Экosomalный miR-326 от M1 макрофагов подавляет прогрессирование гепатоцеллюлярной карциномы через модуляцию NF-κB сигналинга

Аннотация

Накопленные данные показывают, что микроРНК (miR), полученные из экзосом M1-макрофагов, могут регулировать прогрессирование гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК). Однако влияние miR-326 из экзосом M1-макрофагов на ГЦК не изучалось. Цель данного исследования — изучить механизм действия экзосомального miR-326 от M1-макрофагов в регуляции прогрессирования клеток ГЦК. С помощью РТ-ОПР определили экспрессию miR-326 в линейках клеток ГЦК. Экспрессию miR-326 в ГЦК модифицировали трансфекцией и изучили влияние miR-326 на экспрессию CD206 и NF-κB, пролиферацию, колонизацию, миграцию, апоптоз и инвазию клеток. Затем изолировали экзосомы из M1-макрофагов. РТ-ОПР выявила экспрессию miR-326 в экзосомах M1-макрофагов. Экспрессию miR-326 в экзосомах изменили трансфекцией. Экзосомы M1-макрофагов ко-культивировали с клетками ГЦК для определения их влияния на биологические процессы клеток ГЦК. Наконец, провели ин vivo эксперименты для верификации ин vitro результатов. miR-326 был снижен в клетках ГЦК и обогащен в экзосомах M1-макрофагов. Повышение экспрессии miR-326 подавляло пролиферацию, колонизацию, миграцию, инвазию и экспрессию CD206 и NF-κB, и стимулировало апоптоз, а также ингибировало рост опухолей ГЦК ин vivo, в то время как понижение miR-326 давало противоположные эффекты. Экзосомы M1-макрофагов ингибировали пролиферацию, колонизацию, миграцию, инвазию и экспрессию CD206 и NF-κB, и усиливали апоптоз, тогда как сверхэкспрессия miR-326 усиливала эффект экзосом M1-макрофагов на клетки ГЦК. Показано, что экзосомальный miR-326 от M1-макрофагов подавляет пролиферацию, миграцию и инвазию, а также индуцирует апоптоз клеток ГЦК через понижение экспрессии NF-κB.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК) является пятой по распространенности раковой болезнью в мире и самой частой первичной раком печени [1]. По данным Китайского национального реестра рака, смертность от первичного рака печени занимает третье место, а заболеваемость — четвертое среди распространенных злокачественных новообразований [2]. Основными факторами риска ГЦК являются хроническое заражение вирусом гепатита C и вирусом гепатита B, пищевые продукты, загрязненные афлатоксином, ожирение, курение, чрезмерное потребление алкоголя и сахарный диабет 2 типа [3]. Трансартериальная химиоэмболизация является установленным методом лечения ГЦК на промежуточной стадии, улучшающим выживание большинства пациентов с ГЦК на промежуточных или поздних стадиях [4]. В настоящее время диагностика ГЦК в основном опирается на сывороточные биомаркеры и методы визуализации [5]. 5-летний уровень выживаемости при ГЦК составляет всего около 60%, а заболеваемость год за годом возрастает [6]. Учитывая это, поиск точных терапевтических мишеней является приоритетом в лечении ГЦК.

Макрофаги — эффекторные клетки и главные регуляторы иммунной системы, оказывают огромное влияние на ремоделирование и восстановление тканей, а также выполняют оркестровку метаболических функций практически во всех тканях организма [7]. Показано, что M1-макрофаги оказывают прораковые эффекты и повышают подвижность клеток ГЦК [8]. Экзосома — дискоидная везикула диаметром 40–150 нм [9]. По данным Xu и соавт., экзосомальные микроРНК (miRНК) влияют на пролиферацию, инвазивность, метастазирование и лекарстоустойчивость ГЦК через модуляцию экспрессии генов в мишеневых клетках [10]. Исследование показало, что экзосомы, содержащие miR-326, могут быть потенциальной клинической мишенью при рассеянном склерозе [11]. miRНК могут выступать онкогенами или опухолевыми супрессорами, модулируя экспрессию множества белокодирующих генов посредством деградации мРНК и блокировки трансляции в последовательно-специфическом режиме [12]. Обсуждалось, что miR-326 подавляет рост клеток ГЦК через нарушение прогрессии клеточного цикла и усиление апоптоза, а также подавляет инвазию клеток через снижение эпителиально-мезенхимального перехода [13]. Другое исследование сообщило, что miR-326 может быть потенциальной терапевтической мишенью для лечения пациентов с ГЦК [14]. Поэтому в данном исследовании обсуждается механизм регуляции инвазии и миграции клеток ГЦК экзосомальным miR-326.

Материалы и методы

Этический аспект

Все эксперименты на животных проводились в соответствии с Руководством по уходу и использованию лабораторных животных Международными комитетами. Протокол был одобрен Комитетом по уходу и использованию животных Третьей больницы Цзилиньского университета.

