Дозозависимая токсичность наночастиц диоксида титана для печени, мозга и эмбрионов у мышей

Аннотация

Наночастицы диоксида титана (TiO₂-NP) повсеместны в пище, косметике и медицинских изделиях, однако их профиль безопасности остается неопределенным. Используя мышей ICR, мы изучали биораспределение, органо-специфическую токсичность и базовые механизмы TiO₂-NP, доставленных внутрибрюшинно (i.p.) и через желудочный зонд. Накопление титана следовало дозозависимому паттерну, с наибольшей нагрузкой в печени, затем почки, селезенка, легкие, мозг и сердце. Высокие дозы (≥150 мг/кг) привели к значительным изменениям отношения масса органов/масса тела, нарушению функции печени и почек и метаболическим расстройствам, отраженным в сывороточной биохимии. В печени TiO₂-NP индуцировали отек митохондрий, апоптоз гепатоцитов, сверхпродукцию реактивных форм кислорода (РФК) и дисрегуляцию антиоксидантных и детоксикационных генов (SOD, CAT, GST, HSP70, CYP1A1). В мозге высокие дозы вызвали разрыв нейронов, воспалительную инфильтрацию, повышенную активность оксидазы оксида азота, измененные уровни глутамата и ацетилхолинэстеразы и липидное перекисление. Ex vivo эмбриональные культуры, подвергшиеся воздействию ≥100 мкг/мл TiO₂-NP, показали сокращенную кроуно-рылочную длину, длину головы и увеличенные пороки развития, с токсичностью, усиливающейся с размером частиц. Эти результаты подчеркивают органо-специфические, дозозависимые риски воздействия TiO₂-NP и дают основу для оценки рисков для здоровья человека.

Введение

Наночастицы диоксида титана (TiO₂-NP) включены в широкий спектр потребительских продуктов: кондитерские изделия, напитки, молочные продукты, косметику, фармацевтику. Сообщаемые концентрации в пище достигают 0,5–9 г/кг, а продукты, продаваемые как «нано-бесплатные», часто все равно содержат TiO₂-NP. Хотя TiO₂-NP предлагают ценные функциональные свойства, их потенциал к накоплению в биологических тканях и индукции токсичности вызывает растущую обеспокоенность. Животные исследования показали, что TiO₂-NP могут всасываться через ЖКТ или вдыхание, затем распределяться в печень, почки, селезенку, легкие, сердце и мозг. In vitro TiO₂-NP вызывали цитотоксичность в лимфобластоидных и гепатомных линейках, индуцировали оксидативный стресс в глиальных клетках и компрометтировали нейронную жизнеспособность дозозависимым образом. Механизмы включают оксидативное повреждение, изменение проницаемости мембран, ДНК-оксидацию (8-OHG), воспаление и апоптоз. Комплексные систематические данные о токсичности TiO₂-NP остаются редкими; поэтому это исследование стремится разъяснить их эффекты и механизмы in vivo.

Методы

Химикаты и реагенты

Микромасштабные TiO₂ и 5 нм анатазные TiO₂ из Sigma-Aldrich (Шанхай). 10, 60 и 90 нм анатазные TiO₂ от Run He Ltd. (Шанхай). Реактивы аналитического класса от Sigma-Aldrich (Шанхай) и Gibco (США). TiO₂ суспензии (1%) стерилизовали, ультразвуково обрабатывали и разбавляли до нужных концентраций.

Животные и модели

Мыши ICR (22 ± 3 г, 50% самцы/самки) для органной токсичности; ICR самки (45, 20–35 г) и самцы (15, 35–40 г) для эмбриональной токсичности. Все процедуры одобрены Этическим комитетом Tianjin University of Science and Technology и соответствовали международным руководящим принципам заботы о животных.

Дозировочные режимы

Для общей токсичности мыши получали i.p. TiO₂-NP при 5, 10, 50, 100, 150 или 200 мг/кг ежедневно 14 дней (10 мышей/группа). Контрольные животные получали физраствор. Для печеночной токсичности мышей гавировали 5, 10 или 50 мг/кг ежедневно 60 дней (10 мышей/группа); контрольные получали 0,5% CMC.

Квантификация титана

Тканевые образцы дайджестили HNO₃/H₂O₂, разбавляли и анализировали ICP-MS. Концентрации титана выражали на грамм ткани.

Крови биохимия

Активности сывороточных ферментов (ALT, ALP, AST, LDH, CK и др.) измеряли на анализаторе Toshiba TBA-2000FR. Отношения масса органов/масса тела рассчитывали после эвтаназии.

Гистопатология и TEM

Органы, фиксированные в 10% формалине, окрашивали гемоксилином-эозином. Печеночные и мозговые ткани обрабатывали для передаточной электронной микроскопии для оценки митохондриальной целостности и клеточной ультраструктуры.

Оксидативный стресс и генная экспрессия

Уровни РНК (O₂⁻, H₂O₂, MDA) квантифицировали колориметрическими анализами. Активности антиоксидантных ферментов (SOD, CAT, GPx, APX) и неферментативных антиоксидантов (ASA/DASA, GSH/GSSG) измеряли в гомогенатах мозга. Уровни мРНК антиоксидантных и стресс-связанных генов квантифицировали qPCR, нормализуя к β-актину.

Ex vivo эмбриональная токсичность

Эмбрионы на 8,5 дне эмбрионального развития культивировали с TiO₂-NP (0–200 мкг/мл) 48 ч, с дополнительными временными курсами (16, 26, 48 ч). Развивающиеся параметры (кроуно-рылочная длина, длина головы, диаметр желточного мешка, телосложения) и частоты пороков оценивали по шкале Maele-Fabry Van.

