hGC33-направленные сорафениб наночастицы синергистически ингибируют гепатому через подавление Wnt-пути

Аннотация

Доставка опухоль-специфических ингибиторов является проблемой в лечении рака. Антитела-модифицированные наночастицы могут доставлять загруженные лекарственные препараты к опухолевым клеткам, переэкспрессирующим специфические опухолевые ассоциированные антигены. Здесь мы построили наночастицы из полиэтиленгликоль-b-PLGA полимера, загруженные сорафенибом, модифицированные антителом hGC33 к глипикану-3 (GPC3+), мембранному белку, переэкспрессируемому в гепатоцеллюлярной карциноме. Мы обнаружили, что hGC33-модифицированные НЧ (hGC33-SFB-NP) нацеливаются на GPC3+ клетки гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) за счет специфического связывания с GPC3 на поверхности клеток ГЦК, ингибируют Wnt-индуцированную сигнальную трандукцию, и ингибируют клетки ГЦК в фазе G0/1 за счет понижения экспрессии циклина D1, тем самым ослабляя миграцию клеток ГЦК путем ингибирования эпителиально-мезенхимального перехода. hGC33-SFB-NP ингибируют миграцию, прогрессию клеточного цикла и пролиферацию клеток ГЦК путем ингибирования пути Ras/Raf/MAPK и Wnt-пути в тандеме с GPC3 молекулами соответственно. hGC33-SFB-NP ингибируют рост рака печени ин vivo и улучшают выживаемость мышей-носителей опухоли. Мы заключаем, что hGC33 увеличивает нацеливание SFB-NP на клетки ГЦК. hGC33-SFB-NP синергистически ингибируют прогрессирование ГЦК путем блокирования Wnt-пути и пути Ras/Raf/MAPK.

Введение

Глипикан-3 (GPC3) — гепарансульфатный протеогликан, экспрессируемый на поверхности клеток через механизм, включающий глицеринофосфатидиниозитоловые якоря [1]. Хотя GPC3 экспрессируется в различных тканях в ходе развития, его экспрессия хотя бы частично подавляется в большинстве взрослых тканей ДНК-метиляцией в промоторной области [2]. Однако белок GPC3 переэкспрессируется примерно у 70% пациентов с гепатоцеллюлярной карциномой (ГЦК) [3, 4] и стимулирует классическую Wnt-сигнальную трандукцию [5] через взаимодействие с Wnt-лигандом, что способствует связыванию Wnt/frizzled для стимуляции роста ГЦК [6]. Активация классического Wnt-сигнального пути является одним из самых частых событий, ассоциированных с злокачественным преобразованием ГЦК [7, 8]. Основываясь на способности GPC3 усиливать Wnt-сигналинг, мы предположили, что переэкспрессия GPC3 способствует росту ГЦК за счет стимуляции классического Wnt-пути.

Терапевтическое моноoclonalное антитело, распознающее эпитоп в C-терминальной части GPC3 (524–563) (hGC33), ингибирует рост опухоли в субкутанных ксенотрансплантатах HepG2 и Huh-7 у мышей [9, 10]. hGC33 был гуманизирован путем трансплантации комплементарно-определяющих регионов, и его антиопухолевое действие так же эффективно, как hGC33 для ксенотрансплантации HepG2, и hGC33 использовался в клинических испытаниях [11]. Эти результаты указывают на важную антиопухолевую активность hGC33, и анти-GPC3 лечение будет напрямую ингибировать пролиферацию и/или выживание клеток ГЦК путем блокирования Wnt и/или других сигнальных путей.

Однако из-за сложного патогенеза ГЦК, эффективность блокирования только GPC3 ограничена [12]. Поэтому изучение детального механизма патогенеза ГЦК и выявление перспективных биомаркеров для диагностики и прогноза ГЦК может помочь обеспечить эффективные терапевтические мишени и улучшить прогноз пациентов. Предлагалось, что анти-GPC3 антитела могут повысить чувствительность ГЦК к химиотерапевтическим препаратам [13]. Антиопухолевая активность hGC33 в комбинации со стандартными химиотерапевтическими препаратами недавно оценивалась [14]. Сорафениб — новый пероральный целевой препарат от ГЦК, который может напрямую ингибировать пролиферацию опухолевых клеток путем блокирования клеточного сигнального пути, посредствованного RAF/MEK/ERK, для сдерживания роста опухоли [15, 16]. Однако нетаргетное распределение сорафениба ин vivo и аномально активированные Wnt-сигналы в ГЦК ограничивают эффективность препарата и увеличивают его побочные эффекты [14–16]. Wnt связывается с рецепторами семейства Frizzled для активации внутриклеточной сигнальной трандукции, регулирующей пролиферацию клеток, апоптоз и миграцию клеток, и вызывает лекарстоустойчивость во многих опухолях, включая ГЦК [17–19].

В ксенотрансплантационных моделях HepG2 комбинация hGC33 и сорафениба более эффективно ингибирует рост опухоли, чем сорафениб в одиночку [15], а доставка лекарств полимерными наноносителями получила большое внимание в лечении рака. Антираковые наноносители, загруженные препаратами, могут предотвратить неспецифическое распределение и неспецифическую деградацию ин vivo, улучшить биодоступность и антиопухолевое нацеливание препарата, и упростить оценку фармакокинетики и лечения [15, 16]. Среди различных полимерных наночастиц, формуляции на основе поли(лактид-ко-гликолидной кислоты) (PLGA) считаются идеальными и безопасными носителями лекарств [17, 18]. В этом контексте поли(этиленгликоль)-b-поли(d,l-лактид-ко-гликолид) (PEG-b-PLGA) основаны на кополимерах полиэтиленгликоль и PLGA, которые безопасны и нетоксичны после гидролиза, и одобрены Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США [19–22]. Поэтому внутривенное введение с наноносителем кополимера PEG-b-PLGA является перспективной стратегией для достижения таргетной доставки и усиления эффективности. Кроме того, применение специфического антитела hGC33 против молекул GPC3 на мембране клеток ГЦК может не только улучшить доставку нанопрепарата таргетингом ин vitro и ин vivo [18, 19], но и блокировать Wnt и/или другие сигнальные пути, связанные с GPC3, ингибировать пролиферацию и/или выживание раковых клеток, и может достичь синергистической антиопухолевой активности.