Индукция и идентификация макрофагов

Линейка человеческих моноцитарных клеток THP-1 (Институт зоологии Куньмина, КАН, Куньминь, Китай) культивировали в среде RPMI 1640 (Gibco, CA, США; Thermo Fisher Scientific, MA, США) с 10% термоинактивированной фетовой говяжьей сывороткой (FBS). Клетки THP-1 инкубировали с 150 нг/мл форбол-12-миристат-13-ацетатом (PMA; P8139, Sigma-Aldrich, SF, CA, США) в среде RPMI в течение 24 ч для получения M0-макрофагов. Затем морфологию клеток до и после индукции наблюдали методом окраски Райта. Клетки THP-1 и индуцированные макрофаги ресуспендировали в 5 мкл ФСБ, наносили на стекла, окрашивали раствором Райта, смешанным с буферным раствором в соотношении 1:2. Окрашивали 10 мин, промывали текущей водой и наблюдали под микроскопом. Кроме того, маркеры M0-макрофагов (CD68 и CD206) измеряли методом обратной транскрипции количественной полимеразной цепной реакции (РТ-ОПР). Далее макрофаги индуцировали в M1-макрофаги инкубацией с 20 нг/мл интерферона (IFN)-γ (#285-IF; R&D Systems, MN, США) и 10 пг/мл LPS (#8630; Sigma-Aldrich) в течение 18 ч. Маркеры M1-макрофагов (IDO1 и IL-12 p35) определяли РТ-ОПР [15].

Извлечение экзосом

Экзосомы извлекали с помощью набора для разделения экзосом (ExoEasy Maxi Kit, Qiagen, Hilden, Германия). Супернатант макрофагов асептически собирали в 15-мл центрифужную пробирку и фильтровали через 0,8-мкм фильтрующую пленку. Супернатант каждой группы смешивали с буфером XBP (1:1) и центрифугировали с колонкой exoEasy membrane affinity при 500g. Клетки добавляли 10 мл буфера XWP и центрифугировали при 3000–5000g. Колонку exoEasy инкубировали с 400 мкл элюирующего буфера XE и центрифугировали при 500g. Элюирующий буфер переносили в колонку exoEasy и центрифугировали при 500g. Элюирующий буфер хранили 24 ч при 4 °C, затем использовали для идентификации. Остаток хранили при −80 °C.

ТЭМ-наблюдение и наночастицы трекинг-анализ (NTA)

Полученные экзосомы наносили на углеродоподдерживающую медную сетку и добавляли 2% фосфовольфрамовый кислоты. Образец наблюдали под ТЭМ, оптимальное изображение собирали и анализировали.

Примеси и частицы в ФСБ удаляли 0,22-мкм микропористым фильтром. В зависимости от плотности частиц экзосом, отфильтрованный ФСБ разбавляли до подходящей концентрации и детектировали с помощью наночастицы детектора Nanosight NS300 (Malvern, Westborough, MA, США).

После идентификации экзосомы макрофагов, трансфецированные ингибитором miR-326 и ингибитором негативного контроля (NC) miR-326, мимиком miR-326 и мимиком NC miR-326, извлекали с помощью набора для разделения экзосом (Invitrogen).

РТ-ОПР

Общую РНК извлекали реактивом Trizol (Thermo Fisher), количественный ПЦР в реальном времени проводили с использованием SYBR-Green PCR Master Mix (Roche) и системы ABI 7500 Real-Time PCR (Life Technologies, Grand Island, NY, США). Праймерные последовательности приведены в Таблице 1. Количественный анализ выполняли методом 2⁻ΔΔCt.

Вестерн-блот анализ

Общий белок клеток и экзосом извлекали. Концентрацию белка определяли набором бицинхониновой кислоты (BCA) (Boster Biological Technology Co. Ltd., Wuhan, Hubei, Китай). Белок смешивали с буфером образца и кипятили при 95 °C, в каждую ямку наносили 30 мкг. Белок разделяли электрофорезом в 10% полиакриlamide геле (Boster Biological Technology) и элютропереносили на поливинилиденфторидную мембрану, которую затем блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином (BSA). Мембрану инкубировали с первичными антителами против CD63 (1:1000, Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa, Ames, IA, США), CD181 (1:1000, R&D Systems), GAPDH (1:2000, Jackson ImmunoResearch Laboratories, PA, США) и вторичными антителами (1:500, Jackson ImmunoResearch Laboratories), отмеченными перекисным окислителем. Изображения получали системой двухцветного инфракрасного флуоресцентного сканирования Odyssey, а серые значения полос измеряли программой Quantity One.

Клеточная культура и скрининг

Нормальная печеночная линейка HL-7702 и человеческие линии ГЦК BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 и QGY-7703 культивировали в среде Gibco RPMI 1640 с 10% FBS, пенициллином (100 ЕД/мл) и стрептомицином (100 мг/мл). Экспрессию miR-326 определяли РТ-ОПР и отбирали подходящие линейки клеток.

Маркировка экзосом и их поглощение

Экзосомы ресуспендировали в 250 мкл разбавителя C и аккуратно гомогенизировали, избегая повреждения мембраны экзосом. Добавили 1 мкл красителя PKH67 (Sigma-Aldrich) в 250 мкл разбавителя C для получения 500 мкл и инкубировали. Раствор добавляли 500 мкл 1% BSA и инкубировали при 37 °C в течение 1 мин. Экзосомы получали центрифугированием при 120 000g 4 °C в течение 2 ч. Маркированные PKH67 экзосомы получали повторной центрифугацией при 120 000g 4 °C в течение 2 ч. Экзосомы ресуспендировали в 6 мл среды RPMI-1640, избегая света. Затем маркированные экзосомы ко-культивировали с клетками ГЦК в течение 12 ч. После этого среду удалили и промывали ФСБ 3 раза по 5 мин, тщательно смывая неинтернализованные флуоресцентные экзосомы. Экзосомы фиксировали 4% параформальдегидом и окрашивали 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом. После монтирования флуоресцентное распределение наблюдали лазерным конфокальным микроскопом.

