Наночастицы из сывороточного альбумина человека с ресвератролом и PEG–RGD таргетингом: увеличенное циркуляционное время, улучшенная биосовместимость и мощное подавление опухолей поджелудочной железы

Аннотация

Сывороточный альбумин человека (HSA) — натуральный, неиммуногенный носитель, способный инкапсулировать липофильные лекарства и улучшать их фармакокинетику. Мы создали наночастицы из HSA, нагруженные ресвератролом (RV), конъюгированные с пептидом аргинин-глицин-аспаратат (RGD) через линкер полиэтиленгликоля (PEG) (HRP–RGD NP) для таргетированной доставки в опухоли поджелудочной железы. Наночастицы имеют равномерный диаметр 120 ± 2,6 нм, эффективность инкапсуляции RV 62,5 ± 4,21 % и pH-зависимый высвобождение 58,4 ± 2,8 % при pH 5,0 и 37 °C. Покрытия PEG и HSA заметно улучшают биосовместимость RV. Конфокальная визуализация показывает 47,3 ± 4,6 % поглощения HRP–RGD NP клетками PANC‑1, превосходящее нетаргетированные контрольные образцы. В vivo HRP–RGD NP увеличивают полувывод RV в 5,43 раза, обеспечивая в 3,01 и 8,1 раза более высокое накопление в опухоли, чем HRP NP и свободный RV соответственно. Лечение мышей с опухолями HRP–RGD NP полностью подавляло рост опухоли в течение 35 дней без системной токсичности. Эти данные демонстрируют, что HRP–RGD NP представляют надежную, биосовместимую платформу для таргетированной терапии рака поджелудочной железы.

Введение

Рак поджелудочной железы остается одной из самых смертоносных злокачественностей, со средней выживаемостью менее шести месяцев и 5-летней выживаемостью ниже 6 %. Конвенциональные методы лечения — хирургия, лучевая терапия и традиционная химиотерапия — ограничены тяжелыми побочными эффектами и низкой эффективностью. Ресвератрол (RV), натуральный полифенол из винограда и сои, проявляет антиопухолевую активность по отношению к нескольким типам опухолей, но страдает от плохой растворимости, быстрого выведения и неспецифического распределения. Стратегии инкапсуляции, особенно с использованием эндогенных носителей, таких как HSA, могут улучшить растворимость лекарства, продлить циркуляцию и обеспечить функционализацию для активного таргетирования. HSA нетоксичен, неиммуногенен и обладает реактивными карбоксильными и аминогруппами для конъюгации. PEGилирование дополнительно продлевает время пребывания в крови.

Методы

Материалы

Все реактивы приобретены у Sigma Aldrich, Seebio Biotech и Pierce Biotech. Использовали сывороточный альбумин человека (≥96 % чистоты), ресвератрол (≥99 %) и пептид RGD (≥97 %) без дополнительной очистки.

Синтез наночастиц HSA–RV

Рсвератрол (6 мг в 1 мг/мл DMSO) смешивали с HSA (10 мг/мл) и размешивали 6 ч при комнатной температуре для формирования коацерватов. Перекрестное связывание 0,5 % глутаральдегидом (100 мкл) с последующей диализацией давало наночастицы HSA–RV. Пустые наночастицы готовили идентично, но без RV.

Конъюгация PEG–RGD и формирование HRP–RGD NP

PEG‑2000‑COOH активировали SATA и соединили с RGD в присутствии EDC, образуя SATA‑PEG‑RGD. После восстановления гидроксиламином продукт очищали и реагировали с SPDP-активированными наночастицами HSA–RV для получения HRP–RGD NP. Излишки реактивов удаляли диализацией и фильтрацией.

Характеризация

• Размер и полидисперсность: динамическое рассеяние света (DLS) и SEM.
• Загрузка лекарства: UV–Vis спектрофотометрия при 306 нм.
• Кинетика высвобождения: диализационный мешок (MWCO 8–12 кДа) в ФСБ при pH 5,0, 6,5, 7,4, 9,0, 37 °C.

Биосовместимость и гемолиз

Эритроциты инкубировали с HRP–RGD NP (10–200 мкг/мл) 3 ч при 37 °C. Гемолиз рассчитывали относительно ФСБ (негативный контроль) и деионизированной воды (позитивный контроль).

Клеточные исследования

Клетки PANC‑1 культивировали в DMEM с 10 % ФСБ. FITC-маркированные HRP–RGD NP инкубировали 5 ч, затем проводили конфокальную визуализацию и флюоресцентную цитометрию для оценки поглощения. Цитотоксичность оценивали методом CCK‑8 в диапазоне концентраций 0–200 мкг/мл. Апоптотическую морфологию подтверждали окраской Hoechst 33258.

