Куркумин-загруженные хитосан-БСА наночастицы усиливают клиренс амилоида-β42 и модулируют поляризацию макрофагов при болезни Альцгеймера

Аннотация

Болезнь Альцгеймера (БА) остается ведущим нейродегенеративным расстройством среди пожилых, однако эффективные терапии ограничены гематоэнцефалическим барьером (ГЭБ), плохим клиренсом амилоида-β (Aβ) и хроническим нейровоспалением. Мы спроектировали наночастицы (НЧ) на основе хитосана (CS) и сывороточного альбумина грызуна (BSA) для доставки куркумина — мощного противовоспалительного и антиамилоидогенного полифенола — непосредственно в мозг. Куркумин-загруженные CS-БСА НЧ достигли 95,4% эффективности инкапсуляции, среднего диаметра 143,5 нм и отрицательного заряда поверхности –10,8 мВ, обеспечивая стабильность и благоприятную проницаемость ГЭБ. In vitro модели ГЭБ показали 60,2% проникновения НЧ за 3 ч, заметно выше свободного куркумина (29,8%). Клеточные исследования улавливания выявили повышенные внутриклеточные уровни куркумина в макрофагах RAW 264.7, что в свою очередь увеличило фагоцитоз Aβ42. Механистически НЧ подавляли ось TLR4-MAPK/NF-κB, снижали про-воспалительные цитокины (TNF-α, IL-6) и смещали макрофаги от нейротоксичного М1 к защищенному М2 фенотипу. Эти выводы демонстрируют, что куркумин-загруженные CS-БСА НЧ потенцируют клиренс Aβ42 в то же время модулируя нейровоспаление, предлагая перспективную наномедицинскую платформу для терапии БА.

Введение

БА характеризуется прогрессирующим когнитивным снижением и признаковым депонированием внеклеточных Aβ42 фибрилл. В то время как мономерный Aβ42 физиологически безвреден, олигомерные агрегаты высоконейротоксичны и движут прогрессией болезни. Нацеливание на агрегацию Aβ42 и продвижение его клиренса поэтому центральны для терапевтических стратегий. Микроглиальные клетки, резидентные макрофаги мозга, распознают Aβ через toll-подобные рецепторы (TLR) и фагоцитируют пептид. Однако хроническая активация поляризует микроглию к про-воспалительному М1 фенотипу, усугубляя нейронную травму. Продвижение перехода к противовоспалительному М2 фенотипу возникло как жизнеспособный болезнемодифицирующий подход.

Куркумин, полученный из куркумы (Curcuma longa), демонстрирует антиамилоидогенные, антиоксидантные и хелатирующие металлы свойства. Он может модулировать поляризацию макрофагов, ингибируя каскад сигнализации TLR4-MAPK/NF-κB. К сожалению, плохая растворимость, быстрый метаболизм и ограниченная проницаемость ГЭБ ограничивают клиническую пользу куркумина.

Наночастицы-переносчики могут преодолеть эти барьеры. CS — катионный, биосовместимый полисахарид, способный формировать стабильные комплексы с анионными белками, такими как BSA. BSA обильно в плазме, не иммуногенна и придает наночастицам свойства устойчивого выпуска. Комбинируя CS и BSA, мы изготовили куркумин-загруженные НЧ, оптимизированные для проникновения ГЭБ и целевой доставки к микроглии.

Материалы

CS (деацетилирование 80%, ~400 кДа) получен от Haixin Biological Product Co., Ltd. BSA (Sigma-Aldrich), куркумин (Dalian Meilun Biotechnology) и FITC-маркированный Aβ42 (Chinese Peptide Co.) приобретены коммерчески. Клеточные линии RAW 264.7 (мышиные моноцитарные макрофаги) и hCMEC/D3 (человечные микровaskuлярные эндотелиальные клетки мозга) культивировали в DMEM с 10% фетальной телячьей сывороткой и антибиотиками. LPS (1 мкг/мл) использовали для поляризации RAW 264.7 в М1 фенотип, имитируя активацию микроглии при БА.

Приготовление куркумин-загруженных CS-БСА НЧ

CS растворяли в 0,1% уксусной кислоте (0,5 мг/мл). Куркумин (0,05 мг/мл в 100 мкл DMSO) смешивали в CS раствор под магнитным перемешиванием при комнатной температуре. Раствор BSA (1,0 мг/мл) затем добавляли капельно, образуя опалесцентную суспензию, конденсировавшуюся в твердые наночастицы через электростатическое взаимодействие. Размер частиц, дзета-потенциал и морфологию характеризовали динамическим световым рассеянием и ТЭМ. In vitro выпуск оценивали в фосфатно-буферном растворе (pH 7,4) при 37 °C, а эффективность инкапсуляции (ЭИ) рассчитывали как ЭИ % = (W_total – W_free)/W_total × 100%, где W_total — начальное количество куркумина, W_free — супернатант.

Оценка апоптозы клеток методом MTT

Пустые CS-БСА НЧ (0–2,0 мг/мл) инкубировали с RAW 264.7 (М1) и hCMEC/D3 клетками 24 ч для оценки цитотоксичности методом MTT.

Исследования проникновения с использованием in vitro модели ГЭБ

Монослой клеток hCMEC/D3 (TEER > 300 Ом) культивировали на вставках Transwell. Свободный куркумин или куркумин-загруженные CS-БСА НЧ (эквивалент куркумина 100 мкг/мл) добавляли в верхнюю камеру. После 3 ч инкубации при 37 °C флуоресцентная интенсивность куркумина (возбуждение 425 нм, эмиссия 530 нм) в нижней камере измеряли. Относительное флуоресцентное отношение (RFR %) kvantифицировало эффективность проникновения. Эндоцитозные ингибиторы (хлорпромазин, генистеин, цитолазин D, азид натрия) применяли для элиucidации транспортных механизмов.