Группировка клеток и лечение

Клетки HepG2 и SMMC-7721 посеяли в 12-ямочные пластинки по 0,5–1 × 10⁶ клеток/яма. При 50–60% конфлюэнтности клетки трансфецировали Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA). Клетки HepG2 распределили в группу miR-326-мимик (трансфекция мимиком miR-326) и группу NC-мимик (трансфекция NC мимика miR-326). Клетки SMMC-7721 распределили в группу miR-326-ингибитор (трансфекция ингибитором miR-326) и группу NC-ингибитор (трансфекция NC ингибитора miR-326). Мимик miR-326, ингибитор miR-326 и их NC смешивали с Lipofectamine 2000 для трансфекции. Клетки HepG2 и SMMC-7721 без лечения служили контрольной (пустой) группой. Мимик miR-326, ингибитор miR-326 и их NC разрабатывались и составлялись компанией Guangzhou RibBio Co., Ltd. (Гуанчжоу, Китай) (Таблица 1).

Ко-культивация экзосом M1-макрофагов с клетками ГЦК

Концентрацию белка суспензии экзосом M1-макрофагов определяли методом BCA и рассчитывали объем соответствующей суспензии экзосом с 50 мкг белка. Клетки HepG2 и SMMC-7721 посеяли в 12-ямочные пластинки по 1 × 10⁵ клеток/мл на яму. Клетки HepG2 распределили на 4 группы: контрольная группа (HepG2 без ко-культивации с экзосомами), группа экзосом (Exo) (HepG2 ко-культивированы с экзосомами M1-макрофагов), группа Exo-miR-326-мимик (HepG2 ко-культивированы с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326), группа Exo-NC-мимик (HepG2 ко-культивированы с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными NC мимика miR-326). Клетки SMMC-7721 также распределили на 4 группы: пустая группа (SMMC-7721 без ко-культивации с экзосомами), группа Exo (SMMC-7721 ко-культивированы с экзосомами M1-макрофагов), группа Exo-miR-326-ингибитор (SMMC-7721 ко-культивированы с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326), группа Exo-NC-ингибитор (SMMC-7721 ко-культивированы с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными NC ингибитора miR-326).

МТТ-тест

Клетки отшелачивали трипсином и посеяли в 96-ямочную пластинку с плотностью 4 × 10⁴ клеток/яма. Культурную среду удаляли после инкубации 12, 24, 36, 48, 60 ч соответственно. Инкубировали с 500 мкл 0,5 г/л раствора МТТ, добавляли 200 мкл раствора диметилсульфоксида, гомогенизировали и инкубировали. Оптическую плотность (OD, 490 нм) измеряли фотоометром.

Тест на колонизацию

После 24-часовой инкубации и отшелачивания трипсином клетки посеяли в 35-мм блюдце по 300 клеток/блюдце. Раствор меняли каждые 3 дня. После 10 дней культивирования клетки фиксировали 40 г/л параформальдегидом и окрашивали 1 г/л кристаллическим фиолетом и сушили. Количество колоний (более 50 клеток) считали под микроскопом.

Transwell-тест

Клетки (1 × 10⁵) ресуспендировали в 200 мкл бессывороточной среды. Эксперименты проводили согласно инструкции камеры Transwell (Corning Glass Works, Corning, N.Y., USA) (матригель требовался для теста на инвазию, но не для миграции). В нижнюю камеру добавляли 600 мкл RPMI 1640 (10% FBS). Верхняя и нижняя камеры разделялись мембраной Transwell, предварительно покрытой матригелем (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA). После 24-часовой инкубации камеру фиксировали 95% спиртом. После окраски кристаллическим фиолетом клетки наблюдали в пяти полях зрения под микроскопом.

Цитометрию потока

Клеточный цикл: клетки отшелачивали трипсином. Клетки (1 × 10⁶) ресуспендировали в 0,5 мл ФСБ и приводили к однородной суспензии. Смешивали с 4,5 мл предохлажденного 70% этанола на льду, центрифугировали при 3000g, промывали 5 мл ФСБ и снова центрифугировали при 3000g. Затем клетки ресуспендировали в 1 мл раствора PI/Triton X-100 (20 мкг PI/0,1% Triton X-100) с 0,2 мг RnaseA. Клеточный цикл определяли цитометрией потока.

Апоптоз: трипсинизированные клетки (1 × 10⁶) ресуспендировали в 1 мл ФСБ, гомогенизировали и центрифугировали при 3000g. Клетки промывали по очереди инкубационным буфером (10 ммоль/л Hepes/NaOH, pH 7,4, 140 ммоль/л NaCl, 5 ммоль/л CaCl₂) и центрифугировали при 3000g. Затем клетки инкубировали с 100 мкл маркировочного раствора (FITC-Annexin V и PI добавляли в инкубационный буфер до 1 мкг/мл), центрифугировали при 3000g, промывали один раз инкубационным буфером и инкубировали с флуоресцентным раствором (SA-FLOUS). Апоптоз определяли цитометрией потока. Длина волны цитометрии — 488 нм, FITC-флуоресценция детектировалась полосовым фильтром при 515 нм, PI — при длине волны >560 нм. Результаты анализировались автоматически компьютером.

