Высокоэффективные опухоль-нацеленные фото-химио тераностические наночастицы: артесунат-загруженные, ICG-конъюгированные человечный сывороточный альбумин

Аннотация

Мы сообщаем о опухоль-специфичной тераностической платформе, объединяющей четыре клинически одобренных агента — артесунат (Arte), человечный сывороточный альбумин (HSA), фолиевую кислоту (FA) и индициазиновый зеленый (ICG) — в единую наночастицу (FA-IHA NP). Эти наночастицы демонстрируют исключительную фото- и физикохимическую стабильность. ICG придает ближний инфракрасный (НИК) флуоресценцию для визуализации и обеспечивает фототермическую (PTT) и фотодинамическую (PDT) терапевтические возможности под единственным 808 нм лазером. Одновременно 808 нм облучение запускает контролируемый выпуск Arte, усиливая химиотерапевтическую эффективность. In vitro и in vivo исследования демонстрируют быстрый клеточный захват и селективную опухольную аккумуляцию, верифицированные конфокальной микроскопией и НИК визуализацией в мышах с ксенографтами HepG2. Единый сеанс НИК облучения (808 нм, 1 Вт/см²) в комбинации с FA-IHA NP полностью подавляет рост опухоли без рецидива. Эти выводы устанавливают FA-IHA NP как перспективную платформу для клинического перевода образ-ориентированной фото-химио терапии.

Введение

Образ-ориентированная фото-химио терапия (IGPC) возникла как убедительная стратегия для персонализированной онкологии, сочетая точную локализацию опухоли с мультимодальным лечением при минимизации сопутствующего ущерба (1–4). Успешная IGPC платформа должна быть: (i) мультифункциональной, интегрирующей диагностические и терапевтические модальности; (ii) биосовместимой, стабильной и опухоль-селективной (5–8). Флуоресцентная визуализация, благодаря своей высокой чувствительности и благоприятному временному разрешению, обычно используется для реального времени навигации (9–16).

Фототермическая терапия (PTT) и фотодинамическая терапия (PDT) могут быть объединены под НИК облучением, доставляя как тепло, так и реактивные формы кислорода (РФК) для аблирования опухолевых клеток (17–19). Тем не менее, монотерапия часто не удаляет остаточную болезнь, приводя к рецидиву (17–19). Конвенциональная химиотерапия предлагает системную цитотоксичность, но страдает от неспецифичности и ассоциированных токсичностей (20–22). Таким образом, IGPC, объединяющая локализованную фоттерапию с нацеленной химиотерапией, обещает преодолеть эти ограничения.

Наномедицина произвела множество IGPC тераностиков, включая индициазиновый зеленый (ICG), металлические наночастицы, углеродные наноматериалы и полимерные системы (23–27). ICG, ФДА-одобренный НИК краситель, широко используется клинически для сердечного выброса, функции печени и офтальмологической ангиографии (28–29). Его сильное поглощение при 800 нм обеспечивает эффективную PTT-PDT. Однако свободный ICG нестабилен, быстро очищается из кровотока, самобесцвечивается и лишен опухольной специфичности (31–32). Инкапсуляция в переносчики, такие как мицеллы, полимеры или белковые наноструктуры, улучшила его производительность, но потребность в более биосовместимых, нацеленных ICG-базированных композитах сохраняется (33–34).

Здесь мы спроектировали опухоль-нацеленный IGPC агент ковалентно связывая FA и ICG к HSA наночастицам, одновременно инкапсулируя Arte — натуральное противомлярийное соединение с доказанной антиопухолевой активностью против печеночных, легких и грудных раков (35). Полученные FA-IHA NP используют FA-опосредованный рецепторный захват, отличную биосовместимость HSA и двойную терапевтическую силу ICG и Arte. Этот мультифункциональный конструктор предлагает НИК визуализацию, PTT-PDT и контролируемую химио-доставку, позиционируя его как универсальную платформу для клинического перевода.

Методы

Материалы

Реактивы включали EDC, NHS и Arte (≥99%) от Sigma-Aldrich; DAPI и CCK-8 от Aladdin; NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH и NH₂-PEG₂₀₀₀-FA от Xi'an Ruixi; DMEM и PBS от Gibco; ICG-NHS от Dojindo. Все химикаты использовались как получены.

Синтез и характеристика FA-IHA NP

Arte растворяли в DMSO, затем добавляли к 15 мл воды. HSA (10 мг) вводили и перемешивали 3 ч при комнатной температуре, за чем следовало перекрестное связывание 150 мкл 0,5% глутаральдегида. Смесь диализировали против дистиллированной воды (MWCO 8–12 кДа) 24 ч для получения Arte-загруженного HSA (Arte-HSA). Активация карбоксильных групп HSA EDC/NHS следовала конъюгации с NH₂-PEG₂₀₀₀-FA (3 ч, 4 °C) и последующим присоединением ICG-NHS (30 мин, RT). Финальные FA-ICG-HSA@Arte (FA-IHA NP) очищали 24-часовым диализом в деионизированной воде. Эффективности загрузки Arte и ICG квантифицировали УФ-виз спектроскопией (загрузка % = W₁/W₂ × 100%).

