Хондроитиновосульфат-усиленные желатин/поликапролактон нановолокна: антитромбогенный каркас с высокой эндотелиальной аффинностью для тканевой инженерии кровеносных сосудов

Аннотация

Электропренные полимерные нановолокна привлекли большое внимание в тканевой инженерии кровеносных сосудов. Однако обычные нановолоконные материалы с недостатками медленного эндотелизирования и тромбоза неэффективны в продвижении восстановления и регенерации тканей кровеносных сосудов. Здесь биомиметические композитные нановолокна желатина (Gt)/поликапролактона (PCL), включающие различное количество хондроитинового сульфата (CS), были разработаны через электропренную технологию для изучения их эффектов на антитромбогенность и эндотелиальную аффинность клеток. Вариация концентраций CS в PG нановолокнах влияет на морфологию и диаметр волокон. CS/Gt/PCL нановолокна имеют подходящую пористость (~ 80%) и поглощение раствора ФСБ (до 650%). Введение CS в Gt/PCL нановолокна значительно усиливает их антикоагуляционные свойства, удлиняет время свертывания и способствует клеточным ответам. В частности, 10%CS/Gt/PCL нановолокна демонстрируют благоприятное клеточное адгезирование, вытяжение и пролиферацию. Таким образом, Gt/PCL нановолокна, содержащие определенное количество CS, могут быть отличными кандидатами в качестве перспективного тканево-инженерного каркаса в восстановлении и регенерации кровеносных сосудов.

Введение

Разработка нановолокнистых материалов вызвала большое внимание в качестве биомиметических каркасов в восстановлении и регенерации тканей благодаря их уникальным (био)физикохимическим особенностям, включая их внеклеточную матрицу (ВКМ)-подобную ультратонкую волокнистую структуру, отличные механические свойства, большую удельную площадь поверхности и высокую пористость с взаимосвязностью [1, 2]. Было продемонстрировано, что нановолокнистые структуры играют ключевую роль в посредничестве клеточных ответов, таких как клеточное адгезирование, морфология (например, расширение, выравнивание, вытяжение и т.д.), расположение, миграция, пролиферация, фенотип и дифференциация через контактную навигацию [3,4,5]. Хотя многочисленные нано-фабрикационные стратегии (например, наноскайвинг, шаблонный синтез, фазовое разделение и т.д.) предоставили доступную технологию для изготовления нановолокнистых материалов, электропрение является одним из наиболее эффективных методов для производства нановолокон из различных материалов (металлов, керамики, полимеров, композитных материалов и т.д.) в промышленном масштабе [6,7,8].

Помимо (био)физических сигналов, выбор подходящих биоматериалов может значительно влиять на клеточную активность, а также восстановление и регенерацию тканей [9]. Некоторые ключевые особенности, такие как биосовместимость, биоресорбируемость, механические свойства и био-функция, должны учитываться [9, 10]. По сравнению с натуральными/натуральными и синтетическими/синтетическими композитами, композитные нановолоконные материалы, состоящие из натуральных и синтетических полимеров, получили больше внимания благодаря сочетанию отличных биологических свойств натуральных полимеров и механической прочности синтетических полимеров [9]. Среди них комбинация желатина (Gt)/поликапролактона (PCL) является одной из наиболее представительно изученных натурально-синтетических гибридных систем и широко используется в тканевой инженерии кровеносных сосудов [11,12,13,14]. Однако Gt/PCL композитные нановолокна все еще имеют некоторые ограничения, такие как медленное эндотелизирование и тромбоз. Недавно хондроитиновый сульфат (CS) — это сульфатированный полисахарид, содержащий гликозаминогликан и галактамин, который был продемонстрирован как обладающий высокой адгезией к эндотелиальным клеткам (ЭК), слабым взаимодействием с белками и тромбоцитами, а также электростатическим отталкиванием негативно заряженных компонентов крови [15,16,17]. Кроме того, CS мог ингибировать клеточный апоптоз и способствовать заживлению сосудистых ран [18, 19]. Следовательно, Gt/PCL (PG) электропренные нановолокна, включающие CS, были бы отличными кандидатами в качестве био-инструктивного тканево-инженерного каркаса для восстановления и регенерации кровеносных сосудов.

