Взаимодействие золотых наночастиц с лекарственными препаратами вызывает острое поражение почек у мышей: исследование размерозависимой токсичности

Аннотация

Наноматериалы — инновационные материалы со множеством полезных свойств, однако существует озабоченность по поводу их неизвестных эффектов на живые организмы. Золотые наночастицы широко применяются в промышленности благодаря своим выдающимся характеристикам. Потенциальные биологические опасности золотых наночастиц остаются недостаточно изученными, поэтому в данном работе мы исследовали in vivo эффекты золотых наночастиц диаметром 10, 50 и 100 нм (GnP10, GnP50 и GnP100 соответственно) и их взаимодействие с лекарственными препаратами на мышах для оценки безопасности в млекопитающих.

Цисплатин, паракват и 5-аминосалициловая кислота вызывают побочные повреждения печени и почек у мышей. Гепатотоксичность или нефротоксичность не наблюдались при введении любых золотых наночастиц в отдельности через хвостовую вену. В то же время совместное введение GnP10 с цисплатином, паракватом или 5-аминосалициловой кислотой вызывало поражение почек. Это указывает на то, что золотые наночастицы размером 10 нм потенциально нефротоксичны из-за взаимодействия с лекарственными препаратами.

Введение

Нанотехнологии играют всё более важную роль в XXI веке, а наноматериалы лежат в основе прогресса в этой области. Последние достижения в производстве наночастиц способствовали всемирному применению инновационных наноматериалов [1, 2]. Наноматериалы имеют диаметр 100 нм и менее; к примерам относятся золотые, серебряные, кремнезные, платиновые и диоксид титана наночастицы, а также фуллерены и углеродные нанотрубки [3, 4]. Эти материалы находят применение в технологиях электронного хранения, генной/регенеративной медицине и электронных приборах, становясь фундаментом новых отраслей XXI века [5]. Однако наночастицы, такие как PM2.5, вызывают серьезное загрязнение окружающей среды, респираторные заболевания (астма) и ишемическую болезнь сердца [6]. Кроме того, дизельные частицы, выделяемые автомобилями, могут оказывать биологическое воздействие, проникая в мозг и репродуктивные органы [7], волокнистые мелкодисперсные частицы (асбест) индуцируют мезотелиому, а промышленные волокнистые наноматериалы, такие как углеродные нанотрубки, могут негативно влиять на здоровье человека [8, 9]. Таким образом, многие аспекты биологического воздействия наночастиц остаются неизвестными.

Золото (Au) обладает низкой ионизационной способностью и высокой стабильностью, с древности использоваясь как благородный металл для декоративных целей. Недавно разработанные золотые наночастицы широко применяются в медицине и инженерии благодаря своим характерным оптическим свойствам [10, 11], а их выдающиеся оптоэлектронные свойства привели к использованию в органических солнечных элементах, сенсорных зондах и проводимых материалах [12, 13]. В химической промышленности золотые наночастицы служат катализаторами синтеза акриловой смолы. Они также проявляют превосходную каталитическую активность при низких температурах при окислении CO по сравнению с платиновыми наночастицами, что позволяет использовать их как катализаторы для очистки выхлопных газов. Дальнейшее расширение применения золотых наночастиц ожидается в будущем, однако исследования их токсичности и потенциального взаимодействия с лекарственными препаратами остаются недостаточными.

Область нанотехнологий расширяется по мере изучения безопасности, фармакологии и фармакокинетики наночастиц. Показано, что кремнезные наночастицы вызывают цитотоксичность, гепатотоксичность и повреждение плаценты [14, 15], а углеродные нанотрубки могут индуцировать легочную мезотелиому [16]. Однако мало известно о фармакологических эффектах, возникающих при взаимодействии наночастиц с лекарственными препаратами. В данном исследовании мы изучили токсичность золотых частиц диаметром 10, 50 и 100 нм (GnP10, GnP50 и GnP100) на мышах для оценки их безопасности в млекопитающих. Кроме того, мы исследовали влияние этих наночастиц на токсичность параквата (PQ, известного гепато- и нефротоксина) [17], цисплатина (CDDP, широко применяемого противоопухолевого средства) [18, 19] и 5-аминосалициловой кислоты (5-ASA, распространенного противовоспалительного препарата) [20].