Статистический анализ

Данные анализировали SPSS 13; значимость p < 0,05. Сравнения: тест Даннета, ANOVA, LSD, SNK, хи-квадрат, ранг-сумма тесты по необходимости.

Результаты

Тканевое распределение титана

TiO₂-NP накапливались в печени, почках, селезенке, легких, мозге и сердце дозозависимо (рис. 1). Печень демонстрировала наибольшую титановую нагрузку, затем почки, с похожими уровнями в селезенке, легких, мозге и сердце.

Общая токсичность

Прирост массы тела не менялся при всех дозах. Низкие дозы (5–10 мг/кг) не меняли отношения масса органов/масса тела. Высокие дозы (≥50 мг/кг) увеличивали печеночные, почечные, селезеночные и сердечные отношения, снижая легкие и мозговые (рис. 2).

Высокодозное воздействие (150–200 мг/кг) повышало сывороточные печеночные ферменты (ALT, ALP, LAP, PChE, TBIL, TP, ALB) и почечные маркеры (снижение UA, BUN), увеличивало маркеры миокардиального повреждения (AST, CK, LDH, HBDH) и метаболические параметры (GLU, TG, TC, HDL). Низкие дозы не давали значимых биохимических изменений (рис. 3).

Печеночная токсичность

Гистология выявила дозозависимую сосудистую конгестию, базиофильную инфильтрацию, ишемию и обструкцию центральной вены при ≥50 мг/кг (рис. 4). TEM показал отек митохондрий, конденсацию хроматина и апоптотические тела при дозах всего 5 мг/кг гавированием (рис. 5). Низкодозное гавирование не меняло РНК, MDA или экспрессию антиоксидантных генов, тогда как 10–50 мг/кг увеличивали РНК (O₂⁻, H₂O₂, NO, MDA) и даунрегулировали SOD, CAT, GSHPx, MT, GST, HSP70, P53, TF, в то время как апрегулировали CYP1A1 (рис. 6 и 7).

Мозговая токсичность

Высокие дозы (≥100 мг/кг) снижали мозг/тело отношение и повышали титан в мозге (рис. 1). Гистология показала разрыв нейронов, трещины и воспалительную инфильтрацию при 150–200 мг/кг (рис. 8). Оксидативные параметры увеличились, активности антиоксидантных ферментов и неферментативных антиоксидантов снизились. Активности оксидазы оксида азота и уровни NO выросли; активность ацетилхолинэстеразы и глюкоза снизились (рис. 9 и 10).

Эмбриональная токсичность

Ex vivo эмбрионы, подвергшиеся ≥100 мкг/мл TiO₂-NP, демонстрировали сокращенную кроуно-рылочную длину, длину головы и увеличенные частоты пороков, с токсичностью, усиливающейся с размером частиц (табл. 2). Временные курсы показывали значительные задержки развития и пороки после 24–48 ч воздействия 200 мкг/мл, независимо от размера (табл. 3).

Обсуждение

Наши данные подтверждают, что TiO₂-NP накапливаются в множественных органах дозозависимо. Высокодозное воздействие ведет к гепатоцитарной травме, почечной дисфункции и метаболическим расстройствам, согласуясь с предыдущими отчетами. Оксидативный стресс, подтвержденный ростом РНК и MDA и снижением антиоксидантных защит, кажется центральным для гепатотоксичности. Генный анализ поддерживает нарушение детоксикации (SOD, CAT, GST), стресс-реакции (HSP70, P53) и ксенобиотического метаболизма (CYP1A1) путей.

В мозге TiO₂-NP индуцируют липидное перекисление, нейронное повреждение и воспалительные реакции, сопровождаемые дисрегуляцией оксида азота сигналинга и нейромедиаторного баланса. Эти находки согласуются с нейротоксичностью других металл-оксидных наночастиц.

Эмбриональные культуры выявили дозо- и размерозависимую развивающуюся токсичность, эхом in vivo исследований, демонстрирующих репродуктивные и развивающиеся опасности TiO₂-NP. Тренд большей токсичности при больших частицах может отражать усиленное клеточное поглощение или измененную поверхностную реактивность.

Коллективно, TiO₂-NP представляют органо-специфические риски, сильно дозозависимые. Их способность генерировать оксидативный стресс, нарушать антиоксидантные защиты и менять генную экспрессию подлежит наблюдаемой гепатотоксичности, нейротоксичности и развивающейся токсичности.

Заключение

Проглоченные TiO₂-NP распределяются в сердце, мозг, селезенку, легкие и почки, вызывая печеночную, почечную и сердечную дисфункцию, глюкозно-липидные метаболические расстройства и нейротоксичность через оксидативный стресс и генную дисрегуляцию. Эмбриональное развитие нарушается дозо- и размерозависимо. Эти находки подчеркивают необходимость строгой оценки рисков воздействия TiO₂-NP на людей.

Аббревиатуры

ALB

Альбумин

ALP

Щелочная фосфатаза

ALT

Аланинаминотрансфераза

AST

Аспартатаминотрансфераза

BUN

Азот мочевины в крови

CK

Креатинкиназа

cNOS

Конститутивные оксидазы оксида азота

HBDH

Гидроксибутиратдегидрогеназа

ICR

Регион импринтинга контроль

iNOS

Индуцируемая оксидаза оксида азота

LAP

Лейцинаминопептидаза

LDH

Лактатдегидрогеназа

Nano-TiO₂

Наномасштабный диоксид титана

PChE

Бутирилхолинэстераза

ROS

Реактивные формы кислорода

TBIL

Общий билирубин

TP

Общий белок

UA

Мочевая кислота