В данном исследовании мы изучали, могут ли антителом hGC33 модифицированные кополимерные PEG-b-PLGA наночастицы способствовать доставке сорафениба (hGC33-SFB-NP) к ГЦК ин vivo и ин vitro, и повысить эффективность лечения ГЦК через активное таргетинг ГЦК для изменения фармакокинетики препарата. Согласно размеру частиц, дзета-потенциалу, морфологии частиц, эффективности инкапсуляции препарата, загрузке препарата и ин vitro высвобождению препарата, таргетные НЧ были комплексно охарактеризованы. Ин vitro таргетинговая способность охарактеризована путем поглощения клетками гепатомы HepG2. Биораспределение и синергистический терапевтический эффект hGC33-SFB-NP на ГЦК оценивали путем сравнения сорафениба и SFB-NP. Наши результаты показали, что hGC33-SFB-NP может нацеливаться на GPC3+ ГЦК. Он может ингибировать прогрессию клеточного цикла, пролиферацию клеток и инвазию опухоли путем ингибирования Wnt и Ras/Raf/MAPK сигнальных путей и синергистически ингибирует прогрессирование рака печени.

Материалы и методы

Материалы

Антитело hGC33, 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромид (MTT), 4′,6-диамидино-2-фенилиндол, дигидрохлорид (DAPI), 5,5′,6,6′-тетрахлоро-1,1′,3,3′-тетраэтил-бензимидазолилкарбоцианин иодид (JC-1), и диметилсульфоксид (DMSO) получены от Sigma—Aldrich, Inc. (St. Louis, MO). 1-(3-диметиламинопропил)-3-этил-карбодиимид гидрохлорид и N-гидроксисукцинимид получены от Qiyun Biotech (Гуанчжоу, Китай). Набор для kvantификации белка бицинхониновой кислотой (BCA), кумарин-6, и набор для детекции апоптоза Annexin V-FITC/PI приобретены у Beyotime Biotechnology (Шанхай, Китай). Диблок-кополимер PEG-b-PLGA-малеимид (mal-PEG-b-PLGA; 25 000–30 000 Да, PLGA, LA:GA, w/w; PEG, 13–15%) приобретен у Polyscitech (West Lafayette, IN, USA). Набор антител PI3K (9655#), p-Akt (9916#), mTOR (9964#), семейства Bcl-2 (9942#), апоптоза (9915#), и вторичные козьи анти-кроличьи и анти-мышиные антитела приобретены у Cell Signal Technology (Danvers, MA, USA); циклин B1 и циклин-зависимая киназа приобретены у Abcam Biological Technology (USA). Антитела к фосфо-Rb, циклин D1, чекпоинт киназе 1 (CHK1), P53, фосфорилированному гену восприимчивости к раку молочной железы 1 (p-BRCA1), RAD51, цитохрому C, и матриксным металлопротеиназам (MMP2 и MMP9) приобретены у Abcam (USA). Все остальные аналитические реактивы и растворители получены от стандартных поставщиков и использованы без дополнительной очистки.

Клетки и животные

Линейка клеток ГЦК HepG2 (получена из Американской коллекции типов культур (Manassas, VA, USA) культивировалась в среде DMEM (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) с добавлением 10% FBS (HyClone, Logan, UT, USA) и 80 ЕД/мл пенициллина и 80 мкг/мл стрептомицина в увлажненной атмосфере 5% CO₂ при 37 °C. Нюдовые мыши BALB/C, вес 20–22 г (5–6 недель) предоставлены Nanjing Junke Biotechnology Co., Ltd. (Китай). Нюдовые мыши BALB/C содержались в СПФ-помещении. Все уход и лечение животных проводились в соответствии с требованиями по уходу за животными Аньхойского университета науки и технологий. Все экспериментальные протоколы рассмотрены и одобрены комитетом по этике животных экспериментов Аньхойского университета науки и технологий (Номер одобрения: 2019dw013).

Подготовка НЧ

Для подготовки НЧ mal-PEG-b-PLGA и SFB или кумарин-6 взвешивали и растворяли в органической фазе (3:2 v/v дихлорметан/ацетон). Раствор капельно добавляли в раствор поливинилового спирта (PVA) (5% w/v) с непрерывным вихревым перемешиванием. Смесь ультразвуково обрабатывали прерывисто зондовым ультразвуковым разрушителем (выходная мощность 550 Вт, 8 раз) на льду для создания эмульсии масло-вода. Эмульсию добавляли в раствор PVA (1% w/v) с магнитным перемешиванием. SFB и кумарин-6 НЧ собирали центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин и трижды промывали водой Milli-Q.

Для генерации hGC33-NP путем тиоэфирных связей, образованных реакцией малеимида с свободными сульфидными остатками в антителе hGC33, антитело hGC33 смешивали с малеимид-функционализированными НЧ в молярном соотношении 5:1 (hGC33: mal-PEG-b-PLGA) и инкубировали при 4 °C в течение 16 ч с непрерывным перемешиванием. hGC33 конъюгировали к НЧ через реакцию сульфидных групп на антителе hGC33 с малеимидными группами PEG-цепочек. Неконъюгированные антитела удаляли прохождением через колонки Sepharose CL-4B. Эффективное конъюгирование белка подтверждали набором BCA (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA).