Ксенотрансплантация опухоли в нюдовых мышах

40 мышей (Колледж животноводства Цзилиньского университета, Цзилинь, Китай) возраста 4–6 недель случайно распределили по 8 группам, по 5 мышей в каждой. Мышей содержали в СПФ-вивариуме 1 неделю, корм, подстилку и бутылки с водой меняли своевременно. Состояние здоровья мышей наблюдали ежедневно. Через неделю клетки ГЦК подготовили в виде суспензии и субкутанно инъецировали в шею и спину по 0,1 мл суспензии (1 × 10⁶). Рост опухоли наблюдали через 3–5 дней. Нюдовых мышей взвешивали каждые 4 дня, объем опухоли измеряли. Мышей эвтаназировали через 20 дней после инъекции.

Статистический анализ

Все данные обрабатывали программой SPSS 17.0 (SPSS Statistics, Chicago, IL, США). Измеряемые данные выражали как среднее ± стандартное отклонение. Сравнение двух групп проводили t-критерием Стьюдента, сравнение множественных групп — однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA). P < 0,05 считалось статистически значимой разницей.

Результаты

Идентификация M1-макрофагов и экзосом

Окраска Райта использовалась для наблюдения морфологии клеток THP-1, индуцированных PMA. Наблюдали, что объем клеток THP-1 до индукции был мал, соотношение кариоплазмы выше; после индукции морфология клеток стала неправильной, объем увеличился, соотношение кариоплазмы снизилось; цитоплазма стала богаче, светло-голубой, с обильными гранулами и редкими вакуолами; ядро было пурпурно-красным и часто смещено к одной стороне, что показывает типичные морфологические признаки макрофагов (рис. 1a).

Идентификация M1-макрофагов и экзосом. a Окраска Райта для наблюдения морфологии клеток THP-1 до и после лечения PMA. b Экспрессия CD68 и CD206 в клетках THP-1 и PMA-индуцированных клетках THP-1, определенная РТ-ОПР; c морфология макрофагов и M1-макрофагов. d Экспрессия IDO1 и IL-12 p35 в M0-макрофагах и M0-макрофагах, обработанных LPS и INF-γ, определенная РТ-ОПР. e ТЭМ для наблюдения экзосом. f Определение распределения размера частиц экзосом методом NTA. g Белковые полосы CD63 и CD181. На панели b, *P < 0,05 относительно клеток THP-1; на панели d, *P < 0,05 относительно M0-макрофагов. Измеряемые данные изображены как среднее ± стандартное отклонение (N = 3), сравнения двух групп проводили t-тестом

Для дальнейшей верификации успешной индукции макрофагов, экспрессию CD68 и CD206 до и после индукции измеряли РТ-ОПР. Показано, что экспрессия CD68 и CD206 повысилась после индукции PMA, указывая на успешную индукцию THP-1 в M0-макрофаги (рис. 1b). Затем M0-макрофаги поляризовали в M1-макрофаги индукцией LPS и INF-γ. Морфологию и экспрессию маркеров M1-макрофагов IDO1 и IL-12 p35 наблюдали и измеряли. M0-макрофаги демонстрировали разнообразные и неправильные адгезивные морфологии: круглые, эллиптические или веретеновидные. Морфология макрофагов, стимулированных IFN-γ, демонстрировала больше псевдоножек и выростов, веретеновидную форму (рис. 1c). РТ-ОПР показал (рис. 1d), что после обработки LPS и INF-γ M1-макрофаги показали увеличение своих маркеров (IDO1 и IL-12p35).

Затем экзосомы, полученные из макрофагов, наблюдали ТЭМ. Выяснилось, что экзосомы, полученные из макрофагов, многочисленны, имеют круглую или овальную форму, мембранозную структуру, единообразный размер и мало примесей (рис. 1e). NTA показал, что экзосомы с централизованным пиком кривой MODE и гладкой линией имеют более концентрированный диаметр и меньше примесей (рис. 1f). Вестерн-блот анализ показал, что по сравнению с макрофагами, экспрессия специфических маркерных белков CD63 и CD181 повысилась в экзосомах, полученных из макрофагов (рис. 1g). Эти результаты указывают на то, что мы успешно индуцировали моноциты в макрофаги и поляризовали их в M1-макрофаги.

Экзосомы M1-макрофагов доставляют miR-326 в клетки ГЦК и влияют на экспрессию miR-326 в клетках ГЦК

Для проверки того, доставляют ли экзосомы M1-макрофагов miR-326 в клетки ГЦК, клетки HepG2 и SMMC-7721 ко-культивировали с экзосомами. Установили, что большое количество экзосом ассимилировалось клетками HepG2 и SMMC-7721 через 4 ч трансфекции под флуоресцентным микроскопом (рис. 2a, b).

