Золотые наночастицы модулируют активность CYP3A4 и клеточную токсичность в человечном гепатоцеллюлярном карциноме: влияние размера, поверхностной химии и белкового короны

Аннотация

Мы исследовали, как 40- и 80-нм золотые наночастицы (AuNP), функционализированные катионным разветвленным полиэтиленимином (BPEI), анионной липоевой кислотой (LA) или нейтральным полиэтиленгликолем (PEG), взаимодействуют с линией человечного гепатоцеллюлярного карциномы (HCC) C3A, как в присутствии, так и в отсутствии человеческой плазменной белковой короны (PC). Голубые AuNP, кроме 80-нм LA-AuNP, были цитотоксичны к клеткам C3A, но PC значительно смягчал эти эффекты. Время-зависимое клеточное поглощение увеличивалось для 40-нм BPEI-AuNP, тогда как PC снижал поглощение 80-нм PEG-AuNP. BPEI-AuNP вызывали бифазный оксидативный/нитросативный стресс-ответ, в то время как PEG-AuNP действовали как мощный антиоксидант. Все голые AuNP ингибировали активность CYP3A4 независимо от размера или поверхностного заряда, но PC восстанавливал активность за исключением PEG-AuNP. 40-нм PEG-AuNP индуцировали изменения геновой экспрессии, в основном затрагивающие митохондриальное β-окисление жирных кислот и, в меньшей степени, печеночные эффлюкс/апсорпционные транспортеры. Эти выводы углубляют наше понимание AuNP-клеточных взаимодействий и их молекулярных основ в HCC, предлагая инсайты для улучшенных терапевтических стратегий.

Введение

Гепатоцеллюлярная карцинома (HCC) остается одной из наиболее распространенных раков во всем мире и наиболее быстро растущей причиной раковой смертности в Соединенных Штатах [1, 2]. Текущие куративные опции — печеночная трансплантация или хирургическая ресекция — ограничены ранними стадиями заболевания, в то время как продвинутые опухоли полагаются на химиотерапию или лучевую терапию, обе страдающие от низкой селективности и значительной системной токсичности [3, 4]. Ген-сайленсинг терапии, особенно РНК-интерференция (RNAi), обещают более высокую специфичность, но эффективная доставка требует векторов, безопасно проникающих в целевые клетки. В то время как вирусные векторы предлагают высокую эффективность трансдукции, невирусные платформы такие как наночастицы (NP) предпочтительны за их профиль безопасности и настраиваемые физико-химические свойства [5–8]. Золотые наночастицы (AuNP) особенно привлекательны благодаря их легкой поверхностной модификации и оптических особенностям, позволяющим таргетированную доставку терапевтических грузов [11, 12]. Однако при входе в кровоток AuNP приобретают белковую корону (PC), которая меняет их поверхностную химию и следовательно их биологическую судьбу, включая клеточное поглощение и токсичность [13–17]. Понимание того, как размер NP, поверхностный заряд и PC модулируют клеточные ответы в HCC клетках, критично для проектирования безопасных и эффективных наномедицин.

Методы

Синтез золотых наночастиц

40- и 80-нм AuNP были кастомно изготовлены nanoComposix (San Diego, CA). Функционализация с BPEI, LA или PEG достигалась через EDC химию, дигидролипоевую кислоту конъюгацию или тиол-метокси PEGилирование соответственно. Размер, полидисперсионный индекс (PDI) и дзета-потенциал подтверждали динамическим световым рассеянием (DLS), трансляционной электронной микроскопией (ТЭМ) и UV-ВИС спектроскопией. AuNP очищали тангенциальной потоковой фильтрацией (TFF) и стерильно фильтровали.

Подготовка белковой короны

Человеческая плазма (n=5) от Biological Specialty Corp. (Colmar, PA) смешивали с AuNP при 55% (v/v) и инкубировали при 37 °C, 250 об/мин 1 ч. Слабо связанные белки удаляли повторными PBS промывками (20 000 × g, 20 мин). Полученные PC-покрытые AuNP перевзвешивали в PBS и затем разбавляли в клеточную культуру среду.

Физико-химическая характеристика AuNP

Гидродинамические диаметры (D_H), PDI и дзета-потенциал голых и PC-покрытых AuNP измеряли в DI воде, PBS и полном EMEM (10% FBS) при 25 °C и 37 °C (0 и 24 ч). Оптические абсорбционные спектры регистрировали при комнатной температуре.

Трансляционная электронная микроскопия

Морфология AuNP оценивали ТЭМ (Tecnai G2 Spirit BioTWIN, 120 кВ). Образцы наносили на 200-меш медные сетки и сушили на воздухе.

Клеточная культура и измерение жизнеспособности

Клетки C3A (ATCC CRL-10741) культивировали в EMEM + 10% FBS, посеяли при 8 × 10⁴ клеток/колодец (96-колодцевые пластинки) и позволяли прикрепляться 48 ч перед дозированием. Жизнеспособность измеряли аламарBlue® анализом после 24 ч воздействия AuNP концентраций от 0 до 250 мкг/см².