Характеристика наночастиц (НЧ)

Морфология, размер частиц, эффективность инкапсуляции (EE) и стабильность НЧ

Морфологию НЧ оценивали проходной электронной микроскопией (ТЭМ, H-600; Hitachi, Tokyo, Japan). Безпрепаратные hGC33-NP и безпрепаратные НЧ записывали ФТИР-спектрофотометром (Thermo Nicolet, Madison, WI, USA) с бромидом калия. Средний размер частиц и дзета-потенциал НЧ характеризовали на Malvern Zetasizer ZEN3600 Nano ZS (Malvern Instruments, Malvern, UK) при 20 °C. Эффективность инкапсуляции препарата (EE) и содержание препарата (LC) оценивали ультрафильтрацией. Образцы загружали в ультрафильтрационное устройство (100 кМвCO; Sartorius, Göettingen, Германия) и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 25 мин при 4 °C для удаления свободного препарата. Тот же объем каждого образца растворяли в ацетонитриле для подтверждения общего количества препарата. Концентрацию измеряли высокоэффективной жидкостной хроматографией. Длина волны поглощения — 266 нм. Следующая формула использовалась для расчета EE (%): (масса инкапсулированного препарата / общая масса препарата) × 100%. LC (%) рассчитывали как (масса инкапсулированного препарата / масса НЧ) × 100%. Для понимания стабильности НЧ при комнатной температуре изменение размера НЧ оценивали динамическим рассеянием света (DLS) в заранее определенные временные точки (0,5; 1; 2; 4; 8; 12; 16; 20; 24 ч) при 25 °C.

Ин vitro высвобождение препарата и тест клеточного поглощения

Высвобождение препарата из НЧ изучали с использованием диализных мешков с пором молекулярной массы 10 кДа. Кратко, 1 мл НЧ загружали в диализный мешок (MWCO 8000–10000 Да; Spectrum Labs Inc., CA, USA). Диализные мешки помещали в ФСБ и агитировали магнитным перемешивателем при 25 °C. Профили высвобождения препарата из НЧ измеряли в 100 мл 0,2 М фосфатно-буферного раствора (ФСБ; pH = 7,4) в течение 7 дней. Концентрацию препарата в пробах измеряли высокоэффективной жидкостной хроматографией. В последующих исследованиях hGC33-кумарин 6-NP, имеющий тот же размер частиц, что и hGC33-SFB-NP, использовали для оценки таргетинга hGC33-SFB-NP. Клетки HepG2 (GPC3+) и Li-7 (GPC3−) инкубировали с hGC33-кумарин 6-NP в течение 0,5; 2 или 4 ч при 37 °C в 5% CO₂ соответственно. Ко-культивированные клетки промывали и фиксировали 4% формальдегидом в течение 10 мин; ядра клеток окрашивали 5 мкг/мл Hoechst 33,342 в течение 15 мин для локализации внутриклеточных НЧ. Конфокальная микроскопия для анализа внутриклеточных изображений НЧ анализировалась конфокальной микроскопией (Olympus FV1000; Olympus Corporation, Tokyo, Japan).

Ин vitro клеточный эффект

Цитотоксичность свободного hGC33(Ab), свободного SFB, hGC33-null-NP или hGC33-SFB-NP определяли с помощью МТТ-теста. Клетки HepG2 (GPC3+) и Li-7 (GPC3−) в логарифмической фазе посеяли в 96-ямочную пластинку с плотностью 4000 клеток/яма с последующей инкубацией 48 ч при 37 °C в 5% CO₂. Клетки обрабатывали hGC33, свободным SFB, hGC33-null-NP или hGC33-SFB-NP в течение 48 ч при 37 °C в 5% CO₂. После ко-культивации определенного времени антипролиферативная активность определяли МТТ-тестом как описано [20]. Абсорбцию каждой ямки измеряли при 490 нм и рассчитывали полумаксимальную ингибирующую концентрацию (IC₅₀) с помощью SPSS 17.0.

Измерение клеточной инвазивной способности

Клетки в логарифмической фазе роста посеяли на 6-ямочные пластинки с плотностью 5 × 10⁴ клеток/яма, сделали царапину сосочком и заменили на бессывороточную среду. Заживление раны записывали в 0 ч, 24 ч и 48 ч в контрольной и экспериментальной группах. Одновременно то же количество клеток посеяли в камеры Transwell и обрабатывали свободным hGC33, свободным SFB, hGC33-null-NP или hGC33-SFB-NP. 500 мкл 10% FBS среды добавляли в нижнюю камеру. После 24-часовой инкубации камеру Transwell извлекали, клетки фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетом. Размер заживления раны и количество мигрировавших клеток вычисляли для оценки миграционной способности.

Определение клеточного цикла

После ночной инкубации в 6-ямочных пластинках клетки обрабатывали свободным hGC33 (Ab), свободным SFB, hGC33-null-NP или hGC33-SFB-NP в течение 24 ч, затем собирали и фиксировали этанолом. После окраски йодидом пропидия проводили цитометрию потока, и клеточный цикл анализировали с modifit 3.0 (Verity Software House, Topsham, ME).

Вестерн-блоттинг

Для оценки статуса активации сигнального пути и экспрессии мишеневитых молекул, клетки инкубировали ночью в 6-ямочных пластинках, и свободный hGC33, свободный SFB, hGC33-null-NP или hGC33-SFB-NP применяли в течение 24 ч. Клетки каждой лечебной группы собирали, белок извлекали и измеряли. Концентрацию белка измеряли и калибровали набором BCA (Biosharp, Хэйфэй, Китай). Белок проб разделяли двенадцатиалкилсульфатным полиакриlamide гель-электрофорезом, переносили на ПВДФ-мембрану и блокировали обезжиренным молоком. Первичное антитело (разбавленное 1:1000) инкубировали ночью при 4 °C, вторичные антитела (1:2000) инкубировали 1 ч при комнатной температуре. Полосы визуализировали субстратами ECL (Thermo Fisher Scientific Waltham, MA, USA), изображения отображали системой анализа гель-изображений, β-актин использовали как контроль.

