Целевые липидные наночастицы, функционализированные трансферрином, повышают эффективность паклитаксела в лейкемических клетках

Аннотация

Лейкемия, гематологическая малыгностия, отмеченная неконтролируемой пролиферацией белых кровяных клеток, продолжает ставить перед клиницистами вызов с ограниченными терапевтическими опциями и высокой токсичностью от конвенциональной химиотерапии. Здесь мы сообщаем о дизайне, синтезе и биологической оценке трансферрином-декорированных паклитаксель-нагруженных твердых липидных наночастиц (TPLN), спроектированных для эксплуатации сверхэкспрессии трансферринового рецептора (TfR) на HL-60 лейкемических клетках. По сравнению с нецелевыми паклитаксель-нагруженными наночастицами (PLN), TPLN проявили заметно более высокую цитоксичность (IC₅₀ = 0.45 мкг/мл против 2.8 мкг/мл) и индуцировали обширную апоптоз (~30% апоптотических клеток, 65% живучести). Эти выводы подчеркивают потенциал лиганд-конъюгированных липидных наноносителей для улучшения терапевтического индекса и прокладывают путь для лейкемических лечений следующего поколения.

Обзор литературы

Лейкемия характеризуется аберрантной пролиферацией незрелых лейкоцитов, ведущей к неудаче костного мозга и иммунной дисфункции (1-3). Несмотря на свою превалентность, текущие химиотерапевтики часто не достигают цели из-за плохой биодоступности и офф-таргет токсичности (4-5). Паклитаксель (PTX) — мощный антимиотический агент, используемый при множестве раков, но его системные побочные эффекты и быстрый клиренс ограничивают клиническую полезность (7,8). Липидные наночастицы, особенно твердые липидные наночастицы (SLN), предлагают биосовместимую платформу для устойчивого выпуска лекарства и улучшенного накопления в опухоли через эффект усиленного проникновения и удержания (EPR) (9-14). Однако пассивный таргетинг может быть недостаточен; рецептор-медированные стратегии могут дополнительно улучшить селективность. Трансферрин (Tf) связывается с TfR, который маркедно сверхэкспрессирован на лейкемических клетках, предоставляя натуральный таргетинговый лиганд (15-17). Наше исследование интегрирует Tf на SLN для генерации TPLN, гипотезируя, что эта модификация повысит клеточное поглощение, снизит эффективную дозу и запустит апоптоз эффективнее, чем конвенциональные SLN.

Методы

Материалы

Compritol 888 ATO, холестерин, олеиновая кислота и PTX приобретены у Sigma-Aldrich. Человеческий Tf получен от того же поставщика. Все реактивы аналитического grades.

Приготовление паклитаксель-нагруженных трансферрин-конъюгированных твердых липидных наночастиц

Трансферрин-PEG-олеиновая кислота (Tf-PEG-OA) синтезировали через амидное сопряжение (18). Кратко, олеиновая кислота реагировала с NHS/DCC в 1:2:2 мольном отношении 16 ч при комнатной температуре. Отдельно NH₂-PEG-COOH растворяли в DMSO, активировали TEA и реагировали 12 ч под инертной атмосферой. Полученный PEG-OA очищали диализом и лиофилизацией. Tf-PEG-OA конъюгат затем приготовляли активацией PEG-OA (1:2:2 NHS/DCC) и сопряжением с Tf в присутствии TEA 12 ч. Финальный конъюгат диализировали (48 ч) и лиофилизировали.

SLN изготавливали методом испарения растворителя (19). PTX, Compritol, холестерин и Tf-PEG-OA растворяли в этанол/хлороформ (1:5) и медленно добавляли к 1% PVA водной фазе. Смесь гомогенизировали при 12 000 об/мин (T25 гомогенизатор, IKA) и ультразвуково обрабатывали (3 мин). После 12 ч перемешивания растворитель испаряли, и неинкапсулированный препарат удаляли центрифугальной фильтрацией (Amicon Ultra-4, 3500 Da MWCO). Эффективность инкапсуляции (EE) и эффективность загрузки (LE) количественно определяли HPLC.

Физико-химическая характеристика наночастиц

Размер частиц и полидисперсность измеряли динамическим световым рассеянием (Zetasizer ZS Nano, Malvern). Морфологию оценивали проницающей электронной микроскопией (TEM, JEM-2000EX, JEOL). Зета-потенциал записывали для оценки поверхностной зарядовой стабильности.

In vitro изучение выпуска препарата

Выпуск препарата оценивали методом диализа. 1 мл наночастичной дисперсии помещали в 3500 Da MWCO мешок и погружали в 10 мл среды выпуска, взбалтываемой 100 об/мин. В заранее определенные интервалы 1 мл проб собирали и анализировали HPLC (C18 колонка, 10%-90% ацетонитрил градиент, 214 нм детекция).

Цитотоксичность анализ

MTT анализы проводили на HL-60 клетках, посеянных 8000 клеток/колодец в 96-колодец пластинках. После 24 ч инкубации клетки лечили свободным PTX, PLN или TPLN при варьирующих концентрациях на дополнительные 24 ч. MTT (5 мг/мл) добавляли на 4 ч, затем растворили DMSO. Абсорбция читалась при 570 нм.

Клеточное поглощение наночастиц

Для исследований поглощения наночастицы загружали родямином B. HL-60 клетки (3×10⁵ на колодец) инкубировали с краситель-нагруженными частицами 3 ч, вымывали и визуализировали конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (CLSM, Nikon).

