Наночастицы хитозана и бычьего сывороточного альбумина, нагруженные куркумином, потенциально усиливают фагоцитоз Aβ 42 и модулируют поляризацию макрофагов при болезни Альцгеймера

Введение

Болезнь Альцгеймера (БА) - это нейродегенеративное заболевание, характеризующееся незаметным началом и прогрессирующим снижением когнитивных функций. Гистопатологически амилоид-β (Aβ) 42 в виде пептида, содержащего 42 аминокислоты, агрегирован в амилоидные β-пептидные фибриллы, характеризующиеся внеклеточными «старческими бляшками» при БА, вызывая, таким образом, апоптоз нейронов и потерю синапсов [1,2,3] . Как правило, мономеры Aβ 42 физиологически растворимы и нетоксичны, а его олигомеры более токсичны in vitro и in vivo [4, 5]. Следовательно, вмешательство в агрегацию Aβ 42 путем очистки мономера Aβ 42 широко считается наиболее подходящей терапевтической мишенью для AD [6,7,8,9]. Хорошо известно, что пептиды Aβ могут запускать активацию микроглии, взаимодействуя с несколькими Toll-подобными рецепторами (TLR), включая TLR4, и они также способствуют зависимому от CD14, TLR4 или TLR2 фагоцитозу и клиренсу Aβ 42 [10, 11,12]. Хотя активация микроглии может способствовать клиренсу Aβ 42, клетки микроглии - тип мононуклеарных макрофагов - возможно чрезмерно активированы и поляризованы по фенотипу M1 (характеризующемуся высвобождением потенциально нейротоксичных растворимых факторов и провоспалительных цитокинов), что приводит к к гибели нейронов и усугублению развития АД. Напротив, некоторые микроглиальные клетки имеют классически активированный (M2) фенотип, характеризующийся продуцированием противовоспалительных цитокинов; они улучшают когнитивную дисфункцию при БА [13,14,15,16]. Следовательно, соотношение макрофагов M1 / ​​M2-типа может существенно влиять на прогрессирование БА [17, 18]; кроме того, повышающая регуляция, необходимая для преобразования провоспалительного M1 в противовоспалительные макрофаги M2, покажет многообещающий потенциал в профилактике и лечении AD.

Куркумин, который происходит из компонента индийской пряности куркумы (Curcumin longa) - типа имбиря - является мощным противовоспалительным агентом, который может уменьшить воспаление и даже может играть роль в лечении AD [19]. В последние годы было обнаружено, что куркумин, как сообщается, обладает антиамилоидогенными, противовоспалительными, антиоксидантными и хелатирующими металлами свойствами, которые могут иметь потенциальные нейрозащитные эффекты [20, 21]. Куркумин модулирует поляризацию макрофагов за счет ингибирования путей метаболизма toll-подобного рецептора 4-митоген-активируемой протеинкиназы (TLR4-MAPK) / NF-κB [22,23,24]. Однако низкая стабильность и биодоступность куркумина ограничивают его клиническое применение. Кроме того, наличие гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) также предотвращает проникновение куркумина при лечении БА [25,26,27].

Чтобы улучшить транспортировку лекарств из крови в мозг, наночастицы (НЧ) с поверхностью, функционализированной пептидами [28] и антителами [29], способствуют доставке лекарств через ГЭБ, а эффективность проникновения НЧ через ГЭБ может быть значительно увеличена с помощью других механизмов активного транспорта. чем простая пассивная диффузия [30]. НЧ хитозана (CS) - наноноситель для связывания с Aβ - могут проникать через ГЭБ и не являются иммуногенными [31]. Кроме того, в циркулирующей плазме человеческого тела был обнаружен сывороточный альбумин в концентрации 50 г / л сыворотки, он не токсичен и хорошо переносится иммунной системой [32, 33]. Также сообщалось, что наночастицы, полученные из бычьего сывороточного альбумина (БСА), обладают свойствами замедленного высвобождения, которые могут увеличивать период полувыведения лекарственного средства, тем самым уменьшая частоту введения и повышая комплаентность пациента [34]. Поэтому мы использовали CS и BSA в качестве двух биоматериалов для приготовления загруженных куркумином CS-BSA NP для достижения наилучшего проникновения BBB. Влияние куркумина на фагоцитоз Aβ 42, секрецию воспалительных цитокинов и регуляцию путей TLR4-MAPK / NF-κB были исследованы для дальнейшего подтверждения молекулярного механизма куркумина на поляризацию макрофагов.