Экзосомы M1-макрофагов доставляют miR-326 в клетки ГЦК и влияют на экспрессию miR-326 в клетках ГЦК. a Поглощение экзосом M1-макрофагов клетками HepG2. b Поглощение экзосом M1-макрофагов клетками SMMC-7721. c Сравнение экспрессии miR-326 экзосом макрофагов в каждой группе до и после индукции INF-γ и LPS. d Экспрессия miR-326 в линейках клеток ГЦК (BEL-7404, HepG2, SMMC-7721, QGY-7703) и нормальных печеночных клетках HL-7702, определенная РТ-ОПР. e РТ-ОПР определил эффект мимика miR-326 на экспрессию miR-326 в клетках HepG2. f РТ-ОПР определил эффект ингибитора miR-326 на экспрессию miR-326 в клетках SMMC-7721. g РТ-ОПР определил эффекты экзосом M1-макрофагов, трансфецированных мимиком miR-326, на экспрессию miR-326 в клетках HepG2. h РТ-ОПР определил эффекты экзосом M1-макрофагов, трансфецированных ингибитором miR-326, на экспрессию miR-326 в клетках SMMC-7721. На панели c, *P < 0,05 относительно M0-макрофага; на панели d, *P < 0,05 относительно клеток HL-7702; на панели e, *P < 0,05 относительно группы NC-мимик; на панели f, *P < 0,05 относительно группы NC-ингибитор; на панели g, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-мимик; на панели h, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-ингибитор. Измеряемые данные изображены как среднее ± стандартное отклонение (N = 3), сравнения множественных групп проводили однофакторным дисперсионным анализом

Затем miR-326-мимик/ингибитор трансфецировали в макрофаги и проверили экспрессию miR-326 в их экзосомах до и после трансфекции. Показано, что по сравнению с экзосомами M0-макрофагов, экспрессия miR-326 повысилась в экзосомах M1-макрофагов. Повышенная экспрессия miR-326 наблюдалась в экзосомах M1-макрофагов с лечением мимиком miR-326. Экспрессия miR-326 снизилась в экзосомах M1-макрофагов с лечением ингибитором miR-326 (рис. 2c).

Затем измеряли экспрессию miR-326 в линейках клеток ГЦК. Как показано, экспрессия miR-326 была снижена в клетках BEL-7404, HepG2, SMMC-7721 и QGY-7703 по сравнению с клетками HL-7702, причем в клетках HepG2 экспрессия была наименьшей, а в SMMC-7721 — наибольшей (рис. 2d).

Далее мимик miR-326 и ингибитор miR-326 трансфецировали в клетки HepG2 и SMMC-7721 соответственно и изучили их влияние на экспрессию miR-326. Мимик miR-326 повысил экспрессию miR-326 в клетках HepG2, в то время как ингибитор miR-326 снизил экспрессию miR-326 в клетках SMMC-7721 (рис. 2e, f).

Далее экзосомы M1-макрофагов, трансфецированные мимиком miR-326 и ингибитором miR-326, ко-культивировали с клетками HepG2 и SMMC-7721 соответственно. Отмечено, что ко-культивация с экзосомами повысила экспрессию miR-326 в клетках ГЦК, экзосомы M1-макрофагов, трансфецированные мимиком miR-326, дальнейше повысили экспрессию miR-326 в клетках HepG2, в то время как экзосомы M1-макрофагов, трансфецированные ингибитором miR-326, понизили экспрессию miR-326 в клетках SMMC-7721 (рис. 2g, h). Предлагается, что экзосомы M1-макрофагов доставляют miR-326 в клетки ГЦК и влияют на экспрессию miR-326 в клетках ГЦК.

Экзосомальный miR-326 от M1-макрофагов снижает пролиферацию и колонизацию клеток ГЦК

В изучении эффекта экзосомального miR-326 на пролиферацию клеток ГЦК проводили МТТ-тест и тест на колонизацию для изучения пролиферации клеток ГЦК. Показано, что в клетках HepG2 восстановление miR-326 нарушало пролиферацию и способность к колонизации (рис. 3a, e, f). Экзосомы M1-макрофагов препятствовали пролиферации и колонизации клеток HepG2. Экзосомы M1-макрофагов, трансфецированные мимиком miR-326, дальнейше нарушали пролиферацию и способность к колонизации (рис. 3c, i, j).

Экзосомальный miR-326 M1-макрофагов ингибирует пролиферацию и колонизацию клеток ГЦК. a МТТ-тест определил эффект трансфекции мимика miR-326 на пролиферацию клеток HepG2. b МТТ-тест определил эффект трансфекции ингибитора miR-326 на пролиферацию клеток SMMC-7721. c МТТ-тест определил эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326, на пролиферацию клеток HepG2. d МТТ-тест определил эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326, на пролиферацию клеток SMMC-7721. e Тест на колонизацию определил эффект трансфекции мимика miR-326 на способность к колонизации клеток HepG2. f Количество колоний клеток HepG2. g Тест на колонизацию определил эффект трансфекции ингибитора miR-326 на способность к колонизации клеток SMMC-7721. h Количество колоний клеток SMMC-7721. i Тест на колонизацию определил эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326, на способность к колонизации клеток HepG2. j Количество колоний клеток HepG2, обработанных экзосомами. k Тест на колонизацию определил эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326, на способность к колонизации клеток SMMC-7721. l Количество колоний клеток SMMC-7721, обработанных экзосомами. На панелях a и f, *P < 0,05 относительно группы NC-мимик; на панелях b и h, *P < 0,05 относительно группы NC-ингибитор; на панелях c и j, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-мимик; на панелях d и l, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-ингибитор. Измеряемые данные изображены как среднее ± стандартное отклонение (N = 3), сравнения множественных групп проводили однофакторным дисперсионным анализом

В клетках SMMC-7721 нокаут miR-326 усиливал пролиферацию и способность к колонизации (рис. 3b, g, h). В клетках SMMC-7721, обработанных экзосомами M1-макрофагов, пролиферация и способность к колонизации снижались. Экзосомы M1-макрофагов, трансфецированные ингибитором miR-326, дальнейше поощряли пролиферацию и способность к колонизации (рис. 3d, k, l). Подсказывает, что miR-326, полученный из экзосом M1-макрофагов, препятствует пролиферации клеток ГЦК.