Ин vivo антиопухолевая активность

Ингибирование свободного hGC33, свободного SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP и hGC33-SFB-NP роста ГЦК ин vivo определяли. Согласно правилам и руководящим принципам по здоровью животных этического комитета Аньхойского университета технологий, все эксперименты проводили на мышах BALB/c в клетках в термостатируемой комнате (23 ± 2 °C) с циклом 12 ч/12 ч свет/темнота. 50-мкл суспензия, содержащая 5 × 10⁶ живых клеток HepG2, субкутанно инъецировали в правый живот 5-недельных самок мышей BALB/c (20–22 г). Когда объем опухоли достиг около 50 мм³, мышей случайно разделили на 6 групп (по 10 мышей в каждой). Физиологический раствор NS (200 мг/кг null NP в 200 мкл ФСБ), hGC33-null-NP (hGC33-null-NP в 200 мкл ФСБ, эквивалентно hgc33 = 100 мкг/кг/раз), свободный hGC33 (hGC33 в 200 мкл ФСБ, 100 мкг/кг/раз), свободный SFB (доза SFB: 8 мг/кг/раз), SFB-NP (доза SFB: 8 мг/кг/раз), и hGC33-SFB-NP (эквивалентно SFB = 8 мг/кг/раз, hGC33 = 100 мкг/кг/раз) вводили в хвостовую вену каждые 2 дня в течение 10 раз. Вес и размер опухоли мышей измеряли каждые 4 дня. Формула расчета объема опухоли: объем = 0,5 × L × W², где L и W — длина и ширина опухоли соответственно. Через 4 недели после введения животных анестезировали диэтилов эфиром, измеряли размер и вес опухоли. Кроме того, опухоль, сердце, печень, почка, легкое и селезенку удаляли, фиксировали 4% параформальдегидным раствором, встраивали в парафин, делали срезы и окрашивали гемоксилином и эозином для оценки гистологических изменений цифровой микроскопией.

Статистический анализ

Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение (SD) и оценивались дисперсионным анализом с помощью SPSS 18.0. Парные статистические сравнения проводили двусторонним t-критерием Стьюдента. Различия считались статистически значимыми при P < 0,05.

Результаты

Характеристика НЧ и ин vitro высвобождение препарата

Поскольку диаметр и поверхностные свойства НЧ влияют на клеточное поглощение, высвобождение препарата и распределение НЧ ин vivo, мы охарактеризовали подготовленные НЧ соответствующими параметрами. Морфология, размер частиц и распределение размеров частиц полимеров SFB-NP, hGC33-null-NP и hGC33-SFB-NP суммированы на рис. 1. Морфология hGC33-SFB-NP, наблюдаемая проходным электронным микроскопом (рис. 1a), показывает жесткие ядра с нечеткими краями, что указывает на присутствие hGC33 на поверхности НЧ. Размеры частиц SFB NP, hGC33-null-NP и hGC33-SFB-NP варьировались от 100 до 150 нм и имели типичное унимодальное распределение размеров. Средний диаметр hGC33-SFB-NP (120,2 ± 10,2 нм) был слегка больше, чем у hGC33-null-NP, SFB-NP и null NP (рис. 1a, Таблица 1). Тонкие сферические нечеткие пленки с единой поверхностью присутствовали на поверхности hGC33-SFB-NP и hGC33-null-NP, что указывало на присутствие антитела hGC33 на поверхности НЧ. Увеличение размера для hGC33-SFB-NP и hGC33-null-NP подтвердило существование пленки hGC33. Синтез hGC33-SFB-NP подтвердили с помощью ¹H-NMR (рис. 1b) перед подготовкой НЧ. Пики при 5,2 ppm и 1,58 ppm отнесены к протонам -CH₃ молочной кислоты; пик при 4,8 ppm — к -OCH₂- гликолиевой кислоты; пик при 3,6–3,8 ppm — к протонам -CH₂CH₂O- повторяющихся единиц PEG. Поверхностная химия PEG-b-PLGA и Ab-PEG-b-PLGA НЧ также изучали ФТИР-спектроскопией (рис. 2c). В спектре полимера PEG-b-PLGA сильная полоса около 1750 см⁻¹ происходила от растяжения карбонильных групп (C=O) в цепи PLGA. Полоса при 2880 см⁻¹ была вызвана растяжением группы –CH в цепи PEG. Одновременно появился пик при 2520 см⁻¹, который мы приписали растяжению -SH антитела hGC33. Результаты ¹H NMR и ФТИР указывали на то, что антитело было привито к основной цепи полимеров PEG-b-PLGA.

Характеристика НЧ. a ТЭМ-характеристика НЧ, шкала 100 нм; b ¹H NMR спектры синтетического hGC33-PLGA-b-PEG в CDCl3; c ФТИР спектры hGC33-PEG-b-PLGA и PEG-b-PLGA; d кумулятивные профили высвобождения SFB-NP и hGC33-SFB-NP в ФСБ (pH = 7,4) при 37 °C; e изменение размера НЧ, инкубированных в среде DMEM с 10% FBS за 14 дн; f изменение размера НЧ, инкубированных в ФСБ за 14 дн. SFB — сорафениб; ТЭМ — проходная электронная микроскопия; НЧ — наночастицы; ¹H NMR — ¹H-ядерный магнитный резонанс; ФТИР — Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии

Интересно, что наночастицы hGC33-SFB-NP и SFB-NP в среде DMEM с 10% FBS (pH = 7,4) имели быструю высвобождение препарата до примерно 4 дней, затем относительно медленное и стабильное высвобождение; кумулятивное высвобождение SFB из hGC33-SFB-NP и SFB-NP за 20 дней составило около 77% и 65% соответственно (рис. 1d). Разница может быть обусловлена гидрофильной молекулой на поверхности матрицы PEG-b-PLGA, которая может ускорить деградацию наночастиц за счет увеличения гидратации и тем самым способствовать гидролизу. Для определения стабильности подготовленных НЧ, hGC33-SFB-NP, hGC33-null NP, null-NP и SFB-NP помещали в среду DMEM с 10% FBS (pH = 7,4) и в ФСБ (pH = 7,4). Размеры различных НЧ оставались стабильными более 2 недель. SFB высвобождался из hGC33-SFB-NP устойчивым и стабильным образом в течение 14 дней, но наблюдалось небольшое изменение размера частиц в среде DMEM по сравнению с 10% FBS (рис. 1e, f). Стабильность hGC33-SFB-NP подходит для SFB, имеющего устойчивую биологическую роль.