Материалы

CS со степенью деацетилирования 80% и молекулярной массой приблизительно 400 кДа был приобретен у Haixin Biological Product Co., Ltd. (Нинбо, Китайская Народная Республика). BSA был приобретен у Sigma-Aldrich Co. (Сент-Луис, Миссури, США), а куркумин был приобретен у Dalian Meilun Biotechnology Co., Ltd. (Далянь, Китайская Народная Республика). FITC-β-амилоид (1–42) был приобретен у Chinese Peptide Co., Ltd. (Ханчжоу, Китайская Народная Республика). Другие закупленные химические вещества были аналитической чистоты и были получены от Sigma-Aldrich Co. Линия клеток макрофагов, RAW 264.7 (линия клеток макрофагов лейкозных моноцитов мыши) и линия эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга (hCMEC / D3), которая служила моделью. ГЭБ человека были созданы Шанхайским институтом клеточной биологии Китайской академии наук, Шанхай (Китайская Народная Республика). Обе ячейки поддерживали при температуре 37 ° C и 5% CO ₂ атмосферы в модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM) с добавлением 10% (объем / объем) инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки и антибиотиков (100 Ед / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина). Сообщалось, что клетки RAW 264.7, обработанные липополисахаридом (LPS), воспроизводят аспекты микроглиальных клеток, наблюдаемые при нейродегенеративных заболеваниях, примером которых является AD [35, 36]. Поэтому клетки линии макрофагов RAW 264.7, поляризованные до фенотипа M1 липополисахаридом (LPS; 1 мкг / мл), были дополнительно применены для моделирования микроглиальных клеток при AD.

Приготовление загруженных куркумином НЧ CS-BSA

Согласно нашему предыдущему отчету [37], при электростатическом взаимодействии положительно заряженный CS может конъюгировать с отрицательно заряженным BSA с образованием НЧ. Методика приготовления была следующей:для растворения CS использовали 0,1% уксусную кислоту, чтобы получить раствор CS с концентрацией 0,5 мг / мл, и 100 мкл ДМСО, содержащего 0,05 мг / мл куркумина, добавляли в раствор CS для тщательного перемешивания под магнитной мешалкой. перемешивание при комнатной температуре. В качестве подходящего количества раствора BSA, 1,0 мг / мл медленно добавляли в смесь CS и куркумина; в этот момент появилось явление опалесценции, и наночастицы CS-BSA в дальнейшем конденсировались в твердые частицы. Кроме того, были исследованы размер, полидисперсность, дзета-потенциал и морфология наночастиц. Высвобождение лекарств из НЧ in vitro оценивали с использованием ранее описанного метода [37]. Эффективность инкапсуляции (ЭЭ,%) куркумина в НЧ рассчитывалась с использованием приведенного ниже уравнения.

\ (\ mathrm {EE} \% =\ frac {W _ {\ mathrm {total}} - {W} _ {\ mathrm {free}}} {W _ {\ mathrm {total}}} \ times 100 \% \ )

Вт _всего было количество первоначально добавленного куркумина, W _{бесплатно} было количество куркумина, оставшегося в супернатанте.

Оценка апоптоза клеток с помощью MTT

Чтобы определить безопасность НЧ CS-BSA в отношении апоптоза клеток, для оценки жизнеспособности клеток использовали анализ МТТ. Согласно протоколу нашего предыдущего исследования, разные количества холостых НЧ CS-BSA использовали для обработки клеток RAW 264.7 (фенотип M1) и клеток hCMEC / D3 в течение 24 часов при 37 ° C для дальнейшего анализа.