Экзосомальный miR-326 от M1-макрофагов подавляет миграцию и инвазию клеток ГЦК

Затем изучали эффект экзосомального miR-326 на инвазию и миграцию клеток ГЦК. Показано, что в клетках HepG2 восстановление miR-326 ограничивало инвазию и миграцию (рис. 4a–c). Экзосомы M1-макрофагов нарушали инвазию и миграцию клеток HepG2. Инвазия и миграция дальнейше снижались при ко-культивации клеток HepG2 с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326 (рис. 4g–i).

Экзосомальный miR-326 M1-макрофагов ингибирует миграцию и инвазию клеток ГЦК. a Transwell-тест определил эффект трансфекции мимика miR-326 на инвазию клеток HepG2. b Transwell-тест определил эффект трансфекции мимика miR-326 на миграцию клеток HepG2. c Количество инвазии и миграции клеток HepG2. d Transwell-тест определил эффект трансфекции ингибитора miR-326 на инвазию клеток SMMC-7721. e Transwell-тест определил эффект трансфекции ингибитора miR-326 на миграцию клеток SMMC-7721. f Количество инвазии и миграции клеток SMMC-7721. g Transwell-тест определил эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326, на инвазию клеток HepG2. h Transwell-тест определил эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326, на миграцию клеток HepG2. i Количество инвазии и миграции клеток HepG2, ко-культивированных с экзосомами M1-макрофагов. j Transwell-тест определил эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326, на инвазию клеток SMMC-7721. k Transwell-тест определил эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326, на миграцию клеток SMMC-7721. l Количество инвазии и миграции клеток SMMC-7721, ко-культивированных с экзосомами M1-макрофагов. На панели c, *P < 0,05 относительно группы NC-мимик; на панели f, *P < 0,05 относительно группы NC-ингибитор; на панели i, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-мимик; на панели l, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-ингибитор. Измеряемые данные изображены как среднее ± стандартное отклонение (N = 3), сравнения множественных групп проводили однофакторным дисперсионным анализом

Нокаут miR-326 приводил к усилению инвазии и миграции клеток SMMC-7721 (рис. 4d–f). При обработке экзосомами M1-макрофагов клетки SMMC-7721 демонстрировали снижение инвазии и миграции. Однако инвазия и миграция клеток SMMC-7721 усиливались при ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326 (рис. 4j–l). Подразумевается, что miR-326, полученный из экзосом M1-макрофагов, препятствует инвазии и миграции клеток ГЦК.

Экзосомальный miR-326 от M1-макрофагов способствует апоптозу клеток ГЦК

При изучении эффекта экзосомального miR-326 на клеточный цикл и апоптоз клеток ГЦК применяли однократную окраску PI и двойную окраску Annexin V-FITC/PI. Показано, что сверхэкспрессия miR-326 увеличила количество клеток, застаревших в фазе G0/G1, снизила клетки в фазах S и G2/M и повысила апоптоз в клетках HepG2 (рис. 5a–d). Ко-культивация с экзосомами M1-макрофагов увеличила клетки в фазе G0/G1, снизила клетки в фазах S и G2/M и повысила апоптоз клеток HepG2. Ко-культивация с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326, дальнейше усилила эти эффекты (рис. 5i–l).

Экзосомальный miR-326 M1-макрофагов способствует апоптозу клеток ГЦК. a, b Цитометрия потока определила эффект трансфекции мимика miR-326 на клеточный цикл HepG2; c, d цитометрия потока определила эффект трансфекции мимика miR-326 на апоптоз HepG2; e, f цитометрия потока определила эффект трансфекции ингибитора miR-326 на клеточный цикл SMMC-7721; g, h цитометрия потока определила эффект трансфекции ингибитора miR-326 на апоптоз SMMC-7721; i, j цитометрия потока определила эффекты ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326, на клеточный цикл HepG2; k, l цитометрия потока определила эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326, на апоптоз HepG2; m, n цитометрия потока определила эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326, на клеточный цикл SMMC-7721; o, p цитометрия потока определила эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326, на апоптоз SMMC-7721. На панелях b и d, *P < 0,05 относительно группы NC-мимик; на панелях f и h, *P < 0,05 относительно группы NC-ингибитор; на панелях j и l, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-мимик; на панелях n и p, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-ингибитор. Измеряемые данные изображены как среднее ± стандартное отклонение (N = 3), сравнения множественных групп проводили однофакторным дисперсионным анализом

В клетках SMMC-7721 понижение экспрессии miR-326 снизило клетки в фазе G0/G1, повысило клетки в фазах S и G2/M и снизило апоптоз (рис. 5e–h). Нетрансфецированные экзосомы M1-макрофагов увеличили клетки в фазе G0/G1, снизили клетки в фазах S и G2/M и повысили апоптоз. Экзосомы M1-макрофагов, трансфецированные ингибитором miR-326, снизили клетки в фазе G0/G1, повысили клетки в фазах S и G2/M и снизили апоптоз (рис. 5m–p). Кратко: miR-326 из экзосом M1-макрофагов застаривает клеточный цикл в фазе G0/G1 и индуцирует апоптоз в ГЦК.

