Токсичность и терапевтический потенциал оксидированных углеродных нанотрубок, функционализированных доксорубицином и флуоресцином: In vitro и In vivo выводы

Аннотация

Это исследование изучает цитотоксичность оксидированных многослойных углеродных нанотрубок (CNTox), нанотрубок, функционализированных доксорубицином (CNT-Dox) и флуоресцином (CNT-FITC) на клетках HT29 колоректальной аденокарциномы и на мышах Balb/c. Мы демонстрируем, что доксорубицин может ковалентно привязываться к CNT через пептидные связи, что заметно снижает его немедленную цитотоксичность. Ферментативное расщепление трипсином высвобождает доксорубицин, восстанавливая его потенцию и генерируя синергетический эффект при комбинации CNT-Dox и трипсина. In vivo CNT-Dox показывает более низкую системную токсичность, чем свободный доксорубицин, с лишь умеренным повышением печеночных ферментов и параметров клеток крови, тогда как CNTox в одиночестве практически не токсичен. Эти результаты поддерживают использование CNT как контролируемых носителей для мощных противопухолевых агентов.

Введение

Углеродные нанотрубки (CNT) обладают высокой площадью поверхности, отличным клеточным поглощением и способностью проникать биологические мембраны, делая их привлекательными векторами для доставки лекарств, генной терапии и приложений визуализации. Функционализация гидрофильными группами улучшает растворимость и биосовместимость, в то время как ковалентное присоединение терапевтических молекул может обеспечить таргетированную, контролируемую высвобождение. Доксорубицин (Dox) — широко используемый химиотерапевтик с значительной системной токсичностью; связывание его с CNT может снизить off-target эффекты и повысить опухолевую специфичность. Предыдущая работа показала, что CNT могут безопасно администрироваться при низких дозах, но более высокие концентрации или неадекватная поверхностная химия могут провоцировать оксидативный стресс, воспаление и накопление в органах. Это исследование строится на этих выводах для оценки профиля безопасности CNT-Dox и CNT-FITC in vitro и in vivo.

Методы

Клетки HT29 колоректальной аденокарциномы культивировали в 2D монослоях и 3D сфероидах. CNT синтезировали химическим осаждением из паровой фазы, оксидировали 70% HNO₃ и функционализировали доксорубицином или флуоресцином через карбодиимидную химию. Суспензии ультразвуково обрабатывали, стерилизировали и характеризовали SEM, дзета-потенциалом и FTIR. Цитотоксичность оценивали MTT и колоний-областными анализами. Для контролируемого высвобождения добавляли трипсин (0,05–70%) для оценки высвобождения доксорубицина. In vivo мыши Balb/c получали внутрибрюшинные инъекции CNTox (1,5 мг/кг), CNT-Dox (1,5 мг/кг) или свободного Dox (20 мг/кг) каждые три дня в течение четырех недель. Сывороточные биохимические маркеры (ALT, AST, ALP, общий белок, альбумин) и гематологические параметры (RBC, WBC, тромбоциты, гемоглобин) измеряли после периода лечения.

Результаты и обсуждение

Характеристика наночастиц

SEM изображения подтвердили многослойные CNT с диаметрами 10–60 нм и длинами 20–500 мкм. Функционализация не изменяла морфологию. Измерения дзета-потенциала показали CNT-Dox (−28 мВ), CNT-FITC (−32 мВ) и CNTox (−36 мВ), указывая на хорошую коллоидную стабильность. FTIR спектры показывали характерные амидные I и II полосы, подтверждающие ковалентную связь доксорубицина и флуоресцина с CNT.

In vitro цитотоксичность

MTT анализы выявили дозо-зависимую цитотоксичность для CNTox (IC₅₀ ≈ 100 мкг/мл) и CNT-FITC (IC₅₀ ≈ 50 мкг/мл). CNT-Dox проявил заметно более низкую цитотоксичность в отсутствии протеазы (IC₅₀ > 200 мкг/мл), отражающую секвестрацию доксорубицина. Когда добавляли 0,05% трипсина, CNT-Dox высвобождал свободный доксорубицин, производя IC₅₀ ≈ 5 мкг/мл и синергетическое снижение клеточной жизнеспособности (≤ 10% от контроля). Колоний-областные анализы подтвердили, что CNT-FITC заметно ингибировал образование колоний, в то время как CNT-Dox имел минимальный эффект, если трипсин не был присутствовал. В 3D сфероидных культурах CNTox увеличивал объем сфероида дозо-зависимо, в то время как CNT-FITC уменьшал размер сфероида; CNT-Dox не показывал значительного эффекта, если протеаза-медированное высвобождение не происходило.

In vivo токсичность

Сывороточные анализы показали, что CNTox в одиночестве не изменял уровни ALT, AST или ALP. CNT-Dox и свободный Dox оба повышали AST (до 126%) и ALP (до 148%) относительно контроля, но повышения были менее выражены для CNT-Dox. Общий белок слегка повышался во всех группах лечения. Гематология раскрыла, что свободный Dox вызывал анемию, тромбоцитопению и нейтропению, в то время как CNT-Dox давал сопоставимые но более мягкие изменения. CNTox имел пренебрежимое влияние на клетки крови. Эти выводы предполагают, что CNT-Dox смягчает системную токсичность, сохраняя противоопухолевую потенцию.

Заключение

Функционализация оксидированных CNT доксорубицином через пептидные связи создает безопасный, контролируемый высвобождения наноноситель, снижающий системную токсичность по сравнению со свободным лекарством. In vitro CNT-Dox остается инертным до протеолитического расщепления, после чего достигает мощной цитотоксичности, сопоставимой с свободным доксорубицином. In vivo CNT-Dox проявляет более низкие повышения печеночных ферментов и гематологическую токсичность, чем свободный Dox, в то время как CNTox в одиночестве практически не токсичен. Эти результаты поддерживают дальнейшее развитие CNT-базированных систем доставки для высокопотентных противопухолевых агентов, особенно в желудочно-кишечных злокачественностях, где протеазная активность может запускать таргетированное высвобождение.

Аббревиатуры

Al:

Альбумин

ALP:

Щелочная фосфатаза

ALT:

Аланина аминотрансфераза

AST:

Аспартата аминотрансфераза

CNT-Dox:

Углеродные нанотрубки, функционализированные доксорубицином

CNT-FITC:

Углеродные нанотрубки, функционализированные флуоресцином

CNTox:

Оксидированные углеродные нанотрубки

CNTs:

Углеродные нанотрубки

Dox:

Доксорубицин

FTIR:

Фурье-трансформ инфракрасная спектроскопия

MTS:

Многоклеточный опухолевой сфероид

MWCNTs:

Многослойные углеродные нанотрубки

PTX:

Паклитаксел

Tp:

Общий белок