В настоящей работе биомиметические PG композитные нановолокна, содержащие различные соотношения CS, были разработаны через одностадийное электропрение. Морфология, химическая особенность, пористость и деградация CS/PG композитных нановолокон определялись различными методами характеристики. Антикоагуляция PG/CS композитных нановолокон оценивалась. Далее, эти композитные нановолокна с различными соотношениями CS посевали человеческими аортальными эндотелиальными клетками (HAEC) для изучения их эффектов на клеточные ответы.

Материалы и методы

Материалы

CS (бычья трахея, тип А, чистота: 95%) поставлялся Shanghai Macklin Biochemical Technology Co., Ltd. (Китай). PCL получали от Aladdin Biochemical Polytron Technologies Inc. (Китай). Gt (бычья кожа, тип В) получали от Sigma-Aldrich Biochemical Technology Co., Ltd., (Китай). Комплект активированного частичного тромбопластинового времени (APTT) покупали у Leigen Biotechnology Co., Ltd (Китай). Уксусная кислота (чистота: 99,5%) покупали у Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Китай). Человеческие аортальные эндотелиальные клетки (HAEC) получали от аффилированной больницы Циндао университета (Китай). Культурная среда Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12), фетовая бычья сыворотка (FBS), 0,25% трипсин-EDTA покупали у Biological Industries (Израиль). Все реагенты покупали у Sigma Aldrich (Китай), если не указано иное. Вода, использованная во всех экспериментах, была деионизированной.

Электропрение нановолокон

PCL (10% м/об) растворяли в уксусной кислоте под механическим перемешиванием при комнатной температуре 4 ч. Gt (10% м/об) растворяли в 90% уксусной кислоте с постоянным перемешиванием 2 ч. CS в различных концентрациях добавляли в раствор Gt и мягко перемешивали при комнатной температуре 1 ч для получения однородных растворов, содержащих 5, 10 и 15 масс.% CS относительно общей полимерной концентрации. Затем PG раствор приготовляли смешиванием двух вышеуказанных растворов в весовом соотношении 50/50 (м/м) под перемешиванием 2 ч, названные 5%CS@PG, 10%CS@PG и 15%CS@PG.

Подготовленные однородные растворы подвергали процессу электропрения, оснащенному 1-мл шприцем с 21G иглой и коллектором, покрытым алюминиевой фольгой. В данном исследовании расстояние между коллекторной пластиной и кончиком иглы фиксировали примерно 18 см, напряжение устанавливали 23 кВ, и полимерные растворы выкачивали со скоростью 1 мл/ч. Все растворы электропрениали в электропренном приборе (Technology, Tk602TH, Китай) при комнатной температуре и тщательно контролируемой влажности (< 40%). Перед любыми дальнейшими экспериментами образцы помещали в вакуумную сушильную печь минимум на 72 ч для удаления любого оставшегося растворителя.

Сканирующая электронная микроскопия (SEM) и передаточная электронная микроскопия (TEM)

Морфология CS@PG нановолокнистых каркасов исследовалась SEM (VEGAS, TESCAN, Чехия) при ускоряющем напряжении 20 кВ при комнатной температуре. Диаметр нановолокон (n = 100) дополнительно измеряли из SEM изображений с использованием программного обеспечения анализа изображений (Image J).

TEM наблюдения и энергодисперсный рентгеновский спектральный анализ (EDS) проводили с использованием JEOL JEM-2100 plus (Япония).

Фурье-преобразование инфракрасной спектроскопии (FTIR)

FTIR проводили прибором Nicolet iN10 FTIR спектрометр (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, США) для оценки характерных функциональных групп CS, PG нановолокна и CS@PG нановолокон. Спектры образцов записывали в режиме прохождения в диапазоне длин волн 4000–500 см⁻¹ с разрешением 2 см⁻¹.