Исследования проникновения с использованием модели ГЭБ in vitro

Монослойная трансвеллентная культура с использованием линии эндотелиальных клеток микрососудов головного мозга hCMEC / D3 представляет собой обычную in vitro модель BBB, которую используют для изучения доставки в мозг НЧ. Смесь клеток hCMEC / D3 (в общем объеме 0,5–1,0 мл) добавляли во вставку в верхней камере 12-луночного планшета с транслуночками для монослойной культуры клеток с трансэндотелиальным электрическим сопротивлением> 300 Ом; В нижнюю камеру добавляли PBS с уровнем pH 7,4. Свободный куркумин и суспензия загруженных куркумином НЧ CS-BSA были помещены в верхнюю камеру для непрерывной инкубации в течение 3 часов в инкубаторе, установленном на 37 ° C, 5% CO ₂ . После этого свободный куркумин и загруженные куркумином НЧ CS-BSA переносились через клетки и вводились в нижнюю камеру. Количественное определение проникающих НЧ определяли с помощью микропланшет-ридера (Synergy-2; BioTek Instruments, Winooski, VT, USA) путем проверки интенсивности флуоресценции куркумина, который возбуждается при 425 нм и испускается при 530 нм. Относительный коэффициент флуоресценции (RFR,%), который представляет скорость проникновения НЧ, был рассчитан путем определения отношения интенсивности флуоресценции проникающих НЧ CS-BSA, содержащих куркумин в нижней камере, к интенсивности первоначально добавленного куркумина. загружали НЧ CS-BSA в верхнюю камеру. Различные ингибиторы эндоцитов, такие как хлорпромазин (который ингибирует опосредованное клатрином поглощение) в концентрации 10 мкг / мл, генистеин (поглощение, опосредованное кавеолами) в концентрации 1 мкг / мл, цитохалазин D (30 мкМ, макропиноцитоз) и 20 мкг / мл натрия. азид (ингибитор энергии), были использованы для выяснения различных путей эндоцитоза, участвующих в различных механизмах проникновения. Относительный коэффициент проникновения был определен путем сравнения скорости проникновения НЧ, обработанных ингибиторами, со скоростью проникновения НЧ, обработанных неингибиторами.

Поглощение клетками загруженных куркумином НЧ CS-BSA

Распределение и расположение загруженных куркумином НЧ CS-BSA в клетках RAW 264.7 (фенотип M1) наблюдали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (FluoView FV10i; Olympus Corporation, Токио, Япония). Смесь клеток hCMEC / D3 (в общем объеме 0,5–1,0 мл) добавляли во вставку в верхней камере 12-луночного планшета Transwell для монослойной культуры клеток с трансэндотелиальным электрическим сопротивлением> 300 Ом. Клетки RAW 264.7 (фенотип M1) высевали в нижнюю камеру. Свободный куркумин и суспензия нагруженных куркумином НЧ CS-BSA помещали в верхнюю камеру для непрерывной инкубации в инкубаторе, установленном на 37 ° C, 5% CO ₂ . Через заданные промежутки времени наблюдали клеточное распределение свободного куркумина и загруженных куркумином НЧ CS-BSA в клетках RAW 264.7 (фенотип M1) путем обнаружения зеленой флуоресценции, испускаемой куркумином, с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии.

Обнаружение фагоцитоза Aβ 42, индуцированного свободным куркумином и загруженными куркумином НЧ CS-BSA

Клетки RAW 264.7 (фенотип M1) в полноценной ростовой среде высевали в 12-луночный планшет (1 × 10 ⁵ клеток / лунку) и обрабатывали свободным куркумином и загруженными куркумином НЧ CS-BSA в течение 24 ч при 37 ° C. Чтобы удалить неинтернализованный куркумин и нагруженные куркумином НЧ CS-BSA, дважды за короткое время использовали дистиллированную воду для промывки клеток. Было обнаружено, что куркумин и нагруженные куркумином НЧ CS-BSA были полностью удалены из среды, и не было очевидного риска того, что клетки из дистиллированной воды вызвали низкую осмолярность, потому что морфология клеток, промытых дистиллированной водой, была неизменной и не было разрыва клеток. наблюдалось. Наконец, свободный FITC-меченный Aβ 42, растворенный в PBS (pH 7,4), добавляли в планшет для непрерывной инкубации в течение 3 часов. Фагоцитоз FITC-меченного Aβ 42 в клетки RAW 264.7 (фенотип M1) был представлен путем обнаружения зеленой флуоресценции, испускаемой FITC. Внутриклеточный фагоцитоз и расположение Aβ 42 внутри клеток были дополнительно изучены с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (FluoView FV10i; Olympus Corporation).