Экзосомальный miR-326 от M1-макрофагов снижает экспрессию CD206 и NF-κB в клетках ГЦК

Далее исследовали потенциальный механизм miR-326 из экзосом M1-макрофагов в биологическом прогрессе клеток ГЦК. NF-κB является ключевой связью между воспалением и раком. Многие регуляторные белки и miRНК могут ингибировать чрезмерно активированный NF-κB сигналинг для подавления рака [16]. Такой благоприятный эффект может включать поляризацию M2-макрофагов в M1-макрофаги. Экспрессию CD206 и NF-κB в клетках HepG2 и SMMC-7721 измеряли РТ-ОПР. Показано, что восстановление miR-326 снизило экспрессию CD206 и NF-κB в клетках HepG2, в то время как нокаут miR-326 повысил экспрессию CD206 и NF-κB в клетках SMMC-7721 (рис. 6a, b). Кроме того, ко-культивация с экзосомами M1-макрофагов значительно снизила экспрессию CD206 и NF-κB в клетках HepG2, в то время как ко-культивация с экзосомами M1-макрофагов, сверхэкспрессирующими miR-326, дальнейше снизила экспрессию CD206 и NF-κB. При обработке нетрансфецированными экзосомами M1-макрофагов экспрессия CD206 и NF-κB снизилась в клетках SMMC-7721. При ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326, клетки SMMC-7721 характеризовались повышением экспрессии CD206 и NF-κB (рис. 6c, d). Сделан вывод, что miR-326 из экзосом M1-макрофагов играет роль опухолевого супрессора, ингибируя NF-κB в клетках ГЦК.

Экзосомальный miR-326 M1-макрофагов снижает экспрессию CD206 и NF-κB в клетках ГЦК. a РТ-ОПР определил эффект трансфекции мимика miR-326 на экспрессию CD206 и NF-κB в клетках HepG2; b РТ-ОПР определил эффект трансфекции ингибитора miR-326 на экспрессию CD206 и NF-κB в клетках SMMC-7721. c РТ-ОПР определил эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326, на экспрессию CD206 и NF-κB в клетках HepG2; d РТ-ОПР определил эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326, на экспрессию CD206 и NF-κB в клетках SMMC-7721. На панели a, *P < 0,05 относительно группы NC-мимик; на панели b, *P < 0,05 относительно группы NC-ингибитор; на панели c, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-мимик; на панели d, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-ингибитор. Измеряемые данные изображены как среднее ± стандартное отклонение (N = 3), сравнения множественных групп проводили однофакторным дисперсионным анализом

miR-326 из экзосом M1-макрофагов ингибирует рост опухоли ГЦК ин vivo

Наконец, ин vivo результаты верифицировали через ксенотрансплантацию опухолей. Как показано, сверхэкспрессия miR-326 снизила объем и вес опухолей в клетках HepG2 (рис. 7a–c). В мышах, трансплантированных клетками HepG2, ко-культивированными с экзосомами, лечение экзосомами M1-макрофагов значительно снизило объем и вес опухолей клеток HepG2, в то время как лечение экзосомами M1-макрофагов, сверхэкспрессирующими miR-326, дальнейше снизило объем и вес опухолей клеток HepG2 (рис. 7g–i).

Экзосомальный miR-326 M1-макрофагов снижает объем и вес опухоли ГЦК ин vivo. a–c Эффект трансфекции мимика miR-326 на объем опухоли и опухоль нюдовых мышей, ксенотрансплантированных клетками HepG2. d–f Эффект трансфекции ингибитора miR-326 на объем опухоли и опухоли нюдовых мышей, ксенотрансплантированных клетками SMMC-7721. g–i Эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными мимиком miR-326, на объем опухоли и опухоль нюдовых мышей, ксенотрансплантированных клетками HepG2. j–l Эффект ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326, на объем опухоли и опухоль нюдовых мышей, ксенотрансплантированных клетками SMMC-7721. На панелях b и c, *P < 0,05 относительно группы NC-мимик; на панелях e и f, *P < 0,05 относительно группы NC-ингибитор; на панелях h и i, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-мимик; на панелях k и l, *P < 0,05 относительно контрольной группы, #P < 0,05 относительно группы Exo-NC-ингибитор. Измеряемые данные изображены как среднее ± стандартное отклонение (n = 5), сравнения множественных групп проводили однофакторным дисперсионным анализом

В клетках SMMC-7721 подавление miR-326 увеличило объем и вес опухолей (рис. 7d–f). Нетрансфецированные экзосомы M1-макрофагов препятствовали росту опухолей по объему и весу клеток SMMC-7721. При ко-культивации с экзосомами M1-макрофагов, трансфецированными ингибитором miR-326, клетки SMMC-7721 инъецировали в мышей и вызвали увеличение объема и веса опухолей (рис. 7j–l). Подводя итог, miR-326, полученный из экзосом M1-макрофагов, подавляет рост опухоли ГЦК ин vivo.