Пористость и поглощение фосфатно-буферного раствора (ФСБ)

Пористость нановолокон проводилась методом жидкостного вытеснения. Во-первых, сухой вес нановолокон взвешивали как W₁. Затем четыре группы нановолокон погружали в этанол на 2 ч при 25 °C и взвешивали как W₂. Этанол на поверхности образца удаляли фильтрующей бумагой, и веса образцов затем отмечали как W₃. Пористость нановолокон рассчитывалась по следующей формуле:

Пористость (%) = (W₃ - W₁) / (W₃ - W₂) × 100

Для теста поглощения раствора ФСБ полученные нановолокна взвешивали в сухом состоянии и записывали как Wd. Затем нановолокна мачивали в ФСБ 24 ч при 25 °C и вес во влажном состоянии записывали как Ww после удаления излишней жидкости на поверхности образца. Коэффициент набухания измеряли по следующему уравнению:

ФСБ поглощение (%) = (Ww - Wd) / Wd × 100

Все значения в вышеуказанных экспериментах выражаются как среднее ± SD (n = 3).

In vitro деградационное поведение

Для определения устойчивости полученных нановолокон к лизоциму, деградация образцов измерялась в запланированное время (1, 4, 7, 10 и 14 дней). Начальный вес нановолокон записывали как Wᵢ. Затем образцы погружали в раствор ФСБ (pH 7,4), содержащий лизоцим (500 мкг/мл), и инкубировали in vitro при 37 °C. В предопределенные интервалы деградации каждая группа образцов удаляли и промывали деионизированной водой, и сушили сублимацией для получения конечного веса (Wf). Раствор лизоцима меняли три раза в неделю. Массовое остаток (%) нановолокнистых каркасов оценивали по следующей формуле:

Массовое остаток (%) = (1 - (wᵢ - wf) / wᵢ) × 100%

Для оценки деградационного поведения образца после 7 дней морфология нановолокон наблюдалась SEM.

Анализ гемосовместимости

Время свертывания

Активированное частичное тромбопластиновое время (APTT) использовали для оценки активности внутреннего и общего путей свертывания через тестирование времени свертывания бедной тромбоцитами плазмы (BTP) после инкубации с электропренными нановолокнами на стеклянных пластинках. Для этого антикоагулированная кровь (примерно 10 мл) собирали и центрифугировали при 3000 об/мин 20 мин для получения бедной тромбоцитами плазмы (BTP). Каждый образец инкубировали с 200 мкл BTP 10 мин при 37 °C и анализировали комплектом APTT следуя инструкции производителя (n = 3).

Тест на гемолиз

Скорость гемолиза оценивали измерением концентрации гемоглобина, высвобожденного в фазу раствора из эритроцитов в разбавленной полной крови, подвергнутой воздействию электропренных нановолокон. Образцы на стеклянных пластинках индивидуально помещали в 24-колбовые пластины и мачивали в 2 мл ФСБ при 37 °C 30 мин. Негативные контрольные группы содержали только 2 мл ФСБ, в то время как позитивные контрольные группы состояли из 2 мл деионизированной воды для цели индукции максимального лизиса эритроцитов (n = 3 для каждой тестовой группы). Затем 40 мкл вышеупомянутой антикоагулированной свежей полной крови добавляли в каждую колбу и инкубировали 60 мин при 37 °C, после чего суспензии удаляли в центрифужные трубки и центрифугировали при 100× g 5 мин. Супернатанты подвергали измерению абсорбции при 570 нм с использованием микроплитного считывателя (SynergyH1/H1M, BioTek, Китай).

Тромбогенность

Тромбогенный потенциал оценивали in vitro после инкубации электропренных образцов с тромбоцито-богатой плазмой (ТБП). ТБП готовили центрифугацией (1500 об/мин, 20 мин) и верхнюю половину плазмы отбрасывали. Затем нановолокна на стеклянных пластинках инкубировали в 100 мкл ТБП при 37 °C 2 ч и мягко промывали ФСБ три раза для последующих экспериментов. Для оценки тромбоцитарной активности после инкубации с ТБП, электропренные нановолокна держали в DMEM с добавлением 10% FBS 2 ч и 24 ч, а затем комплект CCK-8 использовали для измерения жизнеспособности тромбоцитов на нановолокнах. CCK-8 (20 мкл) добавляли к 200 мкл безсывороточной DMEM среды в 24-колбовые пластины и инкубировали 1 ч. Наконец, суспензии измеряли микроплитным считывателем при длине волны 450 нм.