Морфологию оценивали TEM (Hitachi). Гидродинамический размер и дзета-потенциал измеряли ДЛС (Malvern Zetasizer). Абсорбционные спектры записывали Shimadzu УФ-виз спектрофотометром. Фототермические ответы измеряли 808 нм CW лазером (1 Вт/см²) с температурой, мониторюмой Флук термопарой. Фотостабильность и флуоресцентная долговечность оценивали за 5 циклов и 30 дней соответственно.

Термический и pH-триггерируемый Arte выпуск

FA-IHA NP (50 мкг/мл) инкубировали при pH 6,5, pH 7,4 и pH 6,5 + НИК (808 нм, 1 Вт/см², 1 мин импульс) в течение 36 ч. Arte выпуск квантифицировали УФ-виз при 287 нм в supernatанте.

Детекция единичного кислорода производства

DPBF (15 мкл) смешивали с 1 мл 10 мкг/мл ICG или FA-IHA NP и облучали (808 нм, 1 Вт/см², 5 мин). Уменьшение абсорбции при 410 нм во времени отражало генерацию единичного кислорода.

Клеточная культура и клеточный захват

HepG2 клетки (ATCC) культивировали в DMEM с 10% FBS, 1% пенициллин-стрептомицин при 37 °C, 5% CO₂. Для изучения захвата клетки инкубировали с свободным ICG, IHA NP или FA-IHA NP (0,05 мг/мл ICG) 6 ч, промывали, фиксировали, окрашивали DAPI и визуализировали конфокальной микроскопией. Потоковая цитометрия квантифицировала скорости интернализации.

Генерация внутриклеточных РФК

HepG2 клетки (2×10⁵ клеток/мл) лечили PBS, Arte, FA-HA-NP, свободным ICG, IHA-NP или FA-IHA NP 12 ч, затем облучали (808 нм, 1 Вт/см², 5 мин). DCFH-DA (5 мкг/мл) добавляли 30 мин, за чем следовала потоковая цитометрия и флуоресцентная микроскопия для оценки уровней РФК.

In Vitro опухоль комбинационная фото-химио терапия

HepG2 клетки (2×10⁴ клеток/ячейка) лечили свободным ICG, Arte, IHA NP или FA-IHA NP (Arte 0–30 мкг/мл) 6 ч, затем облучали (808 нм, 1 Вт/см², 5 мин) или оставляли без обработки. Клеточная живучесть измеряли CCK-8 через 24 ч. Live/dead окраска (кальцеин-AM/PI) подтверждала цитотоксичность конфокальным изображением.

Животная модель и In vivo флуоресцентная визуализация

Balb/c голиые мыши (n=5) субкутанно инъецировали 1×10⁶ HepG2 клеток. IVIS Spectrum визуализация (Caliper) отслеживала НИК флуоресценцию при 10 мин, 6 ч, 12 ч, 24 ч и 48 ч после веночного введения свободного ICG, IHA NP или FA-IHA NP.

In vivo опухоль комбинационная фото-химио терапия

Мыши рандомизировали в шесть групп (n=5): PBS, Arte, FA-IHA NP, ICG + НИК, IHA + НИК, FA-IHA + НИК (равнозначная Arte доза). НИК облучение (808 нм, 1 Вт/см², 5 мин) применяли при 24 ч и 48 ч. Объемы опухоли записывали каждые 4 дня и выражали относительно базовой линии. После лечения основные органы собирали для H&E гистологии.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика FA-IHA NP

Рис. 1 схематично изображает дизайн FA-IHA NP и терапевтический рабочий процесс. Наночастицы собирались простым, биосовместимым методом, интегрируя ICG для НИК визуализации и фоттерапии, и Arte для химиотерапевтического действия.

Передаточная электронная микроскопия раскрыла монодисперсные сферические частицы (~131,2 нм). Динамическое световое рассеяние подтвердило гидродинамический диаметр 131 ± 2,3 нм в воде, PBS и клеточной среде, с устойчивым дзета-потенциалом -29,2 ± 1,13 мВ. Размер оставался неизменным за 7 дней, указывая на надежную коллоидную стабильность, предоставляемую PEG и HSA покрытием. УФ-виз спектры показывали характерные пики Arte и ICG, подтверждая успешную загрузку (Arte 98,6 ± 3,1%, ICG 56,9 ± 2,4%). Флуоресцентные спектры совпадали с свободным ICG, подтверждая сохраненные фотophysical свойства.