Результаты и обсуждение

Сначала мы измерили размеры золотых наночастиц с помощью дзета-сайзера, а затем визуализировали их с помощью передаточной электронной микроскопии (рис. 1a, b, c). Средние диаметры наночастиц GnP10, GnP50 и GnP100 составили 15,7 ± 7,0; 53,3 ± 14,2 и 97,0 ± 27,1 нм соответственно (дополнительная фиг. 1). Кроме того, золотые наночастицы аггломерируются при измерении электронной микроскопией, но не аггломерируются при введении мышам. Мы также измерили концентрацию ионов золота методом ICP-MS, но ионы не были обнаружены (данные не показаны). Поверхность золотых наночастиц была модифицирована лимонной кислотой для повышения гидрофильности, однако эта модификация не обладала другой функциональностью.

Ультразструктуры золотых наночастиц. Электронные микрографии наночастиц GnP10 (a), GnP50 (b) и GnP100 (c)

Мы оценивали гепато- и нефротоксичность GnP, вводя максимальную дозу 4 мг/кг мышам через хвостовую вену. При введении золотых наночастиц в отдельности гепатотоксичность и нефротоксичность не наблюдались (рис. 2). Уровни АЛТ и АСТ у мышей, получивших GnP10, 50 и 100 в отдельности (рис. 2a, b), не отличались от контрольных значений, как и уровни мочевины и креатинина. Одноразовое введение GnP не вызывало повреждений печени, почек, сердца, легких или селезенки (дополнительная фиг. 2), что свидетельствует о нетоксичности золотых наночастиц при отдельном введении мышам.

Влияние золотых наночастиц на токсичность, индуцируемую цисплатином. Мышам внутрибрюшинно вводили цисплатин (CDDP) в дозе 0 (открытые столбики) или 100 мкмоль/кг (закрашенные столбики) вместе с внутривенным введением транспортного средства или золотых наночастиц (4 мг/кг). Через 24 часа после введения определяли уровень печеночных ферментов — аланинаминотрансферазы (АЛТ; панель a) и аспартатаминотрансферазы (АСТ; панель b) в сыворотке, а также уровня мочевины (BUN; панель c) и креатинина (Cr; панель d) в плазме с помощью коммерческих наборов (см. раздел «Биохимические анализы»). Данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM; n = 4). Значимые различия (*P < 0,05, **P < 0,01) между группами, получившими транспортное средство и CDDP

Известно, что совместное введение кремнезных наночастиц, наноглин или полистироловых наночастиц с лекарственными препаратами или химикатами вызывает повреждение печени и почек [14, 21, 22]. Поэтому мы проводили совместное введение золотых наночастиц с PQ (гепато- и нефротоксином) или препаратами CDDP или 5-ASA (вызывающими побочные гепато- и нефротоксические эффекты). Рис. 2 показывает результаты взаимодействия золотых наночастиц с CDDP. Совместное введение GnP10 или GnP50 с CDDP повышало уровень АЛТ и вызывало повреждение печени (рис. 2a), а совместное введение GnP10 с CDDP повышало BUN и креатинин, индуцируя поражение почек (рис. 2c, d). Затем мы исследовали взаимодействие GnP с 5-ASA — широко используемым противовоспалительным препаратом, вызывающим повреждение печени и почек. Совместное введение GnP10 или GnP50 с CDDP повышало АЛТ и вызывало повреждение печени (рис. 3a), тогда как совместное введение с 5-ASA повышало BUN и креатинин, вызывая поражение почек (рис. 3c, d). Далее мы изучили взаимодействие GnP с PQ — широко применяемым агрохимикатом, вызывающим повреждение печени и почек. Совместное введение GnP10 и PQ повышало уровни BUN и креатинина, индуцируя поражение почек (рис. 4c, d), но не повреждение печени (рис. 4a, b). Совместное введение самых мелких исследуемых частиц — GnP10 — с CDDP, 5-ASA или PQ приводило к наивысшим значениям АЛТ, BUN и креатинина в данном исследовании. В 10 раз более крупные частицы GnP100 не вызывали повреждения печени или почек при совместном введении с CDDP, 5-ASA или PQ. Эти результаты показывают, что GnP проявляет токсичность при совместном введении частиц диаметром менее 100 нм с CDDP, 5-ASA или PQ.