Вестерн-блоттинг

Чтобы изучить возможный молекулярный механизм поляризации макрофагов, опосредованной куркумином, мы исследовали уровни экспрессии провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (TNF) -α и интерлейкин (IL) -6, а также уровни фосфорилирования ERK, JNK. , p38 и NF-κB с помощью вестерн-блоттинга для дальнейшего изучения специфических эффектов куркумина на сигнальный путь TLR4-MAPK / NF-κB.

Результаты

Характеристика загруженных куркумином НЧ CS-BSA

Характеристики НЧ были исследованы для определения размера их частиц, дзета-потенциала и морфологии с использованием Zetasizer (Nano ZS90; Malvern Instruments, Малверн, Великобритания) и просвечивающего электронного микроскопа (TEM) (Jeol, Токио, Япония) при ускоряющем напряжении 200 кВ. Результаты, показанные на фиг. 1, показывают, что НЧ CS-BSA имеют средний размер при 143,5 нм, отрицательный дзета-потенциал при -10,8 мВ и полидисперсность при 0,021 соответственно. Было отмечено, что загруженные куркумином CS-BSA НЧ имели сферическую форму и были монодисперсными. Полученную суспензию, содержащую нагруженные куркумином НЧ CS-BSA, центрифугировали для получения раствора супернатанта для определения оптической плотности куркумина и расчета содержания свободного куркумина в растворе супернатанта в соответствии со стандартной кривой. Эффективность инкапсуляции (ЭЭ,%) куркумина в НЧ составила 95,4%. Что касается процесса высвобождения лекарственного средства из НЧ, нагруженные куркумином НЧ CS-BSA показали двухфазный характер высвобождения в среде с уровнем pH 7,4. Около 11,3% всех лекарств высвобождались в течение первых 3 часов, что указывает на то, что, когда НЧ вошли в кровоток до достижения ГЭБ, куркумин был хорошо защищен и инкапсулировался в ядре НЧ. Кроме того, некоторые лекарства вытекли из НЧ и попали в кровь в течение первых 3 часов. Большинство загруженных куркумином НЧ CS-BSA могут транспортироваться вокруг ГЭБ и увеличивать концентрацию препарата вокруг мозга.

Характеристика загруженных куркумином НЧ CS-BSA. а ПЭМ-изображение наночастиц CS-BSA, нагруженных куркумином. б Анализ динамического светорассеяния (DLS) полученных наночастиц CS-BSA, нагруженных куркумином. c Анализ дзета-потенциала полученных НЧ CS-BSA, нагруженных куркумином. г Профиль высвобождения in vitro полученных НЧ CS-BSA, нагруженных куркумином, в фосфатно-солевом буфере с pH 7,4 при 37 ° C в течение 48 ч

Исследования проникновения с использованием модели ГЭБ in vitro

Скорость проникновения свободного куркумина и НЧ оценивалась путем проверки интенсивности флуоресценции куркумина в нижней камере с помощью считывающего устройства для микропланшетов (Synergy-2; BioTek Instruments), и они рассчитывались путем определения отношения интенсивности флуоресценции проникшего куркумина. НЧ CS-BSA, загруженных в нижнюю камеру, по сравнению с первоначально добавленными НЧ CS-BSA с куркумином в верхней камере. Результаты (рис. 2) показали, что процесс проникновения свободного куркумина и нагруженных куркумином НЧ CS-BSA следовал зависимым от времени моделям, и скорость проникновения со временем увеличивалась. Это предполагает, что степень проникновения свободного куркумина составляла 12,3% через 1 час, 20,3% через 2 часа и 29,8% через 3 часа. По сравнению со свободным куркумином, эффективность проникновения загруженных куркумином наночастиц CS-BSA была увеличена, о чем свидетельствует повышенная скорость проникновения; степень проникновения увеличилась до 37,7% через 1 час, 45,6% через 2 часа и 60,2% через 3 часа. Это указывает на то, что свободный куркумин может сталкиваться с трудностями при проникновении через клетки и показал плохую проницаемость для ГЭБ [38, 39]. Это наблюдение также показало, что нагруженные куркумином НЧ CS-BSA могут эффективно способствовать проникновению лекарственного средства через клетки, предполагая роль, которую играют различные пути эндоцитоза. Тест на ингибирование эндоцитоза показал, что в соответствии с предыдущими отчетами [40], свободный куркумин зависит от пассивной диффузии для проникновения и что не было очевидных изменений в эффективности проникновения свободного куркумина, независимо от того, был добавлен ингибитор или нет. Напротив, проникновение наночастиц зависело от энергии, и относительный коэффициент проникновения, обработанный азидом натрия, составлял 55,6%. Более того, как кавеолы, так и макропиноцитоз в первую очередь опосредуют эндоцитотические пути НЧ. По сравнению с лечением неингибиторами относительные коэффициенты проникновения в клетки, обработанные генистеином и цитохалазином D, составили 67,8% и 60,3% соответственно.

