Ультра-чувствительное колориметрическое обнаружение туберкулеза с использованием комплексов антиген ESAT-6/антитело и золотых наночастиц

Аннотация

Туберкулез (ТБ) остается ведущей причиной смертности во всем мире, движимый вирулентным фактором ESAT-6, ранним секреторным антигенным мишенью Mycobacterium tuberculosis. Быстрое обнаружение ESAT-6 в низких концентрациях необходимо для ранней интервенции и сдерживания болезни. Мы представляем одностадийный антителозависимый колориметрический анализ, использующий 15 нм золотые наночастицы (GNP) и механизм агрегации, индуцированный солью, для достижения предела обнаружения 1,25 пМ. Метод эксплуатирует красный спектральный сдвиг дисперсных GNP при наличии комплекса ESAT-6/антитело, сохраняя стабильность в присутствии неспецифических белков, таких как 10-кДа культурно-фильтрационный белок (CFP-10). Оптимальная концентрация антитела определена как 60 нМ; превышение этого порога вызывало 680-кратную потерю чувствительности стерическим переполнением. Этот анализ демонстрирует высокую специфичность, минимальный биофоулинг и предлагает быстрый визуальный реаут, подходящий для точечной диагностики ТБ.

Преамбула

ТБ вызывается Mycobacterium tuberculosis и представляет серьезную угрозу глобальному здоровью. Ранняя латентная инфекция может прогрессировать в активную болезнь, когда иммунитет хозяина ослабевает, подчеркивая необходимость чувствительной, быстрой диагностики на латентной стадии. Конвенциональные тесты — кожный туберкулиновый тест, интерферон-гамма тесты выделения, рентген грудной клетки, цитология мокроты и культура — трудоемки, дороги и часто задерживаются на месяцы. Таким образом, простая, доступная и быстрая стратегия обнаружения срочно требуется.

Колориметрические сенсоры на основе золотых наночастиц (GNP) выступили мощными инструментами для диагностики заболеваний благодаря их сильному поверхностному плазмонному резонансу и настраиваемым оптическим свойствам. Монодисперсные 15 нм GNP демонстрируют характерный красный оттенок, сдвигающийся к синему при агрегации, запускаемой двухвалентными ионами, такими как NaCl. Этот цветовой изменение, движимое красным спектральным сдвигом, лежит в основе многих быстрых анализов обнаружения вирусов, бактерий и малых молекул. Однако производительность ДНК или аptaмер-основанных GNP анализов может быть ограничена электростатическими взаимодействиями и несовместимостью зонд-мишеней, особенно с более длинными нуклеиновыми последовательностями.

Для преодоления этих вызовов мы разработали одностадийный антителозависимый колориметрический анализ, нацеленный на 6 кДа белок ESAT-6. Предварительное комплексирование ESAT-6 с его специфическим поликлональным антителом перед экспозицией к GNP предотвращает неспецифическое связывание и позволяет высокочувствительную визуальную платформу обнаружения. Рисунок 1 иллюстрирует рабочий процесс анализа и контроль специфичности с использованием CFP-10.

Схематическое представление одностадийного предварительно комплексированного антителозависимого колориметрического анализа. а Антитело предварительно комплексировано с ESAT-6. б Антитело предварительно комплексировано с CFP-10 (негативный контроль).

Методы

Реактивы и биомолекулы

ESAT-6 и 10-кДа CFP-10 приобрели у Sino Biological Inc. (Пекин, Китай). Поликлональное анти-ESAT-6 антитело получено от Santa Cruz Biotechnology (США). 15 нм цитрат-стабилизированные GNP приобрели у Sigma Aldrich (США). Все реактивы использовались без дополнительной очистки.

Оптимизация двухвалентных ионов для агрегации GNP

Для определения оптимальной концентрации NaCl для индуцирования агрегации GNP, диапазон NaCl (50–800 мМ) добавляли к фиксированному объему GNP (1 O.D.). Через 15 мин записывали цветовое изменение и измеряли абсорбционный спектр (400–800 нм) с помощью нанофотометра.

Оценка биофоулинга ESAT-6 на поверхности GNP

Для оценки неспецифической адсорбции ESAT-6 на GNP, вариации концентраций (1,5–100 нМ) инкубировали с GNP, затем добавляли оптимальный NaCl. Наблюдали колориметрические и спектральные изменения. CFP-10 использовали для подтверждения специфичности.

Оптимизация концентрации анти-ESAT-6 антитела на поверхности GNP

Концентрации анти-ESAT-6 антитела (30–500 нМ) смешивали с GNP, инкубировали 30 мин и вызывали возрастающим NaCl для идентификации уровня антитела, максимизирующего дисперсную стабильность.