Обсуждение

ГЦК — распространенный рак, характеризующийся высокой заболеваемостью и смертностью, трудной ранней диагностикой и лечением, плохой прогнозом и 5-летней выживаемостью [17]. Недавнее исследование подчеркнуло, что слабо экспрессируемая лнцРНК cox-2 снижает способность M1-макрофагов подавлять рост, инвазивность, ангиогенез, миграцию клеток ГЦК и способствовать апоптозу [18]. Hu и соавт. обсудили, что miR-326 явно понижена в тканях ГЦК и линейках клеток, в то время как пониженная miR-326 связана со стадией TNM, метастазами лимфатических узлов и дифференциацией пациентов с ГЦК [14]. Обычно считается, что экзосомы, производные от клеток ГЦК, могут формировать благоприятную микросреду для роста, инвазивности и метастазирования клеток ГЦК, а также развития лекарстоустойчивости [19]. Текущее исследование направлено на изучение механизма экзосомального miR-326 в регуляции инвазии и миграции клеток ГЦК.

Наши результаты показали, что экспрессия miR-326 снижена в клетках ГЦК, но повышена в экзосомах. Недавнее исследование указало, что экспрессия miR-326 снижена в тканях ГЦК [20]. Другое исследование представило, что экспрессия miR-326 заметно снижена в линейках клеток ГЦК и тканях, и ее понижение предсказывает плохую прогноз при ГЦК [13]. Сообщается, что miR-326 играет роль опухолевого супрессора и сильно подавлена в клетках ГЦК [21]. Все эти упомянутые доказательства согласуются с нашими находками. Исследование утверждало, что по сравнению с контрольными, экспрессия miR-326 повышена в экзосомах, производных от Tconv, что наблюдается у пациентов с ремиссирующе-рецидивирующей формой рассеянного склероза [11].

Другие результаты, вытекающие из наших данных: высокоэкспрессируемый экзосомальный miR-326 снижал пролиферацию, колонизацию, миграцию и инвазию, а также способствовал апоптозу клеток ГЦК ин vitro и снижал объем и вес опухоли ГЦК ин vivo. Ранее предполагалось, что рост клеток ГЦК может быть подавлен сверхэкспрессией miR-326, а способность клеток ГЦК к миграции и инвазии заметно ослабляется путем повышения miR-326 [21]. Сообщается, что повышенная экспрессия miR-326 подавляет рост и инвазивность клеток ГЦК, а также стимулирует апоптоз ин vitro [14]. Кроме того, предыдущее исследование подтвердило, что сверхэкспрессия miR-326 снижает рост опухоли ин vivo [13]. Исследование показало, что эктопическая экспрессия miR-326 заметно ослабляет рост клеток и подавляет клеточную миграцию и инвазивность в линейках клеток немалоклеточного рака легких [22]. Более того, найдено, что miR-326 снижает профибrotic гены, такие как MMP-9, подразумевая ее репрессивную функцию в пролиферации раковых клеток [23]. Также показано, что miR-326 подавляет экспрессию белка Bcl-2 и повышает экспрессию Bax, влияя на апоптоз [24]. Аналогично нашим находкам, некоторые miRНК взаимодействуют с экзосомами, играя роль в развитии ГЦК. Показано, что высокоэкспрессируемый экзосомальный miR-638 может подавлять пролиферацию клеток ГЦК, вовлекая потенциальное влияние на канцерогенез [25]. Другое исследование также доказывает, что экзосомальный miR-451a, производный от клеток ГЦК, подавляет опухолевую ангиогенез через нарушение эндотелиальных функций: апоптоза, формирования трубок, миграции и проницаемости [26]. Предыдущее исследование в целом подтверждает, что при обработке экзосомами со сверхэкспрессией miR-744 пролиферация клеток ГЦК драматически подавляется [27].

Заключение

Кратко подводя итог, наше исследование предоставляет доказательства того, что экзосомальный miR-326 от M1-макрофагов подавляет пролиферацию, миграцию и инвазию, а также способствует апоптозу клеток ГЦК, предлагая новое понимание новой мишеневой терапии для ГЦК. Из-за ограниченного размера выборки и ограниченных известных исследований точный механизм miR-326 не полностью разъяснен, поэтому необходимы дальнейшие крупномасштабные исследования для иллюстрации базового механизма.

Аббревиатуры

ГЦК (HCC):

Гепатоцеллюлярная карцинома (Hepatocellular carcinoma)

miRНК (miRNAs):

МикроРНК (MicroRNAs)

FBS:

Фетовая говяжья сыворотка (Fetal bovine serum)

M/CSF:

Фактор колониестимулирующий макрофаги (Macrophage colony-stimulating factor)

ФСБ (PBS):

Фосфатно-солевой буфер (Phosphate buffered saline)

DMEM:

Модифицированная среда Эйгла Дюльбекко (Dulbecco’s modified eagle medium)

PPAR:

Пероксизомный пролифератор-активированный рецептор (Peroxisome proliferator-activated receptor)

ТЭМ (TEM):

Проходной электронный микроскоп (Transmission electron microscope)

NTA:

Наночастицы трекинг-анализ (Nanoparticle tracking analysis)

NC:

Негативный контроль (Negative control)

РТ-ОПР (RT-qPCR):

Обратная транскрипция количественная полимеразная цепная реакция (Reverse transcription quantitative polymerase chain reaction)

BCA:

Бицинхониновая кислота (Bicinchoninic acid)

BSA:

Бычий сывороточный альбумин (Bovine serum albumin)

Exo:

Экзосомы (Exosomes)

ANOVA:

Однофакторный дисперсионный анализ (One-way analysis of variance)