Большой дзета-потенциал может вызывать сильное электростатическое отталкивание между НЧ и поддерживать стабильность дисперсионной системы НЧ [23, 24]. Как показано в Таблице 1, дзета-потенциалы hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP и SFB-NP составляют −18,2 ± 2,2 мВ, −18,5 ± 1,8 мВ и −15,9 ± 2,1 мВ соответственно, что может быть вызвано отрицательными зарядами, генерируемыми альдегидной, карбоксильной и фосфатной группами в гликопротеине антитела hGC33. Отрицательно заряженные НЧ могут приводить к высокой стабильности суспензии НЧ. Кроме того, поскольку поверхность клеток отрицательно заряжена в нормальных физиологических условиях, подготовленные НЧ отталкивают клетки с низким зарядом и менее токсичны для тканей и клеток. Кроме того, распределение размеров null-NP и SFB-NP (полидисперсность PDI 0,18 и 0,19 соответственно) было слегка, но незначительно меньше, чем у hGC33-null-NP (PDI = 0,21) и hGC33-SFB-NP (PDI = 0,23). Таким образом, размер наночастиц имеет хорошую однородность. Размер частиц, распределение размеров и дзета-потенциал НЧ показаны в Таблице 1 согласно результатам эффективности инкапсуляции SFB и содержания препарата. Неконъюгированное анти-GPC3 тело hGC33 удаляли ультрацентрифугацией, и эффективность связывания антитела hGC33 с НЧ оценивали. Анализ белка BCA показал, что эффективность связывания антитела hGC33 с НЧ составляла 79,5% ± 2,9%.

hGC33-кумарин 6-NP эффективно нацеливается на GPC3+ линейку клеток гепатомы HepG2

Чтобы узнать, сохраняет ли антитело hGC33 на наночастицах способность специфически нацеливаться на GPC3, мы использовали GPC3+ HepG2 и GPC3− Li-7 клетки как мишеневитые клетки и hGC33-кумарин 6-NP как трассирующие наночастицы, и инкубировали разные клетки в течение 2 ч, 4 ч и 8 ч. Клетки промывали ФСБ 3 раза и реагировали с DAPI для окраски ядра. Клетки фиксировали и фотографировали с Leica флуоресцентным микроскопом (DMi8, Германия). Обнаружили, что зеленая флуоресценция в клетках HepG2 была значительно выше, чем в клетках Li-7 при одинаковом времени инкубации (рис. 2), указывая на то, что количество hGC33-кумарин 6-NP, вошедших в клетки HepG2, было значительно выше, чем в клетках Li-7. Результаты документировали, что антитело hGC33 на hGC33-кумарин 6-NP все еще имело способность нацеливаться на GPC3 и медиатировать интернализацию наночастиц. Экспрессия GPC3 в клетках HepG2 и Li-7 изучали с помощью непрямой флуоресценции и цитochemical окраски. Результаты показали, что клетки HepG2 переэкспрессируют GPC3, в то время как клетки Li-7 не экспрессируют GPC3 (рис. 2).

Экспрессия GPC3 и поглощение hGC33-кумарин6-NP в клетках Li-7 и HepG2. Клетки, посеянные в культурной пластинке, промывали ФСБ и инкубировали с 100 мкг/мл hGC33-кумарин6-NP в DMEM в течение 2, 4 и 8 ч. Ядра окрашивали DAPI, клетки фиксировали и детектировали конфокальной лазерной сканирующей микроскопией. GPC3 не детектировался в клетках Li-7, но высоко экспрессировался в клетках HepG2, как определено иммуноцитохимией. Шкала 50 мкм

hGC33-null-NP ингибирует пролиферацию клеток HepG2

Чтобы определить, может ли hGC33-модифицированная НЧ (hGC33-null-NP) ингибировать рост ГЦК, мы измерили ингибирование роста клеток GPC3-положительной линии гепатомы HepG2 и GPC3-отрицательной линии Li-7. Мы обнаружили, что и hGC33-null-NP, и hGC33 ингибировали рост GPC3-положительной линии гепатомы HepG2 после 24-часового лечения, но hGC33 имел более значимый ингибирующий эффект на клетки HepG2, чем hGC33-null-NP (рис. 3a); напротив, hGC33-null-NP и hGC33 не влияли на рост GPC3-отрицательной линии Li-7 (рис. 3b). Репрезентативный временной ход hGC33-null-NP (эквивалентно 0,1 мкМ hgc33) и hGC33 (0,1 мкМ) на пролиферации клеток HepG2 изображен на рис. 3c. Поскольку hGC33 — это C-терминальный пептид, распознающий GPC3, hGC33 превосходит hGC33-null-NP в ингибировании HepG2. Результаты указывают, что молекула hGC33 в hGC33-null-NP может иметь стерическое препятствие, которое может влиять на способность hGC33 связываться с эпитопами.

Пролиферация клеток HepG2 и Li-7 ингибировалась hGC33, null-NP и hGC33-null-NP. a Тест на пролиферацию клеток проводили на GPC3-положительных клетках HepG2, обработанных hGC33, null-NP или hGC33-null-NP; b тесты на пролиферацию проводили на GPC3-отрицательных клетках Li-7, обработанных hGC33, null-NP и hGC33-null-NP. Клетки инкубировали с 0–2,5 мкМ hGC33, null-NP или hGC33-null-NP в течение 1 дня. Пролиферация клеток измерялась методом MTT и стандартизировалась относительно необработанных клеток. Все значения представляют среднее ± SD. По сравнению с контрольной группой (0 мкМ) без лечения антителом, *P < 0,01; c репрезентативные результаты ответа HepG2 на hGC33, null-NP и hGC33-null-NP при лечении hGC33 (1,0 мкМ)

hGC33-null-NP ингибирует клеточный цикл клеток HepG2

Чтобы понять механизм молекулярной активности антитела hGC33, модифицированного на наночастицах hGC33-null-NP, мы изучили прогрессию клеточного цикла HepG2, обработанных hGC33-null-NP. В линейке клеток HepG2 hGC33-null-NP и hGC33 значительно увеличили долю клеток в фазе G1 (рис. 4a, b), указывая на то, что и hGC33-null-NP, и hGC33 могут индуцировать застаривание клеточного цикла в фазе G1. Кроме того, hGC33-null-NP и hGC33 могли значимо понизить экспрессию циклина D1 в клетках HepG2 (рис. 4c, d).

