8. Выявлены значимые различия в АЛТ, BUN и CREA между группами воздействия и контролем. ОБ и Cys-C (маркеры почечной функции) значимо снижались при дозе 150 мкг/мышь, повышались при 250 мкг и возвращались к норме при 350 мкг. Это говорит о том, что функция почек затрагивается, но ткани не повреждаются существенно. АСТ (маркер печени) значимо снижался при всех дозах, что указывает на более сильное воздействие на печеночную функцию. Доза 250 мкг/мышь показала наибольший ущерб, поэтому для дальнейших экспериментов использовали именно её.

Эффект куркумина на токсичность PEG-CoFe₂O₄

Куркумин использовали для снижения воспаления, вызванного PEG-CoFe₂O₄. Исследовали биохимические показатели и гистологию тканей мышей группы лечения. Показатели: BUN, CREA, Cys-C, АЛТ, АСТ, ОБ в сыворотке. BUN, CREA, Cys-C и АСТ значимо снижались при разных дозах куркумина по сравнению с группой воздействия. При дозе 150 мкг/мышь АЛТ, АСТ и CREA возвращались к уровню контроля (рис. 9). По ОБ и АЛТ все дозы куркумина давали значимое снижение относительно группы воздействия. Результаты показывают позитивный лечебный эффект куркумина на повреждение PEG-CoFe₂O₄. Куркумин защищает от роста сывороточных ферментов печени (АЛТ, АСТ) и почек (BUN, CREA, Cys-C, ОБ). PEG-CoFe₂O₄ значимо повышал уровень этих ферментов по сравнению с контролем, а после введения куркумина они приближались к норме. Некроз или повреждение клеточных мембран вызывает выброс ферментов в кровь; их снижение при куркумине свидетельствует о гепатопротекторном и нефропротекторном действии. Это связано с антиоксидантным эффектом куркумина, снижающим окислительный стресс. Кроме того, TNF-α и IL-1 индуцируют гепаточный некроз; куркумин ингибирует секрецию этих цитокинов макрофагами [11]. Данные согласуются с [27].

Гистопатологический анализ печени, почек и селезенки также проводили для верификации токсических эффектов. Органы фиксировали в 10% формалине, вкладывали в парафин, делали 5-мкм срезы, окрашивали H&E и изучали микроскопически. Значимых гистопатоологических изменений не выявлено (рис. 10). Архитектура печени и селезенки не нарушалась. Возможные причины: размер наночастиц относительно велик (24 нм), а дозы малы (150, 250, 350 мкг) и срок наблюдения короток (24 ч). Это влияет на функцию органов, но не на их архитектуру. Аналогичные результаты в [28] (20 мг/кг в течение 7 дней) и [29] (нет гистопатоологических изменений).

Заключение

Успешно изготовлены 24-нм PEG-покрытые наночастицы кобальтовых ферритов гидротермальным методом. Детально изучена токсичность различных доз в органах мышей, а исцеляющий эффект — с куркумином. Биологические тесты подтвердили токсичность CoFe₂O₄. После лечения куркумином биохимические показатели нормализовались или значимо снизились. PEG-CoFe₂O₄, синтезированные гидротермально, являются хорошей моделью лекарственного носителя, а куркумин — натуральное вещество без побочных эффектов — может использоваться для лечения токсичности наночастиц и других заболеваний in vivo.

Аббревиатуры

АЛТ:

Аланинаминотрансфераза

АСТ:

Аспартатаминотрансфераза

BUN:

Мочевина крови

CREA:

Креатинин

Cys-C:

Цистатин C

FTIR:

Фурье-преобразование ИК-спектроскопии

H&E:

Гемоксилин-эозин

NPs:

Наночастицы

Nrf2:

Ядерный фактор эриtroид 2-связанный фактор 2

PEG:

Полиэтиленгликоль

ОБ:

Общий билирубин

TEM:

Протонная электронная микроскопия

TGA:

Термогравиметрический анализ

TNF:

Некрозный фактор опухоли

XRD:

Рентгеновская дифракция