Влияние золотых наночастиц на токсичность, индуцируемую 5-аминосалициловой кислотой. Мышам внутрибрюшинно вводили 5-аминосалициловую кислоту (5-ASA) в дозе 0 (открытые столбики) или 500 мг/кг (закрашенные столбики) вместе с внутривенным введением транспортного средства или золотых наночастиц (4 мг/кг). Через 24 часа определяли уровни АЛТ (a), АСТ (b), BUN (c) и креатинина (d) коммерческими наборами. Данные: среднее ± SEM (n = 4). Значимые различия (*P < 0,05, **P < 0,01) между группами транспортного средства и 5-ASA

Влияние золотых наночастиц на токсичность, индуцируемую паракватом. Мышам внутрибрюшинно вводили паракват (PQ) в дозе 0 (открытые столбики) или 50 мг/кг (закрашенные столбики) вместе с внутривенным введением транспортного средства или золотых наночастиц (4 мг/кг). Через 24 часа определяли уровни АЛТ (a), АСТ (b), BUN (c) и креатинина (d) коммерческими наборами. Данные: среднее ± SEM (n = 4). Значимые различия (*P < 0,05, **P < 0,01) между группами транспортного средства и PQ

Гистологическое исследование почек после совместного введения GnP10 с CDDP, 5-ASA или PQ (рис. 5) выявило повреждение канальцев, что указывает на индукцию острой почки. Далее мы измерили IL-6 и TNF-α в сыворотке для выявления причины острой почечной поврежденности, индуцируемой GnP10. Рис. 6 показывает уровни IL-6 в сыворотке через 3 часа после совместного введения GnP10 с CDDP, 5-ASA или PQ. IL-6 не обнаруживалась в группе, получившей только GnP10, но повышалась при совместном введении GnP10 с CDDP, 5-ASA или PQ. TNF-α не обнаруживалась ни в одной группе (данные не показаны). Эти результаты указывают на вовлечение IL-6 в острое почечное повреждение, индуцируемое GnP10 в сочетании с CDDP, 5-ASA или PQ.

Гистологический анализ тканей почек мышей, получивших золотые наночастицы. Через 24 часа после внутривенного введения только GnP10 (a), GnP10 с CDDP (b), GnP10 с 5-ASA (c) и GnP10 с PQ (d) ткани собирали, фиксировали в 4% параформальдегиде, делали срезы и окрашивали гемоксилином и эозином. Стрелками обозначены участки поражения почек

Уровни IL-6 в сыворотке, измеренные методом ЭЛИСА. Мышам внутривенно вводили GnP10 с CDDP, 5-ASA или PQ. Уровни цитокинов измеряли через 3 часа после введения. Значения: среднее ± стандартная ошибка (SE; n = 4)

Мы изучали влияние совместного введения золотых наночастиц и препаратов на побочные эффекты (повреждение печени и почек). Наименьшие частицы — GnP10 — индуцировали повреждение почек и печени при совместном введении с CDDP, 5-ASA или PQ. Мы также проводили совместное введение GnP10 с парацетамолом, стрептомицином или тетрациклином у мышей и не наблюдали повреждения печени или почек (данные не показаны). Ранее мы сообщали, что кремнезные наночастицы индуцируют повреждение печени в зависимости от размера частиц [23], а полистироловые наночастицы могут вызывать повреждение печени при совместном введении с препаратом, также в зависимости от размера [24]. Xia и соавт. показывали, что более мелкие золотые наночастицы более генотоксичны in vitro [25]. В совокупности это свидетельствует о том, что золотые наночастицы становятся высокотоксичными при взаимодействии с лекарственными препаратами по мере уменьшения размера частиц.

Совместное введение GnP10 с цисплатином, 5-ASA или PQ повышало уровень IL-6 (рис. 6). Введение только GnP10 (рис. 6) или только CDDP, PQ или 5-ASA (данные не показаны) не повышало IL-6. Ранее сообщалось, что IL-6 участвует в индукции повреждения печени [26] и острой почки [27, 28]. Мы полагаем, что GnP10 индуцирует IL-6, который, в свою очередь, вызывает повреждение печени и почек, однако базовый механизм остается неясным. Bauza и соавт. сообщали, что IL-6 индуцирует повреждение печени через активацию транскрипционных факторов в гепатоцитах [29]. Понимание вовлечения клеточно-специфических транскрипционных факторов в повреждение печени и почек, индуцируемое IL-6, потребует дальнейших экспериментов по механизму цитотоксичности золотых наночастиц.