Анализ механизма проникновения свободного куркумина и нагруженных куркумином НЧ CS-BSA через клетки hCMEC / D3. а Анализ спектра флуоресценции скорости проникновения свободного куркумина и загруженных куркумином НЧ CS-BSA. Результаты выражаются в виде среднего значения ± стандартное отклонение ( n =3). * P <0,05, ** P <0,01 по сравнению со скоростью проникновения свободного куркумина за 1 час. ^## P <0,01 по сравнению со скоростью проникновения наночастиц CS-BSA, нагруженных куркумином, через 1 час. б Влияние ингибиторов эндоцитов на проникающую способность свободного куркумина и загруженных куркумином НЧ CS-BSA. Результаты выражаются в виде среднего значения ± стандартное отклонение ( n =3). ^## P <0,01 по сравнению с относительным коэффициентом проникновения загруженных куркумином НЧ CS-BSA, обработанных хлорпромазином

Оценка апоптоза клеток с помощью MTT

Цитотоксические эффекты холостых НЧ CS-BSA против клеток RAW 264.7 (M1) и hCMEC / D3 оценивали in vitro с помощью МТТ-анализа. Клетки обрабатывали различными концентрациями НЧ CS-BSA, которые варьировались от 0 до 2,0 мг / мл. Анализ жизнеспособности клеток на рис. 3 показал, что не наблюдалось явной цитотоксической активности в клетках RAW 264.7 и клетках hCMEC / D3 при обработке холостых НЧ CS-BSA [37].

Жизнеспособность клеток RAW 264.7 (M1) и клеток hCMEC / D3 после инкубации с различными количествами голых НЧ CS-BSA в течение 24 часов ( n =3)

Распределение и поглощение НЧ клетками

Свободный куркумин и нагруженные куркумином НЧ CS-BSA, содержащие такое же количество куркумина в концентрации 100 мкг / мл, использовали для обработки клеток RAW 264.7 (M1), а распределение и клеточное поглощение куркумина наблюдали с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (FluoView FV10i; Олимп). На рис. 4 можно видеть, что внутриклеточное распределение свободного куркумина и нагруженных куркумином НЧ CS-BSA следует графику, зависящему от времени, и что зеленая флуоресценция куркумина накапливается внутри клетки и распространяется по всей цитоплазме. С течением времени интенсивность зеленой флуоресценции внутри клеток увеличивалась. Это продемонстрировало, что зеленая флуоресценция, испускаемая свободным куркумином внутри клеток, была очень слабой, что указывало на то, что большая часть свободного куркумина не поглощалась линией клеток макрофагов RAW 264.7. Поскольку НЧ могут иметь многообещающий потенциал для высокоэффективной внутриклеточной доставки лекарств [41, 42], было обнаружено, что НЧ CS-BSA, нагруженные куркумином, показали повышенную интенсивность флуоресценции по сравнению с клетками, обработанными свободным куркумином, что позволяет предположить, что НЧ CS-BSA могут улучшать клеточное поглощение куркумина. Это наблюдение показало, что НЧ CS-BSA могут эффективно способствовать накоплению лекарств в клетках.