Клеточное поглощение измерением ICP-MS

Клетки лечили 1,56 мкг/см² AuNP 0,5–24 ч. После этапа этчинга для удаления поверхностно-связанных частиц, клетки дайджестили в аква регия, и внутриклеточный Au квантифицировали ICP-MS. Поглощение выражали как AuNP на клетку.

Измерения оксидативного/нитросативного стресса

ROS/RNS производство квантифицировали используя общий ROS/SO анализный набор (Enzo Life Sciences) при 1, 3 и 24 ч после воздействия 40-нм BPEI- и PEG-AuNP до 125 мкг/см².

Цитохром P450 3A4 активность

CYP3A4 активность оценивали P450-Glo™ анализом (Promega) после 24 ч воздействия LC₅₀ концентраций каждого типа AuNP. Люминесценция нормализовывали к контрольным средствам.

Геновая экспрессия профилирование

Учитывая выраженные эффекты 40-нм PEG-AuNP, клетки C3A подвергали воздействию его LC₅₀ (129,5 мкг/см²) 24 ч. Общий РНК (RIN ≥ 7,8) изолировали, обратно транскрибировали и анализировали Human Molecular Toxicology Pathway Finder и Human Drug Transporters RT² Profiler™ PCR массивами (Qiagen). Дифференциально экспрессированные гены (|fold change| > 2, p < 0,05) валидировали qRT-PCR для девяти репрезентативных генов.

Статистический анализ

LC₅₀ значения подгоняли переменным-склоном уравнением Хилла в GraphPad Prism. Однофакторный ANOVA (SAS 9.4) с последующим Tukey HSD тестом оценивали значимость (p < 0,05).

Результаты и обсуждение

Физико-химическая характеристика голых и PC-покрытых AuNP

Как показано на рис. 1, ТЭМ подтвердил монодисперсные AuNP с размерами, соответствующими номинальным 40 и 80 нм диаметрам. PC формирование индуцировало небольшое увеличение D_H и красный сдвиг в UV-ВИС плазмонном пике, указывая на белковую адсорбцию. В полном EMEM D_H и PDI оставались стабильными 24 ч, за исключением PC-BPEI-AuNP, который демонстрировал временное снижение PDI, предполагая усиленную коллоидную стабильность. дзета-потенциалы смещались к нейтральным значениям при PC покрытии, отражая белковое маскирование поверхностных зарядов.

AuNP цитотоксичность

LC₅₀ значения для голых AuNP варьировали от 127,3 до 205,5 мкг/см² (рис. 2a). Все 40-нм BPEI-, LA- и PEG-AuNP, так же как 80-нм BPEI-AuNP, были цитотоксичны, в то время как 80-нм LA-AuNP не показывал значительной токсичности. PC заметно снижал цитотоксичность по большинству типов AuNP, за исключением 80-нм BPEI-AuNP, который сохранял 51% жизнеспособности при 250 мкг/см² (рис. 2b). Эти выводы согласуются с предшествующей работой, показывающей PC-медированное ослабление AuNP токсичности в первичных гепатоцитах и других клеточных линиях [7–9].

Внутриклеточное поглощение AuNP

Время-зависимые анализы поглощения (рис. 3) раскрыли, что 40-нм BPEI-AuNP накапливались быстро, пикуя в 6 ч перед снижением. В противовес, PC ослаблял поглощение 40- и 80-нм BPEI- и LA-AuNP но усилял 80-нм PEG-AuNP интернализацию. Эти тренды согласуются с литературой, указывающей, что PC может либо препятствовать, либо способствовать входу NP в зависимости от размера NP, поверхностной химии и типа клетки [8, 9, 33].

Измерения оксидативного и нитросативного стресса

Оба типа AuNP индуцировали ROS/RNS в время- и концентрационно-зависимом режиме (p < 0,0001). Высокие концентрации 40-нм BPEI-AuNP производили бифазный ответ: начальный антиоксидантный эффект в 1 ч, за которым следовал выраженный про-оксидантский скачок в 3 ч и далее. В противовес, 40-нм PEG-AuNP последовательно подавляли ROS/RNS производство (fold change < 0,5) по всем временным точкам, предполагая защитную антиоксидантную роль (рис. 4).

Измерение CYP3A4 активности

Все голые AuNP (40- и 80-нм BPEI, LA и PEG) ингибировали CYP3A4 активность до 20–31% от контрольных уровней при LC₅₀ концентрациях (рис. 5). Нетоксичные концентрации 80-нм LA- и PEG-AuNP также подавляли активность (~30%). PC в основном восстанавливал CYP3A4 активность для всех AuNP за исключением PEG-AuNP, который сохранял 63% и 46% активности для 40- и 80-нм частиц соответственно. Эти результаты подтверждают предыдущие отчеты о AuNP-медированном CYP3A4 ингибировании через прямое ферментовое взаимодействие или блокировку субстратного кармана [7, 25].