Недавно золотые наночастицы привлекли внимание как функциональные биоматериалы для систем доставки лекарств [30], и активно ведутся исследования лечения рака с их использованием. Например, Anselmo и соавт. сообщали, что PEG-покрытые кремнезо-золотые наночастицы повышают локальную температуру при поглощении света и термически растворяют твердые опухоли [31], что демонстрирует перспективность золотых наночастиц для лечения рака. Однако мы обнаружили, что взаимодействие противоопухолевого препарата цисплатина с золотыми наночастицами индуцирует поражение почек (рис. 2), что указывает на необходимость изучения безопасности их совместного применения при лечении рака.

Заключение

Подводя итог: GnP10 вызывало повреждение почек при совместном введении с CDDP, PQ или 5-ASA. GnP50 вызывало повреждение почек только при совместном введении с 5-ASA, тогда как GnP100 не вызывало повреждений. Мы продемонстрировали, что золотые наночастицы могут вызывать повреждение почек, и этот эффект может быть синергически усилен в результате взаимодействия с химикатами или лекарственными препаратами. Дальнейшие исследования на основе этих данных потребуются для полного выяснения токсикологических профилей наночастиц, предлагаемых для диагностического или терапевтического применения.

Материалы и методы

Материалы

Суспензии золотых частиц диаметром 10, 50 и 100 нм, стабилизированные цитратом, получены от NANOCOMPOSIX, INC. (Сан-Диего, США). Распределение размеров частиц анализировали с помощью дзета-сайзера (Sysmex Co., Кобэ, Япония) и передаточного электронного микроскопа TEM JEOL JEM-1011. Средние диаметры составили 15,7 ± 7,0; 53,3 ± 14,2 и 87,0 ± 27,1 нм (рис. 1, доп. фиг. 1). Водные суспензии (1 мг/мл) тщательно диспергировали ультразвуком перед использованием и разбавляли водой. Наличие ионизированного золота в суспензиях проверяли методом ICP-MS — ионизированное золото не обнаруживалось. Для каждого эксперимента вводили одинаковые объемы каждой суспензии. Геометрические размеры частиц характеризовали методом TEM. Паракват (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, США), цисплатин и 5-аминосалициловая кислота (Wako Pure Chemical Industries, Осака, Япония) растворяли в физрастворе и хранили при −20 °C до использования. Все реактивы были исследовательского уровня чистоты.

Животные

8-недельные самцы мышей линии BALB/c приобрели у Funabashi Farm Co., Ltd. (Тиба, Япония). Животных содержали в контролируемых условиях (температура 23 ± 1,5 °C; световой режим 12 ч свет/12 ч темнота) со свободным доступом к стандартному корму и воде. Перед началом экспериментов мышам давали неделю на акклиматизацию. Экспериментальные протоколы соответствовали этическим рекомендациям Тейкё Хейсей Университета, составленным на основе Руководства по экспериментам на животных Японской ассоциации лабораторных животных.

Биохимические анализы

Активность аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) в сыворотке, уровень мочевины (BUN) и креатинина (Cr) в плазме определяли коммерческими наборами (Wako Pure Chemical Industries) согласно протоколу производителя. Кратко: собранную сыворотку (10 мкл) смешивали с 1 мкл реактива цвета А (содержащего уреазу) и инкубировали при 37 °C в течение 15 мин. После добавления 1 мкл реактива цвета В инкубировали при 37 °C в течение 10 мин. Абсорбцию измеряли на длине волны 570 нм. Интерлейкин (IL)-6 и TNF-α анализировали с помощью наборов для иммуноферментного анализа (ELISA) (BioSource International, CA, США). Все анализы проводили в строгом соответствии с инструкциями производителя.

Гистологический анализ

Через 24 часа после введения дозы животных усыпляли, извлекали печени и фиксировали в 4% параформальдегиде. После обработки и подготовки тонких срезов окрашивали их гемоксилином и эозином для гистологического исследования.

Статистический анализ

Статистическую обработку данных выполняли с надстройкой Statcel, 3rd Excel Software (EMS publication Co., Ltd., Сайтама, Япония). Все данные представлены как среднее ± стандартная ошибка среднего (SEM). Значимость различий между контрольной и экспериментальными группами определяли по тесту Даннета; различия считались значимыми при P < 0,05.

Доступность данных и материалов

Не применимо.

Аббревиатуры

ALT:

Аланинаминотрансфераза

AST:

Аспартатаминотрансфераза

BUN:

Мочевина

PQ:

Паракват

Cr:

Креатинин