Поглощение свободного куркумина и нагруженных куркумином НЧ CS-BSA клетками RAW 264.7 (M1) в течение 6 часов. Куркумин показал зеленый флуоресцентный цвет и указывал на внутриклеточное расположение свободных куркумина и загруженных куркумином НЧ CS-BSA. Ядро окрашивали Hoechst (синий) в течение 15 мин при 37 ° C. Масштабная линейка составляет 50 мкм и применяется ко всем частям рисунка

Фагоцитоз Aβ 42, индуцированный свободным куркумином и загруженными куркумином НЧ CS-BSA

Как показано на рис. 5, куркумин проявлял красную флуоресценцию при длине волны возбуждения 550 нм и длине волны излучения 570 нм. Кроме того, он также показал зеленую флуоресценцию на длинах волн возбуждения и излучения FITC. Следовательно, как только куркумин и меченный FITC Aβ 42 фагоцитировали в клетки RAW 264.7 (M1), все они проявляли зеленую флуоресценцию на длинах волн возбуждения и излучения FITC. В эксперименте по совместной локализации красная флуоресценция и зеленая флуоресценция (представляющие куркумин) были объединены, а желтые точки представляли внутриклеточное существование и расположение куркумина; некоторые зеленые точки не были совмещены с красными флуоресцентными точками, что свидетельствует о существовании и фагоцитозе FITC-меченного Aβ 42 в клетках RAW 264.7 (M1). Было замечено, что небольшое количество Aβ 42 фагоцитировалось микроглией [43], что было доказано внутриклеточным наблюдением зеленой флуоресценции в клетках. Как показано на наложенном изображении на рис. 5, по сравнению со свободным куркумином внутри клеток накопилось больше желтых флуоресцентных точек куркумина, что позволяет предположить, что большое количество нагруженных куркумином НЧ CS-BSA, представленных желтыми флуоресцентными лампами. интенсивность накапливалась в клетках за счет взаимодействия НЧ с клетками RAW 264.7 (M1). Это индуцировало более высокие внутриклеточные концентрации куркумина, что приводило к усилению фагоцитоза Aβ 42 [44], о чем свидетельствует более высокая интенсивность зеленой флуоресценции. Предполагалось, что нагруженные куркумином НЧ CS-BSA индуцируют поляризацию макрофагов, а также обладают противовоспалительным и нейропротекторным действием, что способствует усилению фагоцитоза.

Фагоцитоз Aβ 42, индуцированный свободным куркумином и загруженными куркумином НЧ CS-BSA. Масштабная линейка составляет 50 мкм и применяется ко всем частям рисунка

Вестерн-блоттинг

Чтобы изучить возможные молекулярные механизмы поляризации макрофагов, опосредованной куркумином, мы исследовали общие уровни TNF-α, IL-6 и TLR4, а также уровни фосфорилирования p38, ERK, JNK и IκBα с помощью вестерн-блоттинга для дальнейшего изучения специфические эффекты куркумина на сигнальный путь TLR4-MAPK / NF-κB.

На фигуре 6 показано, что по сравнению с нормальными клетками RAW 264.7 в качестве контрольной группы, клетки RAW 264.7 (фенотип M1) высвобождали больше потенциально нейротоксичных растворимых факторов и провоспалительных цитокинов, характеризующихся более высокими уровнями экспрессии TNF-α и IL-6. что приводит к гибели нейронов и усугубляет развитие AD. По сравнению с контролем и свободным куркумином, нагруженные куркумином НЧ CS-BSA, по-видимому, ингибируют поляризацию макрофагов M1 и индуцируют самую низкую экспрессию TNF-α и IL-6 в клетках RAW 264.7 (фенотип M1). Кроме того, нагруженные куркумином НЧ CS-BSA также снижают экспрессию TLR4, которая регулирует поляризацию макрофагов M1, и фосфорилирование ERK, JNK, p38 и NF-κB, по-видимому, снижается. Это предполагает, что нагруженные куркумином НЧ CS-BSA эффективно способствовали накоплению куркумина - и его последующей внутриклеточной концентрации - в клетках, тем самым усиливая его блокирующие эффекты на сигнальный путь TLR4-MAPK / NF-κB и дополнительно подавляя поляризацию макрофагов M1.