Клеточная культура и клеточная жизнеспособность

Человеческие аортальные эндотелиальные клетки (HAEC) культивировали в DMEM с добавлением FBS (10%, об/об), и стрептомицин/пенициллин (1%, об/об) в атмосфере 37 °C и 5% CO₂. Культурная среда менялась три раза в неделю. Клетки обычно изолировали 0,05% трипсином/EDTA 3 мин, центрифугировали при 1000 об/мин и ресуспендировали в свежей среде для проведения пассажа или посева клеток.

Перед посевом клеток все нановолокнистые материалы в 24-колбовой пластине стерилизировали под УФ облучением 1 ч и мачивали в 75% этаноле (об/об, %) 1 ч. Затем нановолокна промывали четыре раза раствором ФСБ и мачивали в DMEM 12 ч в CO₂ инкубаторе. Клетки посевали с плотностью 1 × 10⁴ клеток на колбу на нановолокна, и среду меняли каждый день. После совместной культуры 24 ч клетки промывали раствором ФСБ три раза и затем окрашивали комплектом двойной окраски Calcein-AM/PI (YEASEN Biochemical Technology Co., Ltd., Шанхай, Китай). PI использовали для окраски мертвых клеток, а Calcein-AM — для живых клеток.

Клеточная морфология на нановолокнах

Для наблюдения клеточного адгезирования на нановолокнах морфология клеток наблюдалась после совместной культуры 24 ч флуоресцентным микроскопом (Nikon A1 MP, Япония). Во-первых, клетки фиксировали 4% параформальдегидом при комнатной температуре 30 мин. Затем 0,5% раствор Тритон X-100 использовали 5 мин для пермеабилизации клеточной мембраны. Наконец, 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) использовали для окраски клеточных ядер, а rhodamine-phalloidin — для окраски F-актина. Количественный анализ (плотность клеток, площадь одной клетки, вытяжение клетки) дополнительно выполняли с Image J.

Клеточная пролиферация

Клеточная пролиферативная активность на композитных нановолокнах проводилась комплектом CCK-8. HAEC посевали на нановолокна с плотностью 8 × 10³ клеток/колба. Культурная среда менялась каждые два дня. После 1, 4, 7 дней совместной культуры клетки промывали раствором ФСБ для удаления неадгезивных клеток. Затем 20 мкл CCK-8 и полная среда в объемном соотношении 1:10 добавляли в 24-колбовую пластину на 1 ч в инкубаторе. Абсорбция тестировалась ELISA считывателем при 450 нм.

Клеточная окраска DAPI и rhodamine-phalloidin выполнялась флуоресцентным микроскопом для прямого наблюдения изменений количества клеток после совместной культуры с различными нановолокнами на два и шесть дней.

Статистический анализ

Все образцы в экспериментах обрабатывались в трипликате. Все данные представлены как средние ± стандартные отклонения (SD). Статистический анализ образцов определялся односторонним дисперсионным анализом (ANOVA) для сравнения различий с значимостью, присвоенной при p < 0,05.

Результаты и обсуждение

Приготовление и характеристика CS@PG нановолокон

Рис. 1 отображает схемтическую диаграмму процесса электропрения для CS@PG нановолокнистых каркасов и in vitro оценку антикоагуляции и цитокомпатибельности. Для разработки инжинирированных сосудистых тканевых каркасов для продвижения пролиферации эндотелиальных клеток, различные соотношения CS (5, 10 и 15 масс.%) включали в PG (10%, об/об) растворы для изготовления композитных нановолокон через процесс электропрения.