hGC33-null-NP и hGC33 индуцируют застаривание клеточного цикла в фазе G1 и ингибируют экспрессию циклина D1 в клетках HepG2. a Репрезентативная диаграмма клеточного цикла различных групп, обработанных hGC33-null-NP и hGC33. b Анализ клеточного цикла различных групп, обработанных hGC33-null-NP и hGC33. Клетки ГЦК инкубировали с 0,5 мкМ hGC33 или hGC33-null-NP (с молярной концентрацией hGC33 как референсом). *P < 0,05, фаза G1 клеток hGC33-null-NP или hGC33 сравнивалась с клетками 0 ч. c, d После лечения hGC33-null-NP или hGC33 циклин D1 значимо понижен в клетках HepG2 по сравнению с контрольной группой

Активация Wnt в клетках HepG2, Huh-7 и Li-7

Чтобы понять активацию классического Wnt/β-катенен сигнала в клетках ГЦК, мы сначала детектировали экспрессию Wnt-лиганда и рецепторного белка frizzled (FZD или Frz) в различных линейках клеток ГЦК: HepG2 (GPC3++), Huh-7 (GPC3+) и Li-7 (GPC3−). Результаты показали, что Wnt3a и FZD рецептор, транслирующий β-катенен путь, экспрессировались во всех линейках клеток, особенно в HepG2 и Huh-7 (рис. 5).

Экспрессия Wnt3a, FZD1 и FZD3 в линейках клеток ГЦК

hGC33-null-NP ингибирует Wnt-сигнальный трандукцию-зависимую пролиферацию клеток, индуцированную Wnt3a

Некоторые исследования показали, что внеклеточная часть GPC3 может быть корецептором Wnt, который способствует активации и трандукции Wnt/β-катенен сигнала. Поэтому, когда клетки HepG2 (GPC3+), Huh-7 (GPC3+) и Li-7 (GPC3−) ко-инкубировали с hGC33 и hGC33-null-NP, активация Wnt/β-катенен сигнала блокировалась hGC33 и hGC33-null-NP, и пролиферация HepG2 и Huh-7, но не Li-7, в среде, обусловленной Wnt3a, ингибировалась. То, что пролиферация клеток Li-7, скорее всего, обусловлена отсутствием GPC3 на поверхности клеток Li-7 (рис. 6). Наши результаты указывают, что hGC33 и hGC33-null-NP наночастицы специфически связываются с молекулами GPC3 на клеточной мембране. hGC33 и hGC33-null-NP частично нейтрализуют митогенную активность Wnt3a и ингибируют Wnt/β-катенен сигнальный путь. Однако ингибирование пролиферации hGC33-null-NP наночастицами было меньше, чем hGC33. Возможно, пространственная структура наночастиц мешает hGC33-null-NP и ограничивает функцию молекулы hGC33 на наночастицах, так что они не могут полностью блокировать взаимодействие между GPC3 и Wnt3a.

GPC3-активированная Wnt-сигнальная трандукция в ГЦК. 50% среды Wnt3a DMEM добавляли с анти-Wnt3a антителом, hGC33 или hGC33-null-NP. Клетки HepG2 (GPC3++), Huh-7 (GPC3+) и Li-7 (GPC3−) ко-инкубировали 48 ч, пролиферацию клеток измеряли МТТ-тестом. Данные выражены как среднее ± SD (*P < 0,01)

hGC33-null-NP ингибирует Wnt3a-индуцированную сигнальную трандукцию в клетках HepG2 и Huh-7

Чтобы понять эффект hGC33-null-NP на Wnt/β-катенен сигналинг в клетках ГЦК, мы извлекли белки клеток HepG2 и Huh-7, обработанных hGC33 или hGC33-null-NP. Результаты вестерн-блота показали, что после лечения hGC33-null-NP уровни pYAP и pβ-катенена повысились, но уровни YAP и β-катенена снизились. Кроме того, уровни циклина D1, CD44, VEGF и c-MYC в группе hGC33-null-NP были ниже, чем в контрольной группе, но уровень был ниже, чем при лечении hGC33. Похожие эффекты наблюдались в клетках HepG2 и Huh-7, как показано на рис. 7.

Ингибирование Wnt3a-индуцированного β-катенен сигналинга hGC33-null-NP или hGC33. a По сравнению с контрольной группой, Wnt/β-катенен сигнальный путь в клетках HepG2 и Huh-7, обработанных hGC33-null-NP или hGC33, был ингибирован, и уровни β-катенена и YAP снизились, в то время как повышенные фосфорилированные β-катенен и фосфорилированные YAP молекулы были нестабильны и деградировали в цитоплазме. Сниженный β-катенен был трудно удержан в ядре и драйвил экспрессию Циклин D1, CD44, VEGF и c-MYC, что привело к снижению уровней белков циклина D1, CD44, VEGF и c-myc. b Механистический паттерн Wnt/β-катенен сигнального пути, ингибируемого hGC33-null-NP или hGC33

hGC33-SFB-NP или hGC33 ослабляет миграцию клеток ГЦК путем ингибирования эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМТ)

ГЦК — один из смертельно опасных раков в мире, и его заболеваемость стабильно возрастает. Сорафениб — единственный одобренный стандартный метод лечения пациентов с прогрессированной ГЦК, так как показано, что он улучшает выживаемость этих пациентов. Однако клинические и до klinические наблюдения предполагают, что терапия сорафенибом имеет ограниченную эффективность из-за быстрого развития лекарстоустойчивости. Поэтому эллюцидация механизма устойчивости к сорафенибу является главным акцентом в исследовании ГЦК. В последние годы все больше внимания уделяется роли эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМТ) в прогрессе ГЦК и развитии лекарстоустойчивости. ЭМТ относится к трансформации эпителиальных в мезенхимальные клетки, что наделяет клетки способностью метастазировать и инвадировать, включая приобретение стволовых характеристик, снижение апоптоза и старения, продвижение иммуносупрессии и участие в возникновении и развитии рака. Потеря экспрессии E-кадгерина считается ключевым шагом в канцерогенезе и ЭМТ. ЭМТ — это многошаговый молекулярный и клеточный репрограммирующий процесс развития, который раковые клетки используют для достижения агрессивности. Это в основном через понижение экспрессии E-кадгерина, кератина, муцина, ZO-1 (белка тесных контактов); повышение экспрессии виментина, альфа-гладкомышечного актина (α-SMA), FN фибронектина, MMPs (матриксных металлопротеиназ), N-кадгерина, snail, slug, twist, Rho, TGF-β, FGF, коллагена типа I и типа II для достижения инвазии, метастазирования и антиапоптоза, характерных для ЭМТ опухолей. Изменения этих белковых экспрессий в основном включают активацию Wnt/β-катенен и Ras/Raf/MAPK сигнальных путей.