Токсикологический путь-фокусированное геновое экспрессионное профилирование 40-нм PEG-AuNP

Генный массив анализ выявил 212 дифференциально экспрессированных генов (186 сниженных, 26 повышенных) при LC₅₀ 40-нм PEG-AuNP (рис. 6). Особенно, 12,3% этих генов вовлечены в митохондриальное β-окисление жирных кислот, с ключевыми ферментами (ACAD11, ACAD9, ACADM, ACADS, ACAA1, ACAA2, DECR1, ECHS1, EHHADH, HADHA) заметно подавленными (fold change 2–18). Снижение β-окисления ферментов указывает на нарушенное NADH/FADH₂ производство, компрометирующее цикл Кребса и АТФ синтез, признак митохондриальной дисфункции, наблюдаемой в AuNP-обработанных гепатоцитах [7–9].

Апоптотические гены (CASP3, CASP7, CASP9, TNFRSF10A/B, TNFSF10) были повышены, в то время как анти-апоптотические гены (AKT1, BCL2, MCL1, XIAP) были снижены, согласуясь с наблюдаемой дозо-зависимой цитотоксичностью. ДНК повреждения и ремонтные чекпоинты (CHEK1/2, ERCC1/2/3, LIG4) показывали смешанную регуляцию, предполагая нарушенную геномную целостность. Тепловые шоковые белки (HSPA1A/B) были повышены, в то время как HSP40/90/60 подсемейства были снижены, отражая сложный стресс-ответ. Антиоксидантные гены (GPX1/2/4, PRDX1/2/6, SOD1, CAT) были индуцированы, в то время как про-оксидантные гены (TXNIP, PPP1R15B) были подавляны, согласуясь с антиоксидантным фенотипом PEG-AuNP.

Геновое экспрессионное профилирование апсорпционных и эффлюкс транспортеров лекарств

PC-индуцированная модуляция лекарственных транспортеров дополнительно подчеркивает потенциальные фармакокинетические импликации. Из 35 исследуемых транспортерных генов, 12 ABC транспортеров были снижены (например, ABCB1, ABCC2/3/4, ABCG2/8, ABCA1) и 21 SLC транспортер был подавлен (например, SLC31A1, SLC22A9). И напротив, MDR4 (ABCB4) и митохондриальный ABC транспортер (ABCB6) были повышены, указывая на компенсаторный ответ на воздействие наночастиц. Эти изменения могут влиять на внутриклеточную концентрацию химиотерапевтиков и требуют тщательного рассмотрения в комбинированных терапиях.

Real-time PCR валидация девяти выбранных генов подтвердила массивные результаты, укрепляя надежность транскрипциональных данных.

Заключение

Это исследование демонстрирует, что поверхностная химия AuNP и присутствие человеческой плазменной белковой короны критически диктуют их цитотоксичность, клеточное поглощение, оксидативный стресс профиль, CYP3A4 ингибирование и изменения геновой экспрессии в C3A HCC клетках. Голы BPEI- и LA-AuNP были высоко цитотоксичны, в то время как PEG-AuNP проявили антиоксидантные свойства но все равно подавляли CYP3A4 активность. PC в основном смягчал токсичность и CYP3A4 ингибирование, за исключением PEG-AuNP, который сохранял значительные эффекты. Геновое экспрессионное анализ 40-нм PEG-AuNP раскрыл преобладающее снижение митохондриальных β-окисления ферментов, повышение про-апоптотических генов и обширную модуляцию лекарственных транспортеров, давая инсайт в потенциальные механизмы гепатотоксичности и лекарство-наночастица взаимодействий. Эти выводы подчеркивают важность учета белковой короны формирования и поверхностной функционализации при проектировании AuNP-базированных терапевтиков для HCC.

Аббревиатуры

ANOVA:

Однофакторный дисперсионный анализ

AuNP:

Золотые наночастицы голые: без PC

BPEI:

Разветвленный полиэтиленимин

CYP:

Цитохром P450

D_H:

Гидродинамические диаметры

DLS:

Динамическое световое рассеяние

EDTA:

Этилендиаминтетраацетатная кислота

EMEM:

Минимальная необходимая среда Орла

HCC:

Человечный гепатоцеллюлярный карцинома

HPTC:

Человечные проксимальные тубулярные почечные клетки

HSD:

Tukey честная значимая разница тест

HUVEC:

Человечные пуповинные вены клетки

ICP-MS:

Индуктивно связанная плазма масс-спектрометрия

LA:

Анионная липоевая кислота

LC₅₀:

Медианная летальная концентрация

MDR:

Мультидруг резистентность

NP:

Наночастицы

PBS:

Фосфатно-буферный салине

PC:

Человеческая плазменная белковая корона

PDI:

Полидисперсионный индекс

PEG:

Нейтральный полиэтиленгликоль

RNAi:

РНК интерференция

RNS:

Реактивные азотистые виды

ROS:

Реактивные кислородные виды

SO:

Супероксид

TEM:

Трансляционная электронная микроскопия

TFF:

Тангенциальная потоковая фильтрация