SEM проводили для наблюдения структуры CS@PG электропренных нановолокон. Как показано на Рис. 2, SEM изображения PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG, 15%CS@PG нановолокон демонстрировали плотную волокнистую архитектуру, содержащую непрерывные, гладкие и нано-масштабные волокна техникой электропрения. PG нановолокна (Рис. 2a) демонстрировали множество неправильных бусин на нановолокнах через процесс электропрения, имея средний диаметр 406,01 ± 146,28 нм. Это может быть объяснено тем, что 10% м/об электропренного раствора демонстрировал низкую вязкость, что привело к формированию негомогенных нановолокон, содержащих бусины [20]. С увеличением количества CS в полимерном растворе от 5 до 10% масс., гомогенные нановолокна без бусин могли быть достигнуты благодаря увеличенной вязкости раствора (Рис. 2b, c). Соответственно, 5%CS@PG и 10%CS@PG показывали меньший средний диаметр 382,35 ± 152,99 нм и 300,29 ± 100,85 нм соответственно. Этот результат в основном связан с тем, что увеличение содержания CS соответствующе повышало проводимость электропренного раствора [20]. Однако, когда полимерная концентрация достигала 15%, вязкость полимерного раствора была слишком высокой, чтобы быть растянутой в электрическом поле. При той же скорости потока 1 мл/ч, как в предыдущих группах, мы наблюдали, что при приложенном напряжении 23 кВ, явление закупорки кончика иглы появлялось, и Тейлоров конус не мог быть замечен. Следовательно, скорость потока электропренного раствора и приложенное напряжение регулировали до 0,9 мл/ч и 20 кВ соответственно. 15%CS@PG нановолокна успешно производились со средним диаметром 266,92 ± 105,43 нм.

Как изображено на Рис. 3a, было обнаружено, что CS равномерно распределялся в 5%CS@PG и 10%CS@PG нановолокнах. Однако агрегация CS детектировалась в 15%CS@PG волокнах. Как указано на Рис. 3b, EDX элементный анализ проводили для обнаружения серного содержания приготовленных волокон. Как ожидалось, серное содержание увеличивалось с увеличением концентрации CS в полученных волокнах.

Анализ FTIR спектров

Анализ FTIR спектров проводили для определения характерных абсорбционных пиков химической группы приготовленных нановолокнистых каркасов. FTIR спектр PG и CS рассматривали как контрольную группу для сравнения с группами CS@PG нановолокон. В спектре PG сильные абсорбционные полосы, появившиеся при 3300 см⁻¹ и 2935 см⁻¹, могут быть атрибутированы к растяжительной вибрации –NH₂ и –OH, и асимметричному растяжению CH₂ соответственно. Несколько характерных абсорбционных пиков появлялись при 1652 см⁻¹ (амид I) для растяжения C=O, 1542 см⁻¹ (амид II) для изгиба N–H, 1441 см⁻¹ для растяжения CH₂ и 1267 см⁻¹ (амид III) для растяжения C–N [21, 22]. Спектр CS выполнял характерную абсорбционную полосу при 1245 см⁻¹, представляющую растяжительную вибрацию S=O в негативно заряженном SO₄²⁻ [23, 24].

Как показано на Рис. 4, FTIR спектры 5%CS@PG, 10%CS@PG и 15%CS@PG нановолокон показывали характерные пики PCL, Gt и CS вместе. По сравнению со спектрами группы PG, группы CS@PG показывали характерную полосу CS при 1245 см⁻¹, и интенсивность полосы CS увеличивалась при наличии CS в нановолокнах. Это обнаружение подтвердило наличие варьирующегося содержания CS в CS@PG электропренных нановолокнах.

Пористость, коэффициент набухания и деградация нановолокон

Высокая пористость волокна указывает на то, что материал имеет отличную взаимосвязность, что способствует диффузии кислорода и питательных веществ в поры и продвигает клеточную инфильтрацию [25, 26]. Рис. 5a отображал пористость нановолокнистых пленок. Пористость полученных нановолокон, содержащих различные соотношения CS, составляла примерно до 80%. Высокая пористая архитектура, полученная электропренными нановолокнами, может имитировать натуральную ВКМ, таким образом предоставляя благоприятную 3D микросреду для клеток [27]. Сообщалось, что каркасы в тканевой инженерии с пористостью до 80% были полезны для транспорта питательных веществ и метаболитов.

Коэффициент поглощения ФСБ CS@PG нановолокнистых каркасов сравнивали для оценки эффекта CS на поглощение ФСБ пленками. Как указано на Рис. 5b, коэффициент поглощения ФСБ PG каркаса составлял 586,34 ± 49,44%, а 5%CS@PG и 10%CS@PG нановолокна — 492,86 ± 21,99% и 510,04 ± 69,55% соответственно. Коэффициент поглощения ФСБ групп 15%CS@PG (665,07 ± 59,81%) был значительно выше, чем у 5%CS@PG и 10%CS@PG. Этот результат указывал на то, что увеличенное содержание CS в композитных нановолокнах могло улучшить свойство поглощения ФСБ пленок, что могло быть связано с высокой гидрофильностью в молекулах CS, содержащих гидрофильные группы (карбоксил и гидроксил) [28].

