Кальций-зависимое выделение эксополимерных веществ морскими фитопланктонами при воздействии инженерных наночастиц

Аннотация

Инженерные наночастицы (ИНЧ) стремительно внедряются в потребительские продукты, однако их влияние на морские экосистемы до сих пор недостаточно изучено. Мы исследовали реакцию четырех видов диатомовых водорослей — Odontella mobiliensis, Skeletonema grethae, Phaeodactylum tricornutum и Thalassiosira pseudonana — и одной зеленой водоросли Dunaliella tertiolecta на модельные ИНЧ: TiO₂ (25 нм), SiO₂ (10–20 нм) и CeO₂ (15–30 нм). ИНЧ SiO₂ усилили выделение эксополимерных веществ (ЭПВ) на 200–800 %, тогда как TiO₂ вызвал наименьшее выделение ЭПВ. Одновременно внутриклеточные концентрации Ca²⁺ значительно увеличились при воздействии ИНЧ, что указывает на Ca²⁺-зависимый секреторный путь. Раскрытие этого механизма создает основу для разработки стратегий снижения потенциальных экологических рисков ИНЧ в морской среде.

Введение

Инженерные наночастицы (ИНЧ) размером 1–100 нм являются неотъемлевой частью таких продуктов, как чернила, краски, косметика и фармацевтика. В 2017 г. финансирование нанотехнологий в США достигло 1,4 млрд долларов, отражая рост отрасли [1–3]. Поскольку ИНЧ неизбежно попадают в водные системы, их высокая поверхностная реактивность вызывает опасения по поводу генерации реактивных форм кислорода (РФК) и других токсикологических эффектов [5–6]. Морской фитопланктон, первичные производители океана, проявили чувствительность к ИНЧ, с документированными вредными эффектами на рост и жизнеспособность [7–11]. Однако клеточные ответы фитопланктона на различные ИНЧ не полностью определены [12–21]. Фитопланктон регулярно производит эксополимерные вещества (ЭПВ) — сложный набор полисахаридов и белков, которые медиацию формирования биопленок, связывание металлов и защиту от экологических стрессоров [22–27]. Выделение ЭПВ часто является стрессовым ответом, и кальциевый (Ca²⁺) сигнальный путь вовлечен в регуляцию выделения ЭПВ у диатомовых [28–31]. Хотя ИНЧ могут нарушать внутриклеточные Ca²⁺-пути [29,32–34], систематической оценки Ca²⁺-посреднического выделения ЭПВ в ответ на TiO₂, SiO₂ или CeO₂ не проводилось.

Результаты и обсуждение

Характеризация ИНЧ

Динамическое рассеяние света (ДРС) показало, что частицы TiO₂ преимущественно имеют размер 25 нм, SiO₂ — 10–20 нм, а CeO₂ — 15–30 нм (рис. 1). Мелкие субпопуляции до 70 нм, вероятно, результатом агрегации. Эти измерения подтвердили спецификации производителя и обеспечили согласованность экспериментов.

Рисунок 1. Распределение размеров TiO₂ (а), SiO₂ (б) и CeO₂ (в) в среде L1 после ультразвуковой обработки. Концентрация: 1 мкг/мл.

ИНЧ вызывают повышение внутриклеточного Ca²⁺

Визуализация с использованием Fluo-4AM продемонстрировала, что 1 мг/мл SiO₂ увеличил внутриклеточный Ca²⁺ на 50–300 %, CeO₂ — на 150–200 %, а TiO₂ — примерно на 40 % во всех испытуемых видах (рис. 2). TiO₂ вызвал лишь незначительные изменения Ca²⁺, что, вероятно, отражает его выраженную цитотоксичность и связанную гибель клеток [37–39]. Эти результаты устанавливают, что различные ИНЧ вызывают вид-специфическую Ca²⁺-сигнализацию, необходимую для последующего выделения ЭПВ.

Рисунок 2. Внутриклеточные Ca²⁺-ответы в Dunaliella tertiolecta (а), Thalassiosira pseudonana (б), Skeletonema grethae (в), Phaeodactylum tricornutum (г) и Odontella mobiliensis (д) после 48-часового воздействия 1 мг/мл TiO₂ (зеленый), SiO₂ (красный), CeO₂ (фиолетовый) и контроль (синий). Данные представляют средние значения по 20 клеткам.

Выделение ЭПВ, индуцированное ИНЧ

С использованием ферментно-связанного лектинового анализа (ELLA) мы количественно определили выделение ЭПВ, нормализованное к общему геномному ДНК. SiO₂ стимулировал выделение ЭПВ до 1000 % в Skeletonema grethae и 900 % в Phaeodactylum tricornutum, с увеличением 500–800 % в остальных видах (рис. 3). TiO₂ вызвал значимое выделение ЭПВ только в Skeletonema и Phaeodactylum, что соответствует его ограниченному Ca²⁺-ответу. CeO₂ оказал умеренное воздействие на все таксоны. Величина выделения ЭПВ сильно коррелировала с наблюдаемыми повышениями Ca²⁺, подтверждая Ca²⁺-зависимую модель секреции.

Рисунок 3. Выделение ЭПВ каждым видом фитопланктона при обработке TiO₂ (круги), SiO₂ (треугольники) и CeO₂ (квадраты) в концентрациях от 10 мкг/мл до 5 мг/мл. Значения — среднее ± SD (n = 3).

Заключение

Наше исследование демонстрирует, что инженерные наночастицы, особенно SiO₂, могут провоцировать существенное, Ca²⁺-посредническое выделение ЭПВ в морском фитопланктоне. Этот ответ варьируется между видами и типами наночастиц, подчеркивая сложность взаимодействий наноматериалов с биотами. Будущие исследования должны расширить эти выводы на природные морские воды и оценить экологические последствия измененной динамики ЭПВ, такие как формирование биопленок и сестрерование загрязнителей.

Методы

Культуры фитопланктона (Odontella mobiliensis, Dunaliella tertiolecta, Skeletonema grethae, Phaeodactylum tricornutum, Thalassiosira pseudonana) выращивали в среде L1 при 24 °C при цикле свет:тьма 14:10 ч. ИНЧ (TiO₂, SiO₂, CeO₂) ультразвуково обрабатывали в воде, реконституировали в фильтрованной среде L1 и характеризовали методом ДРС (Brookhaven BI-200SM). Клетки экспонировали ИНЧ (10 мкг/мл – 5 мг/мл) в течение 48 ч в 96-колодчатых пластинках; ЭПВ собирали из супернатантов и количественно определяли методом ELLA с конъюгатом конканавалина А–HRP. Внутриклеточный Ca²⁺ измеряли красителем Fluo-4AM на микроскопе Nikon Eclipse TE2000-U. Содержание ДНК определяли на NanoDrop после экстракции набором ZR-96 Quick-gDNA. Статистический анализ проводили в GraphPad Prism, сообщая средние ± SD из минимум трех независимых реплик.