Фототермическая оценка показала, что FA-IHA NP (равное ICG содержание) повышали температуру на ~36 °C за 5 мин под 808 нм (1 Вт/см²) облучением, в то время как свободный ICG показывал похожий подъем, а вода едва увеличивалась (<4 °C). Фотостабильность тесты раскрыли, что FA-IHA NP сохраняли абсорбцию за пять циклов облучения, в то время как свободный ICG терял интенсивность, подчеркивая защитный эффект ковалентной конъюгации и HSA/PEG инкапсуляции. Флуоресцентная долговечность за 30 дней при 4 °C показывала 28% снижение для FA-IHA NP против 88% падения для свободного ICG, подчеркивая превосходную фотостабильность.

DPFA анализа продемонстрировали, что FA-IHA NP производили 58% стандартного выхода единичного кислорода в течение 5 мин НИК воздействия, превосходя свободный ICG (35%). Это усиление отражает синергетический эффект двойной фоттерапии.

В кислых условиях (pH 6,5) и НИК облучении Arte выпуск из FA-IHA NP увеличился с 11,6% (pH 7,4) до 68,4% (pH 6,5 + НИК). Два триггера — термическое расширение HSA и протонно-опосредованное изменение поверхностного заряда — облегчают контролируемый выпуск лекарства (37–38).

Клеточный захват и детекция внутриклеточных РФК

Конфокальное изображение раскрыло яркую красную ICG флуоресценцию в HepG2 клетках, обработанных FA-IHA NP, превосходящую свободный ICG и IHA NP. Потоковая цитометрия квантифицировала 52,3% скорость захвата для FA-IHA NP, заметно выше IHA NP (25,2%) и свободного ICG (3,9%) — четкое указание на FA-опосредованный рецепторный таргетинг (39–41).

РФК производство, оцененное DCFH-DA, было значительно выше в клетках, обработанных FA-IHA NP после 5 мин НИК облучения по сравнению со всеми другими группами, подтверждая усиленную фотодинамическую активность (Рис. 6a,b).

In Vitro опухоль комбинационная фото-химио терапия

FA-IHA NP достигли наивысшего температурного подъема (~31 °C) среди всех обработок после 5 мин НИК воздействия, коррелируя с превосходной фототермической производительностью (Рис. 7a). Без облучения Arte, IHA NP и FA-IHA NP демонстрировали концентрационно-зависимую цитотоксичность, в то время как свободный ICG оставался инертным. После облучения клеточная живучесть драматически падала в группе FA-IHA NP, атрибутируемая синергестическим химио-фототермическим эффектам. Кальцеин-AM/PI окраска подтвердила почти полную смерть клеток в FA-IHA NP + НИК, в то время как другие группы сохраняли живые клетки (Рис. 7d).

In vivo флуоресцентная визуализация

IVIS визуализация раскрыла сильную toàn-тело флуоресценцию в течение 10 мин после инъекции всех формуляций. Опухольная флуоресценция пиковала при 24 ч, с FA-IHA NP демонстрирующим наивысший сигнал в каждой временной точке, подтверждая FA-драйвенную опухольную аккумуляцию (Рис. 8b). Ex vivo анализ органов при 24 ч показал преобладающую печеночную аккумуляцию во всех группах, согласованную с печеночными клиренс путями (Рис. 8c).

In vivo опухоль комбинационная фото-химио терапия

Термическая визуализация при 24 ч пост-инъекции под НИК облучением показала наибольший температурный прирост (~22,1 °C) для FA-IHA NP, подтверждая мощную фототермическую конверсию (Рис. 9a,b). Два сеанса облучения (день 0 и день 2) привели к полной регрессии опухоли в группе FA-IHA + НИК, без рецидива более 90 дней и 100% выживаемости, в то время как все остальные группы не достигли устойчивого подавления (Рис. 9c,d). Гистологическое обследование не выявило значительной органной патологии в группе FA-IHA + НИК, подчеркивая пренебрежимую системную токсичность (Рис. 10).

Заключение

Мы спроектировали мультифункциональную тераностическую наночастицу, ковалентно конъюгирующую FA и ICG в то время как инкапсулирующую Arte внутри HSA. FA-IHA NP демонстрируют надежную коллоидную и фототермическую стабильность, сохраняют НИК флуоресценцию и выпускают Arte при НИК облучении. FA-опосредованный рецепторный таргетинг дает высокий клеточный захват и опухольную аккумуляцию, позволяя синергестический фототермический-фотодинамический-химиотерапевтический натиск, устраняющий опухоли in vitro и in vivo без рецидива. Эти результаты позиционируют FA-IHA NP как высоко перспективную платформу для клинического перевода образ-ориентированной, опухоль-нацеленной фото-химио терапии.

Аббревиатуры

Arte:

Артесунат

FA:

Фолиевая кислота

HSA:

Человечный сывороточный альбумин

ICG:

Индициазиновый зеленый

НИК:

Ближний инфракрасный

PDT:

Фотодинамическая терапия

PEG:

Полиэтиленгликоль

PTT:

Фототермическая терапия