Клеточное улавливание куркумин-загруженных CS-БСА НЧ

Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (CLSM) оценивала внутриклеточное распределение куркумина в RAW 264.7 (М1) клетках после воздействия свободного куркумина или куркумин-загруженных НЧ через систему Transwell. Зеленая флуоресценция куркумина мониторилась в интервалах 6, 12 и 24 ч.

Обнаружение фагоцитоза Aβ42, индуцированного свободным куркумином и куркумин-загруженными CS-БСА НЧ

RAW 264.7 (М1) клетки, предварительно обработанные свободным куркумином или куркумин-загруженными НЧ, инкубировали с FITC-маркированным Aβ42 в течение 3 ч. Фагоцитоз квантовали CLSM флуоресценцией и потоковой цитометрией.

Вестерн блот анализ

Уровни экспрессии TNF-α, IL-6, TLR4 и фосфорилированных состояний ERK, JNK, p38, IκBα и NF-κB изучали вестерн блotingом для элиucidации влияния куркумин-загруженных НЧ на ось TLR4-MAPK/NF-κB.

Результаты

Характеристика куркумин-загруженных CS-БСА НЧ

Динамическое световое рассеяние выявило средний диаметр 143,5 нм, дзета-потенциал –10,8 мV и индекс полидисперсности 0,021. TEM изображения подтвердили сферические, монодисперсные частицы (Рисунок 1). Эффективность инкапсуляции достигла 95,4%. Профиль выпуска показал начальный всплеск 11,3% в течение 3 ч, с последующим устойчивым выпуском в течение 48 ч, указывая на эффективную защиту куркумина при циркуляции.

Проникновение через in vitro модель ГЭБ

Проникновение свободного куркумина составило 12,3% (1 ч), 20,3% (2 ч) и 29,8% (3 ч). Куркумин-загруженные НЧ достигли 37,7%, 45,6% и 60,2% проникновения в те же временные точки соответственно (Рисунок 2). Эксперименты с ингибиторами эндоцитоза продемонстрировали, что НЧ опираются на энергозависимые, кавеола- и макропиноцитоз-медированные пути, тогда как свободный куркумин входит в клетки преимущественно пассивной диффузией.

Оценка цитотоксичности

MTT-тесты подтвердили, что пустые CS-БСА НЧ не цитотоксичны для RAW 264.7 (М1) и hCMEC/D3 клеток при концентрациях до 2,0 мг/мл (Рисунок 3).

Клеточное улавливание

CLSM визуализация показала время-зависимое накопление куркумина внутри RAW 264.7 (М1) клеток. Куркумин-загруженные НЧ дали заметно более высокую внутриклеточную флуоресценцию, чем свободный куркумин, указывая на усиленную доставку (Рисунок 4).

Усиленный фагоцитоз Aβ42

Колокализация куркумина (красный) и FITC-Aβ42 (зеленый) продемонстрировала, что куркумин-загруженные НЧ увеличили внутриклеточное присутствие Aβ42 в RAW 264.7 (М1) клетках, как свидетельствует более высокая плотность зеленой флуоресценции (Рисунок 5). Это предполагает, что повышенные внутриклеточные уровни куркумина усиливают фагоцитарную способность микроглии.

Вестерн блот анализ

По сравнению с необработанными контролями, LPS-поляризованные RAW 264.7 (М1) клетки демонстрировали повышенную экспрессию TNF-α, IL-6 и TLR4, и увеличенную фосфориляцию ERK, JNK, p38 и NF-κB. Куркумин-загруженные НЧ заметно снизили эти про-воспалительные маркеры и сигнальные события, подчеркивая их способность ингибировать М1 поляризацию (Рисунок 6).

Обсуждение

Наши результаты подтверждают, что CS-БСА наночастицы значительно усиливают доставку куркумина через ГЭБ, преимущественно через кавеола- и макропиноцитоз-медированные пути. Улучшенное проникновение мозга переводится в более высокие внутриклеточные концентрации куркумина, что, в свою очередь, усиливает микроглиальный фагоцитоз Aβ42 и снижает патологическую нагрузку амилоидных бляшек.

Противо-воспалительный эффект куркумин-загруженных НЧ очевиден через подавление каскада TLR4-MAPK/NF-κB и даун-регуляцию TNF-α, IL-6 и TLR4. Эта цитокиномодуляция ре-поляризует макрофаги от нейротоксичного М1 фенотипа к противовоспалительному М2 состоянию, терапевтическая стратегия, все более признанная для модификации болезни при БА.

В совокупности эти выводы позиционируют куркумин-загруженные CS-БСА НЧ как многогранную наномедицинскую платформу, одновременно адресующую доставку лекарства, клиренс амилоида и нейровоспаление — ключевые препятствия в лечении БА.

Заключение

Куркумин-загруженные CS-БСА наночастицы эффективно проникают ГЭБ, усиливают внутриклеточное накопление куркумина и продвигают фагоцитоз Aβ42 микроглией. Они также митигируют нейровоспаление, ингибируя путь TLR4-MAPK/NF-κB и способствуя М2 поляризации макрофагов. Эти атрибуты в совокупности подчеркивают терапевтическую перспективу этой наноплатформы для болезни Альцгеймера.

Аббревиатуры

AD

Болезнь Альцгеймера

BBB

Гематоэнцефалический барьер

BSA

Сывороточный альбумин грызуна

CS

Хитосан

LPS

Липополисахарид

NPs

Наночастицы

TLRs

Toll-подобные рецепторы