Данные in vitro деградационного эксперимента изображены на Рис. 5c, и было обнаружено, что с увеличением соотношения CS, скорость деградации CS@PG нановолокнистых каркасов также увеличивалась. Это могло быть атрибутировано присутствию групп SO₄²⁻ [29]. Как продемонстрировано на Рис. 5c, скорость деградации большинства каркасов начинала увеличиваться после 7 дней, и результаты деградации на 14-й день составляли 8,45%, 11,39%, 13,97% и 15,10% для PG, 5%CS@PG, 10%CS@PG и 15%CS@PG нановолокнистых каркасов соответственно. SEM изображения нановолокнистых каркасов (Рис. 5d) показывали незначительное набухание после погружения в раствор ФСБ на 7 дней. SEM изображения указывали на то, что разработанные нановолокна были достаточно стабильны, чтобы избежать серьезной деградации и расширения до 7 дней, таким образом влияя на клеточный ответ in vivo или in vitro.

Оценка гемокомпатибельности

APTT — простой и надежный метод для обнаружения крови или плазмы через внутренний механизм свертывания. APTT тестировали для измерения влияния электропренных нановолокон на возможное замедление свертывания крови. Время свертывания, обнаруженное APTT, демонстрировало статистически значимое уменьшение времени свертывания между контрольной PG и 5%CS@PG и 10%CS@PG нановолокнами. В противовес, удлиненное APTT находилось после инкубации 15%CS@PG нановолокон с BTP, указывая на его улучшенную антикоагуляционную особенность. Как представлено на Рис. 6a, влияние свертывания крови зависело от диаметра образцов нановолокон. Наименьшее время свертывания APTT находилось после взаимодействия с 5%CS@PG нановолокнистыми, а наибольшее APTT — с электропренными 10%CS@PG, аналогично степени гемолиза. Время свертывания удлинялось с увеличением соотношения CS.

Согласно ASTM F756-00 (2000), скорость гемолиза биоматериалов требуется < 5% [30]. Степень гемолиза в данном исследовании выполнялась колориметрическим анализом высвобожденного гемоглобина из эритроцитов и может быть рассчитана уравнением: Гемолиз (%) = (ODсам - ODнег)/(ODпос - ODнег) × 100%. Как указано на Рис. 6b, все образцы были негемолитичными и не приводили к никакому выраженному гемолизу (скорость гемолиза менее 5%).

Данные тромбоцитарного жизнеспособности эксперимента показаны на Рис. 6c. После 2 ч метаболическая активность прикрепленных тромбоцитов была наивысшей с максимальными значениями, достигшими после взаимодействия ТБП с нановолокнами, особенно PG нановолокнами. Интересно, после 24 ч тромбоцитарная активность снижалась во всех образцах. Этот результат мог быть связан с быстрой активацией тромбоцитов структурой нановолокон, результатом в быстром потреблении и выделении факторов роста по сравнению со стабильной и долгосрочной активацией тромбоцитов при контакте с гладкой поверхностью [31]. Нормальный срок жизни тромбоцитов составляет приблизительно 8–10 дней, и он будет сокращен по мере активации тромбоцитов.

Живая/мертвая клеточная окраска

Влияние CS на цитокомпатибельность нановолокон исследовали через оценку клеточной жизнеспособности, адгезивной морфологии и пролиферации HAEC на нановолокнах 6 дней. Прикрепленные клетки оценивали с использованием комплекта двойной окраски Calcein-AM/PI, окраски DAPI и комплекта CCK-8.