Вестерн-блоттинг-анализ уровней экспрессии TNF-α, IL-6, TLR4 и фосфорилирования ERK, JNK, p38 и ядерного фактора (NF) -κB в клетках RAW 264.7 (фенотип M1) после обработки свободным куркумином и куркумином загруженные НЧ CS-BSA

Обсуждение

БА - одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний и основная причина смерти в развитых странах. Что касается лечения БА, способность ГЭБ предотвращать попадание большинства экзогенных веществ в мозг является основным препятствием, препятствующим их использованию. Чтобы решить эту проблему, мы разработали CS-BSA NP, чтобы улучшить транспортировку куркумина через BBB. Результаты показали, что в соответствии с предыдущим исследованием [45] свободный куркумин плохо проникает через клетки и проникает через ГЭБ, что приводит к более низкому проникающему эффекту. Нагруженные куркумином НЧ CS-BSA могут эффективно способствовать проникновению лекарства через ГЭБ с опосредованием кавеол и микропиноцитоза. Нейровоспаление, вызванное агрегацией Aβ, является одним из критических факторов, лежащих в основе патологических механизмов БА [46]. Уровни Aβ в головном мозге определяются динамическим балансом между образованием и клиренсом Aβ; следовательно, удаление Aβ также важно для определения его уровня в головном мозге. Способность микроглии к фагоцитозу имеет важное физиологическое значение в профилактике БА. Микроглия в основном отвечает за клиренс Aβ-мишени и имеет тенденцию преимущественно агрегироваться вокруг зоны отложения Aβ 42, таким образом дополнительно предотвращая накопление Aβ 42 за счет фагоцитоза [47, 48]. Результаты показали, что эффекты фагоцитоза нагруженных куркумином клеток RAW 264.7, обработанных НЧ CS-BSA (фенотип M1), на Aβ 42 были увеличены и что накопление и отложение Aβ 42 были уменьшены, что может облегчить развитие AD. / P>

Микроглия (фенотип M1) высвобождает потенциально нейротоксические растворимые факторы и провоспалительные цитокины, такие как TNF-α и IL-6, что приводит к гибели нейронов и усугубляет развитие AD [49]. Обнаружено, что поляризация макрофагов M1 зависит от активации сигнального пути TLR4-MAPK / NF-κB и что блокирование сигнального пути TLR4-MAPK / NF-κB может ингибировать поляризацию макрофагов M1 и способствовать поляризации макрофагов от типа M1. к типу М2 [50]. Наши результаты показали, что куркумин, входящий в состав индийской специи, куркумы (Curcumin longa) - разновидности имбиря - был мощным противовоспалительным средством, которое могло уменьшить воспаление и даже могло играть роль в лечении AD. НЧ CS-BSA служили мощным инструментом для эффективного проникновения куркумина, нацеленного на BBB. По сравнению со свободным куркумином, нагруженные куркумином НЧ CS-BSA индуцировали эффекты фагоцитоза, и большее количество Aβ 42 фагоцитировалось клетками RAW 264.7. Кроме того, нагруженные куркумином НЧ CS-BSA индуцировали более низкие уровни экспрессии белка TNF-α, IL-6 и TLR4, чем свободный куркумин, а также ингибировалось фосфорилирование ERK, JNK, p38 и NF-κB. Он показал, что нагруженные куркумином НЧ CS-BSA могут усиливать индуцированный куркумином фагоцитоз макрофагов, ингибируя поляризацию макрофагов M1 за счет блокирования сигнального пути TLR4-MAPK / NF-κB, тем самым способствуя противовоспалительному и нейрозащитному действию куркумина.

Заключение

Наши данные свидетельствуют о том, что куркумин можно использовать в качестве терапевтического средства при лечении БА. Нагруженные куркумином НЧ CS-BSA запускали индуцированный клетками RAW 264.7 фагоцитоз Aβ 42 за счет усиленного проникновения куркумина через ГЭБ и более высокой внутриклеточной концентрации лекарственного средства. Кроме того, нагруженные куркумином НЧ CS-BSA индуцировали противовоспалительные и нейропротекторные эффекты, ингибируя поляризацию макрофагов M1 и блокируя сигнальный путь TLR4-MAPK / NF-κB. Взятые вместе, нагруженные куркумином НЧ CS-BSA продемонстрировали свой потенциал в улучшении лечения БА.

Сокращения

AD:

Болезнь Альцгеймера

BBB:

Гематоэнцефалический барьер

BSA:

Бычий сывороточный альбумин

CS:

Хитозан

LPS:

Липополисахарид

НП:

Наночастицы

TLR:

Толл-подобные рецепторы