Наши эксперименты показали, что антитело hGC33 на поверхности НЧ-вектора может ингибировать Wnt3a-индуцированную β-катенен сигнальную трандукцию, а затем понизить экспрессию β-катенена, CD44, сосудистого эндотелиального фактора роста (VEGF), циклина D1 и c-MYC. Кроме того, hGC33-SFB-NP ингибирует активацию Ras/Raf/MAPK сигнального пути и ингибирует пролиферацию и апоптоз клеток ГЦК. hGC33 и SFB имеют синергистический эффект, ингибируя ЭМТ и снижая миграцию клеток ГЦК (рис. 8).

Эффект hGC33-SFB-NP на ингибирование ЭМТ. a По сравнению с контрольной группой, группа лечения hGC33-SFB-NP имела меньше клеточной миграции. Фотографии сделаны под оптическим микроскопом (увеличение ×200). Значение ошибки представляет стандартное отклонение трех независимых экспериментов. *По сравнению с контрольной группой, p < 0,01. b По сравнению с контрольной группой, ЭМТ-связанные белки snail, виментин и MMP-2 в ГЦК, обработанных hGC33-SFB-NP, снизились, тогда как E-кадгерин увеличился. c Молекулярный механизм ЭМТ. ЭМТ — эпителиально-мезенхимальный переход; MMP-2 — матриксный металлопротеиназ-2; SFB — сорафениб; NP — наночастица

hGC33-SFB-NP ингибирует рост гепатоцеллюлярной карциномы ин vivo и улучшает выживаемость мышей-носителей опухоли

Для оценки антиопухолевой активности hGC33-SFB-NP ин vivo, клетки HepG2 и Huh-7 субкутанно инокулировали в правый живот и спинную сторону самок нюдовых мышей BALB/c соответственно. Когда ксенотрансплантат опухоли достиг около 30 мм³, мышей случайно разделили на группы для дальнейшей оценки ингибирования каждой группой (hGC33-SFB-NP, hGC33-null-NP, SFB-NP, свободный hGC33, свободный SFB и контрольная группа) эффекта ГЦК (n = 5 в группе). Из рис. 9a, b видно, что hGC33-SFB-NP значимо замедлил рост опухоли у мышей по сравнению с контролем ФСБ и другими лечениями. По сравнению с контролем ФСБ, hGC33-null-NP, SFB-NP, свободный hGC33 и свободный SFB также имели некоторое ингибирование ГЦК, потому что свободный hGC33 и свободный SFB напрямую ингибируют Wnt-сигнал и Ras/Raf/MAPK соответственно. Такие пути могут ингибировать пролиферацию клеток ГЦК в определенной степени. Хотя наночастица-модифицированный hGC33 (hGC33-null-NP) связан с нано поверхностью через химические связи, это не влияло на таргетинг hGC33 молекул GPC3 и ингибирование Wnt-активности. Наночастица-загруженный SFB (SFB-NP), после эндоцитоза клетками, деградировал для высвобождения SFB из кополимера для ингибирования роста ГЦК. Во всем, ингибирующий эффект hGC33-SFB-NP на ксенотрансплантаты HepG2 был, как ожидалось, больше, чем на ксенотрансплантаты Huh-7, вероятно, потому что HepG2 экспрессирует молекулы GPC3.

Эффект hGC33-SFB-NP на ксенотрансплантацию ГЦК в нюдовых мышах и изменение веса мышей. Клетки рака печени инокулировали субкутанно на спину каждой нюдовой мыши (n = 10). Через 10 дней мышей-носителей опухоли лечили ФСБ (контроль), свободным hGC33, свободным SFB, hGC33-null-NP, SFB-NP и hGC33-SFB-NP. Размер опухоли (a, b) и вес тела мышей (c, d) мониторили в определенные временные точки

Вес тела нюдовых мышей в каждой лечебной группе также измеряли, как показано на рис. 9c, d. Вес тела контрольной группы постепенно снижался. Вес мышей в группах свободного hGC33, свободного SFB, SFB-NP и hGC33-null-NP также постепенно снижался и не был значимо меньше, чем в контрольной группе. Однако вес нюдовых мышей, переносивших HepG2 и Huh-7, обработанных hGC33-SFB-NP, лишь слегка снижался, и вес оставался относительно стабильным в течение цикла лечения. Эти результаты подтверждают, что новый нанопрепарат hGC33-SFB-NP не имеет значимой токсичности в нюдовых мышах, и SFB, загруженный на наноноситель, и поверхностно модифицированный hGC33 могут производить аддитивный или даже синергистический антиопухолевой эффект.

Обсуждение

Для изучения пригодности hGC33-SFB-NP для таргетной терапии ГЦК, мы тестировали модельные конъюгаты на их способность связываться с человеческим глипиканом-3 на клетках ГЦК ин vitro; ингибировать пролиферацию, миграцию и Wnt/β-катенен сигнальную трандукцию GPC3-положительных клеток ГЦК; и ингибировать ГЦК, переэкспрессирующую глипикан-3, ин vivo.

Для ковалентного связывания GPC3-специфического антитела hGC33 с mal-PEG-b-PLGA наночастицами, мы скрестили свободную сульфидную группу в Fc-сегменте hGC33 с малеимид-функционализированным PEG-b-PLGA (mal-PEG-b-PLGA) путем формирования стабильных тиоэфирных связей. Конъюгация является предварительным условием для таргетинга GPC3-положительной ГЦК. Серия экспериментов, включая изменения диаметра наночастиц и дзета-потенциала, детектированные линзой, и внутриклеточное поглощение hGC33-SFB-NP, верифицировали таргетинг hGC33-SFB-NP к HepG2 (GPC3+) клеткам. Эти результаты указывали на то, что связывающая активность антитела hGC33 не изменилась конъюгацией.