Рис. 7a–e показывали флуоресцентные изображения живых и мертвых HAEC, прикрепленных к различным нановолокнам. Calcein-AM (зеленый) и PI (красный) использовали для окраски живых и мертвых клеток соответственно. Можно было наблюдать, что живые клетки адгезировали на CS@PG композитных нановолокнах, что указывало на то, что нановолокна, содержащие различные соотношения CS, не имели токсичности для HAEC. Дополнительный количественный анализ живых/мертвых клеточных чисел на нановолокнах исследуемый Image J (Рис. 7f). По сравнению с пропорцией живых и мертвых клеток на PG нановолокнах, другие три группы PG, содержащие различные соотношения CS, особенно 10%CS@PG и 15%CS@PG группы демонстрировали больший процент живых клеток, и процент увеличивался с увеличением концентрации CS. Этот результат показывал, что присутствие CS в нановолокнах было преимущественным для поддержания клеточной жизнеспособности [32].

Клеточное адгезивное поведение на нановолокнах

Нановолокнистые каркасы с хорошей биосовместимостью считаются первичным требованием для генерации кровеносных сосудов. PCL с хорошей биодеградабельностью и натуральный Gt с отличной биосовместимостью широко использовались в тканевой инженерии с различными структурами, включая гидрогели, электропренные нановолокна и трехмерные каркасы [21, 33, 34]. Морфология HAEC на композитных нановолокнах и клеточно-материальное взаимодействие в 24 ч наблюдались флуоресцентным микроскопом. Плотность клеток 10%CS@PG и 15%CS@PG была статистически значимой по сравнению с PG и 5%CS@PG, указывая на то, что добавление CS на более высоком уровне способствует клеточному адгезированию. Как показано на Рис. 8c, площадь одной клетки 5%CS@PG и 15%CS@PG была больше других групп нановолокон. Однако вытяжение клеток 10%CS@PG было значительно выше, чем PG, 5%CS@PG и 15%CS@PG (Рис. 8d). Этот результат мог быть объяснен тем, что добавление CS при концентрации 10% может способствовать расширению HAEC. Было обнаружено, что HAEC могли адгезировать, расширяться и расти хорошо на композитных нановолокнах, особенно 10%CS@PG и 15%CS@PG. Таким образом, эти два нановолоконных материала могут быть рассмотрены как безопасные и перспективные кандидаты сосудистого материала в клиническом применении.

Клеточная пролиферация

Клеточный рост и жизнеспособность на CS@PG нановолокнах исследовались in vitro флуоресцентным микроскопом и тестом CCK-8 (Рис. 9a–c). Электропренный PG каркас выбирали как положительный контроль. Результаты анализа CCK-8 для различных нановолокнистых пленок отображены на Рис. 9c. В 2, 4, 6 дней культивирования клеток, количество клеток увеличивалось со временем культуры для всех групп. На 6-й день OD значение 10%CS@PG нановолокон было значительно выше, чем у PG каркаса. Сравнение клеточной пролиферации 5%CS@PG, 10%CS@PG и 15%CS@PG указывало на то, что скорость клеточной пролиферации увеличивалась по мере присутствия CS в композитных нановолокнах в определенном диапазоне. Однако клеточная пролиферативная способность также влияла поверхностная морфология нановолокнистых материалов. Поскольку 15%CS@PG нановолокно демонстрировало сильную вязкость из-за более высокого соотношения CS в электропренном полимерном растворе, клеточная пролиферация могла быть затронута.

Заключения

В заключение, биомиметические CS@PG композитные нановолокна были успешно изготовлены с использованием технологии электропрения. Измененная морфология и диаметр волокон были получены путем вариации концентраций CS в PG нановолокнах. CS@PG нановолокна обладали соответствующей пористостью (~ 80%) и поглощением раствора ФСБ (до 650%). Включение CS в PG нановолокна значительно улучшило их антикоагуляционные свойства, удлинило время свертывания и усилило клеточные ответы. В частности, 10%CS@PG нановолокна демонстрировали благоприятное клеточное адгезирование, вытяжение и пролиферацию. Следовательно, PG композитные нановолокна, включенные с определенным количеством CS, inhibировали антитромбогенность и усилили эндотелиальные клеточные ответы, которые могли быть разработаны в качестве перспективного тканево-инженерного каркаса в восстановлении и регенерации кровеносных сосудов.

Доступность данных и материалов

Все данные, сгенерированные или проанализированные в ходе данного исследования, включены в данную статью.