Обнаружение ESAT-6 через антителозависимый колориметрический красный спектральный сдвиг

1 мкл 1 мкМ ESAT-6 (финальная 500 нМ) смешивали с 1 мкл оптимизированной концентрации антитела. После 30 мин добавляли 20 мкл GNP и инкубировали еще 30 мин. Затем добавляли NaCl до финальной концентрации 800 мМ и записывали абсорбционный спектр (400–800 нм). Серийное разведение ESAT-6 (0–500 нМ) использовали для определения предела обнаружения, охватывая пикомолярные до наномолярных диапазонов.

Результаты и обсуждение

Анализ использует красный спектральный сдвиг, возникающий при агрегации GNP в присутствии комплекса ESAT-6/антитело. В отсутствие ESAT-6 антитело покрывает поверхность GNP, сохраняя красный оттенок даже после добавления NaCl, тогда как присутствие ESAT-6 запускает агрегацию и синий сдвиг.

Оптимизация NaCl

GNP оставались красными при концентрациях NaCl ниже 100 мМ, но начинали агрегироваться при 100 мМ, производя красный спектральный сдвиг, центрированный около ~600 нм. Для максимальной чувствительности выбирали 800 мМ NaCl для обеспечения полной агрегации в отсутствие антителового покрытия.

Оптимизация концентрации NaCl для агрегации GNP. (а) Спектральные изменения (400–800 нм) и (б) визуальные фотографии, иллюстрирующие переход от красного к синему при 100 мМ NaCl.

Оптимизация концентрации антитела

При 30 нМ антитела GNP все равно агрегировались даже с 800 мМ NaCl, указывая на недостаточное покрытие поверхности. Начиная с 60 нМ GNP сохраняли красный цвет под той же солевой нагрузкой, демонстрируя эффективную дисперсию. Концентрации выше 60 нМ не давали дополнительной выгоды и рисковали стерическим переполнением антител.

Оптимизация антитела и стабильность GNP. (а) Тренд агрегации/дисперсии по концентрациям антитела (0–500 нМ). (б) Стабильность 60 нМ антитело-GNP конъюгатов против увеличивающегося NaCl (0,012–1000 мМ). (в) Соответствующие абсорбционные спектры.

Обнаружение ESAT-6 и валидация биофоулинга

ESAT-6 (до 100 нМ) не связывался с GNP, предотвращая ложноположительные/ложноотрицательные результаты. Когда предварительно комплексирован с 60 нМ антителом, анализ демонстрировал явный цветовой сдвиг от красного к синему при всего 0,5 нМ ESAT-6, с полным насыщением между 15–500 нМ. Спектры подтверждали красный сдвиг к 600 нм при концентрациях выше 1,25 пМ.

Оценка фоулинга ESAT-6. GNP оставались стабильными до 100 нМ ESAT-6, подтверждая минимальную неспецифическую адсорбцию.

Обнаружение ESAT-6 по концентрациям. (а) Визуальный реаут от 0,5 нМ до 500 нМ. (б) Спектральные сдвиги (400–800 нм), указывающие красный сдвиг при >1,25 пМ.

Предел обнаружения

Титруя ESAT-6 от 1,25 пМ до 5 нМ, анализ сохранял явное синее цветовое изменение и спектральный сдвиг к ~600 нм. Предел обнаружения (LOD) установлен на 1,25 пМ, превосходя многие существующие колориметрические ТБ диагностики.

Оценка LOD. (а) Визуальная прогрессия от 1,25 пМ до 5 нМ. (б) Соответствующие абсорбционные спектры, демонстрирующие красный сдвиг.

Подтверждение специфичности

Используя 75 нМ антитела, LOD увеличивался до наномолярного диапазона, подтверждая критическую роль концентрации антитела. CFP-10, несмотря на то, что является ТБ антигеном, не запускал агрегацию, валидируя специфичность анализа.

Тестирование специфичности с 75 нМ антителом. (а) Цветовое изменение при вариации концентраций ESAT-6. (б) Негативный контроль с использованием CFP-10.

Заключение

Это исследование демонстрирует быстрый одностадийный колориметрический анализ на основе золотых наночастиц, достигающий 1,25 пМ предела обнаружения для ТБ антигена ESAT-6. Высокая специфичность метода, подтвержденная контролями CFP-10, и его опирание на предварительно комплексированные антител/антиген уменьшают биофоулинг и повышают чувствительность. Простота анализа, визуальный реаут и минимальные требования к оборудованию делают его сильным кандидатом для точечной скрининговой диагностики ТБ, особенно в ресурсно-ограниченных условиях. Будущая работа изучит расширение этой платформы на другие малые белковые биомаркеры и интеграцию в портативные диагностические приборы.

Аббревиатуры

CFP-10:

10 кДа культурно-фильтрационный белок

DNA:

Дезоксирибонуклеиновая кислота

ESAT-6:

6 кДа ранний секреторный антигенная мишень

GNP:

Золотые наночастицы

NaCl:

Хлорид натрия

O.D.:

Одна оптическая плотность (единица концентрации GNP)

RNA:

Рибонуклеиновая кислота

TB:

Туберкулез

UV:

Ультрафиолет