Животные эксперименты

Голые мыши Balb/c подкожно инъциировали 1 × 10⁶ клеток PANC‑1. Когда опухоли достигали ~80 мм³, мышей рандомизировали (n = 5) в группы: физраствор, RV, HRP NP, HRP–RGD NP (10 мг/кг эквивалент RV). Объем опухоли и масса тела отслеживали каждые 3 дня в течение 35 дней. Биораспределение оценивали через 24 ч UV–Vis анализом ткани опухоли. Гистопатологию основных органов проводили посмертно.

Результаты и обсуждение

Фабрикация наночастиц и физико-химические свойства

HRP–RGD NP демонстрировали узкое унимодальное распределение размера (120 ± 2,6 нм) с однородной сферической морфологией. UV–Vis спектры подтвердили инкапсуляцию RV, а флуоресцентная эмиссия при 325 нм подтвердила удержание RV внутри частиц.

Загрузка лекарства и pH-зависимое высвобождение

Эффективность инкапсуляции достигла пика 62,5 ± 4,21 %. Исследования высвобождения показали 58,4 ± 2,8 % кумулятивного высвобождения через 60 ч при pH 5,0 по сравнению со значительно более низкими скоростями при физиологическом pH, что подчеркивает опухоль-специфическое высвобождение.

Повышенная стабильность и биосовместимость

В отличие от кристаллического свободного RV, HRP–RGD NP оставались коллоидально стабильными в ФСБ, DMEM и ФСБ более 4 недель. Флуоресцентная интенсивность сохранялась >96 % через 4 недели, тогда как свободный RV падал до 12 %. Тесты на гемолиз выявили <5 % гемолиза до 200 мкг/мл, что соответствует контролю ФСБ.

Таргетированное клеточное поглощение

Флюоресцентная цитометрия показала 58,5 ± 3,5 % поглощения HRP–RGD NP клетками PANC‑1, что значительно выше, чем для нетаргетированных HRP NP (16,2 ± 4,9 %) и контрольных с блокировкой RGD (7,1 ± 5,1 %). Конфокальная визуализация подтвердила эффективную внутриклеточную доставку.

Мощная антиопухолевая активность in vitro

HRP–RGD NP демонстрировали дозозависимую цитотоксичность, снижая жизнеспособность PANC‑1 до <30 % при 50 мкг/мл, превосходя свободный RV и HRP NP. Окраска Hoechst выявила характерную для апоптоза хроматиновую конденсацию.

Продленная циркуляция и накопление в опухоли

HRP–RGD NP увеличили полувывод RV в плазме до 6,57 ± 0,9 ч (против 1,21 ± 0,09 ч для свободного RV). Через 24 ч содержание RV в опухоли в группе HRP–RGD было в 3,01 и 8,1 раза выше, чем в группах HRP NP и свободный RV соответственно, что указывает на эффективное EPR-эффект и RGD-медиаторное таргетирование.

In vivo подавление опухоли и безопасность

Лечение HRP–RGD NP полностью останавливало рост опухоли в течение 35 дней без рецидивов. Масса тела оставалась стабильной во всех группах. Гистология сердца, печени, селезенки, легких и почек не показывала патологических изменений, подтверждая системную безопасность.

Заключение

HRP–RGD NP представляют клинически релевантную платформу, преодолевающую ограничения свободного ресвератрола по растворимости, фармакокинетике и таргетированию. Сочетая инкапсуляцию в HSA, PEGилирование и RGD-таргетирование, эти наночастицы обеспечивают устойчивую циркуляцию, опухоль-специфическое накопление и надежную антиопухолевую эффективность с минимальной токсичностью. Это исследование поддерживает их дальнейшее развитие как мощной терапевтической модальности для рака поджелудочной железы.

Аббревиатуры

• CCK‑8: Cell Counting Kit‑8
• FBS: Fetal Bovine Serum (ФСБ)
• FITC: Fluorescein Isothiocyanate
• HSA: Human Serum Albumin (Сывороточный альбумин человека)
• PEG: Polyethylene Glycol (Полиэтиленгликоль)
• RGD: Arginine–Glycine–Aspartate (Аргинин–Глицин–Аспаратат)
• RV: Resveratrol (Рсвератрол)
• PBS: Phosphate‑Buffered Saline (Фосфатно-буферный раствор)