Мы напрямую детектировали фагоцитарный эффект GPC3+ HepG2 и GPC3− Li-7 клеток на поверхности PEG-b-PLGA NP, модифицированной hGC33, конфокальной микроскопией. После ко-культивации HepG2 и Li-7 клеток с hGC33-кумарин 6-NP, интенсивность зеленого сигнала в клетках HepG2 была значительно выше, чем в клетках Li-7, указывая на то, что в клетках HepG2 было больше наночастиц. Это اكتشاف согласуется с тем, что антитело hGC33, модифицированное на поверхности PEG-b-PLGA NP, специфически связывается с глипиканом-3 на поверхности клеток ГЦК и интернализация. Эффективность интернализации hGC33-модифицированных НЧ зависит от уровня экспрессии антигена GPC3 на поверхности клетки.

Мы использовали стандартный МТТ-тест для измерения эффективности ингибирования пролиферации гепатомных клеток. И hGC33-null-NP, и hGC33 ингибировали рост GPC3-положительной линии гепатомы HepG2, но hGC33-null-NP и hGC33 не влияли на пролиферацию GPC3-отрицательных клеток Li-7 (рис. 3b). На животном уровне, hGC33-null-NP или hGC33 в одиночку ингибировали рост ксенотрансплантатов Huh-7 и HepG2 в определенной степени, в то время как hGC33-SFB-NP вызывал остановку роста ксенотрансплантатов Huh-7 и HepG2 гепатомы у мышей. Находка, что hGC33-null-NP значимо ингибировал GPC3-положительные гепатомные клетки, показала, что ингибирующий эффект PEG-b-PLGA NP, поверхностно модифицированного hGC33, на пролиферацию клеток ГЦК зависит от экспрессии антигена GPC3 на поверхности клетки.

GPC3 регулирует многие пути в патогенезе ГЦК, включая Wnt и YAP сигналинг [25–27]. GPC3 взаимодействует с Wnt-лигандом и может быть корецептором для Wnt и способствовать Wnt/Frizzled связыванию для роста ГЦК [28, 29]. Мы дальше изучали эффект нанопрепарата, поверхностно модифицированного hGC33, на Wnt сигнальный путь в гепатомных клетках. Как свободный hGC33, так и нанопрепарат, поверхностно модифицированный hGC33, ингибировали пролиферацию гепатомных клеток не только блокируя Wnt-индуцированную сигнальную трандукцию в клетках HepG2 и Huh-7, экспрессирующих GPC3, но и ингибируя Wnt3a-индуцированную β-катенен и YAP сигнальную трандукцию. Предыдущие исследования показали, что экспрессия YAP регулируется β-катененом на транскрипционном уровне в ГЦК [30, 31]. В этом исследовании свободный hGC33 и нанопрепарат, поверхностно модифицированный hGC33, ингибировали Wnt3a-индуцированную YAP активность, указывая на то, что Yap/TAZ, освобожденные из β-катенен комплекса, также могут инициировать классическую Wnt сигнальную трандукцию [32, 2]. Эти результаты указывают на то, что типичный Wnt и YAP кроссталк через различные механизмы. По сравнению с hGC33-null-NP и hGC33, hGC33-SFB-NP имел более сильную антипролиферативную и антимиграционную способность ин vitro и ин vivo. Таким образом, hGC33 не только определяет специфичность клеток ГЦК, но и увеличивает ингибирующий эффект SFB на пролиферацию и миграцию клеток ГЦК путем блокирования ключевых сигналов, связанных с ростом опухоли, таких как Wnt/β-катенен и Wnt/YAP сигнальные пути.

Заключение

Антитело hGC33 к глипикану-3, мембранному белку, переэкспрессируемому на клетках гепатоцеллюлярной карциномы, увеличило связывание сорафениб-загруженных полиэтиленгликоль-b-PLGA полимерных наночастиц (hGC33-SFB-NP) с глипиканом-3 на раковых клетках. Введение антителомодифицированных наночастиц синергистически ингибировало Wnt-индуцированную сигнальную трандукцию и Ras/Raf/MAPK сигнальный путь; клетки гепатоцеллюлярной карциномы застаривали в фазе G0/1 за счет понижения экспрессии циклина D1, тем самым ослабляя миграцию раковых клеток путем ингибирования эпителиально-мезенхимального перехода. hGC33-SFB-NP ингибировал рост рака печени ин vivo и улучшил выживаемость мышей-носителей опухоли.

Доступность данных и материалов

Да, все данные представлены в рукописи.

Аббревиатуры

AKT/PKB:

Белковая киназа B (Protein kinase B)

c-MET:

HGFR: Рецептор фактора роста гепатоцитов (HGFR: Hepatocyte growth factor receptor)

EE%:

Эффективность инкапсуляции % (Encapsulation efficiency %)

ЭМТ (EMT):

Эпителиально-мезенхимальный переход (Epithelial mesenchymal transition)

ФТИР (FTIR):

Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии (Fourier transform infrared spectroscopy)

¹H NMR:

¹H-ядерный магнитный резонанс (¹H-nuclear magnetic resonance spectroscopy)

ГЦК (HCC):

Гепатоцеллюлярная карцинома (Hepatocellular carcinoma)

LC%:

Загрузка препарата % (Drug loading %)

MAPK:

Митоген-активированные протеин киназы (Mitogen-activated protein kinases)

PDI:

Индекс полидисперсности (Polydispersity index)

PI3K:

Фосфоинозитид-3-киназа (Phosphoinositide 3-kinase)

pRAD51:

Фосфо-RAD51 (Phospho-RAD51)

SFB:

Сорафениб (Sorafenib)

ТЭМ (TEM):

Проходная электронная микроскопия (Transmission electron microscopy)

YAP:

Yes-ассоциированный белок-1 (Yes-associated protein-1)