Hoechst 33342 анализ

Апоптоз качественно оценивали Hoechst 33342 окраской. Леченные клетки фиксировали 4% параформальдегидом, окрашивали и изучали под флуоресцентным микроскопом.

Апоптоз анализ на потоковом цитометре

Количественный апоптоз измеряли Annexin V/PI окраской. После лечения клетки инкубировали с Annexin V (2.5 мкл) и PI (2.5 мкл) 15 мин, разбавляли до 1 мл и анализировали потоковой цитометрией (BD FACS).

Колониеобразующий анализ

1000 HL-60 клеток/колодец посеяли в 6-колодец пластинки, лечили PTX-эквивалентными дозами (0.1 мкг/мл) и инкубировали 10 дней. Колонии фиксировали метанолом, окрашивали гемatoxylином и считали с AlphaEaseFCTM программным обеспечением.

Статистический анализ

Данные анализировали двусторонним Стьюдентов t-тестом или однофакторным ANOVA, с значимостью p < 0.05.

Результаты и обсуждение

Физико-химическая характеристика наночастиц

PLN и TPLN демонстрировали средние диаметры 140 нм и 160 нм соответственно, определенные DLS (Рис. 2a). Небольшое увеличение размера для TPLN отражает Tf конъюгацию. Оба размера попадают в оптимальное 100-200 нм окно для опухолевого EPR-медированного накопления (9,20,21). Зета-потенциалы составляли -22.5 ± 1.56 мВ, указывая на коллоидную стабильность и потенциал для клеточного взаимодействия. TEM изображения (Рис. 2b) подтвердили сферическую морфологию и равномерную дисперсию.

a Распределение размера частиц (DLS). b TEM микрограф.

Загрузка препарата и in vitro выпуск

PTX загрузка достигла EE 92.5 ± 1.35% и LE 8.6% вес/вес. Исследования выпуска (Рис. 3) показали устойчивый профиль: ~30% кумулятивный выпуск за 24 ч и ~65% за 75 ч. TPLN выпускали препарат медленнее, чем PLN, вероятно из-за объемного Tf слоя, который предлагает диффузионный барьер и может смягчить прорывной выпуск.

In vitro PTX выпуск из PLN и TPLN (PBS pH 7.4).

Клеточное поглощение наночастиц

CLSM изображения (Рис. 4) раскрыли заметно более сильную красную флуоресценцию в клетках, обработанных TPLN по сравнению с PLN, подтверждая Tf-медированное поглощение. Улучшенная интернализация согласуется с TfR сверхэкспрессией на HL-60 клетках (22).

Конфокальное поглощение родямин-нагруженных PLN против TPLN (шкала 20 мкм).

In vitro цитоксичность анализ

MTT данные (Рис. 5) указали на доза-зависимую цитоксичность для всех формуляций. TPLN достигли IC₅₀ 0.45 мкг/мл против 2.8 мкг/мл для PLN, шестькратное улучшение, приписываемое улучшенной клеточной доставке и устойчивому выпуску. Превосходная эффективность TPLN согласуется с предыдущими отчетами о Tf-декорированных носителях, снижающих МДР и системную токсичность (23).

MTT цитоксичность свободного PTX, PLN и TPLN (n = 6).

Hoechst 33342 апоптоз анализ

Hoechst окраска (Рис. 6) показала выраженную хроматиновую конденсацию и формирование апоптотических тел в TPLN-обработанных клетках, более очевидно, чем PLN или свободный PTX.

Hoechst 33342-основанное апоптоз изображение (шкала 50 мкм).

Апоптоз анализ на потоковом цитометре

Annexin V/PI анализ (Рис. 7) раскрыл 30% апоптотических клеток и 65% живучих клеток для TPLN, по сравнению с 10% апоптоза для PLN и 90% живучести для свободного PTX. Значительное увеличение раннего/позднего апоптоза подчеркивает преимущество таргетированной доставки (24,25).

Потоковая цитометрия апоптоз квантификация (n = 3).

Колониеобразующий анализ

Подавление колоний (Рис. 8) показало, что TPLN снизили количество колоний до ~20% от контроля, в то время как PTX и PLN достигли ~70% и ~60% соответственно. Это предполагает, что TPLN эффективно таргетируют лейкемические прогениторные клетки, критический шаг к куративной терапии.

Колониеобразование после 10-дневного лечения (p < 0.001 против PTX).

Заключение

Трансферрин-декорированные паклитаксель-нагруженные твердые липидные наночастицы (TPLN) проявляют превосходное клеточное поглощение, мощную цитоксичность и надежную индукцию апоптоза в HL-60 лейкемических клетках по сравнению с нецелевыми PLN. Эти результаты валидируют TfR-медированный таргетинг как перспективную стратегию для улучшения терапевтического индекса PTX и снижения системной токсичности. Будущие исследования изучат in vivo биодистрибуцию, фармакокинетику и терапевтическую эффективность в моделях лейкемии на животных.

Аббревиатуры

EPR:

Эффект усиленного проникновения и удержания

OA:

Олеиновая кислота

PEG:

Полиэтиленгликоль

PLN:

Паклитаксель-нагруженные липидные наночастицы

PTX:

Паклитаксель

SLN:

Твердые липидные наночастицы

Tf:

Трансферрин

TPLN:

Трансферрин-конъюгированные PLN