Нацеленные наночастицы куркумина, активируемые фокусированным ультразвуком низкой интенсивности, для pH-реагирующей тераностики рака яичника

Аннотация

Разработана простая и универсальная наноплатформа на основе pH-чувствительных ферритиновых наноклеток, со-загруженных антиопухолевым препаратом куркумин (Cur) и жидким фторуглеродом перфторгексаном (PFH) в ядре, с фолиевой кислотой (FA) на оболочке для таргетирования (FA-FCP). Синтезированные FA-FCP имеют средний диаметр 47 нм, стабильные физико-химические свойства в разных средах, высокую биосовместимость и безопасность in vitro и in vivo. При pH 5,0 и воздействии фокусированного ультразвука низкой интенсивности (LIFU) за 24 ч высвобождается 53,2% препарата. После 4-минутного LIFU (7 Вт) при pH 5,0 FA-FCP обеспечивают контрастное ультразвуковое изображение. Благодаря рецептор-опосредованной эндоцитозе FA FA-FCP эффективно проникают в клетки и локализуются в лизосомах. Через 18 ч после инъекции FA-FCP опухоль стимулировали LIFU, получив контрастное УЗ-изображение. In vivo и in vitro эксперименты подтвердили значительный терапевтический эффект комбинации FA-FCP и LIFU. Вывод: FA-FCP при сочетании с внешним LIFU и эндогенной кислой средой обладает мощными тераностическими функциями, открывая неинвазивный интегрированный подход к диагностике и лечению опухолей.

Введение

Рак яичника — высокометастазирующее и летальное заболевание с высокой смертностью [1, 2]. Из-за неясных ранних симптомов при диагностике у большинства пациентов опухоль уже высокометастазировала [3]. Стандартное лечение — цitoreдуктивная операция и химиотерапия, 5-летняя выживаемость на поздних стадиях очень низка [4]. Срочно нужны новые стратегии диагностики и лечения для повышения выживаемости. Наноплатформы, объединяющие таргетированную терапию и визуализацию, предлагают альтернативу [5–7].

В последние годы акустически-реагирующие наноплатформы (ARN) широко применяются в онкологии [8, 9]. ARN проектируют как микропузыри (MB) или наночастицы (NP) [10–12]. NP превосходят MB: меньший размер, выше проницаемость, дольше фармакокинетика, лучшая стабильность, легче модификация поверхности [13]. Для акустической реагируемости используют фторуглероды: перфторпентан (PFP), перфторгексан (PFH), перфтороктилбромид (PFOB) [14–19]. Под воздействием фокусированного ультразвука они переходят в газ (акустическая кавитация), усиливая УЗ-контраст. PFP (кип. 29,2 °C) легко газифицируется в организме, риск газовой эмболии; PFOB (кип. 144 °C) требует ультразвука сверхвысокой интенсивности. PFH (кип. 56 °C) — идеальный материал фазового перехода. Однако PFH гидрофобен, его инкапсулируют в наночастицы для водорастворимости. Различные носители: липосомы, PLGA, мезопористые органические материалы, полимеры [20–24]. Они также загружают антиопухолевые препараты для химиотерапии и акустически-контролируемого высвобождения [16, 19]. Несмотря на хорошие тераностические возможности, биосовместимость носителей вызывает опасения для клинического перевода. Железо-свободные ферритиновые наноклетки — эндоогенные белки с высокой pH-чувствительностью [25–27]: они распадаются в кислой среде и собираются в щелочной, обеспечивая биосовместимость и контролируемую загрузку/высвобождение.

В работе ферритин использован как носитель для PFH и куркумина (Cur), на поверхности ковалентно иммобилизирована фолиевая кислота (FA) — получен мультифункциональный FA-FCP. Куркумин — натуральный полифенол из куркумы с антиопухолевым действием, но плохой водорастворимостью [28–31]. FA-FCP решает проблему растворимости PFH и Cur, обладает высокой физиологической стабильностью, биосовместимостью и безопасностью. При LIFU и pH 5,0 за 24 ч высвобождается 53,2% Cur. После 4 мин LIFU (7 Вт) при pH 5,0 — контрастное УЗ-изображение. Благодаря FA-рецепторной эндоцитозе FA-FCP проникают в клетки и попадают в лизосомы. Через 18 ч после инъекции при LIFU стимуляции опухоль дает контрастное УЗ-изображение. In vivo и in vitro подтвержден значительный антиопухолевой эффект. Неинвазивность, лиганд-рецепторное таргетирование, LIFU-индуцированный фазовый переход и точное высвобождение делают FA-FCP перспективной тераностической наноплатформой.

Материалы и методы

Материалы

Ферритин (FRT), фолиевая кислота (FA), перфторгексан (PFH) — Sigma (Сент-Луис, США). Куркумин (Cur) — Aladdin Industrial Corporation (Шанхай, Китай). NH₂-PEG₂₀₀₀-FA и NH₂-PEG₂₀₀₀-COOH — Xi'an Ruixi Biotechnology Co., Ltd (Китай). EDC и NHS — Thermo Fisher Scientific (Уолтам, США). CCK-8 — Dojindo Laboratories (Кумамото, Япония). DMEM, PBS, пенициллин-стрептомицин, трипсин-EDTA, фетовый сывороточный белок (FBS) — Gibco (Гранд-Айленд, США).

Подготовка FA-FCP

10 мг FRT растворили в 10 мл воды. 10 мг Cur — в 0,3 мл DMSO. Смешали с 1 мл PFH при pH 5,0 и 30-минутной ультразвуковой обработке в ледяной бане. pH смеси скорректировали до 7,4 — получен Cur и PFH загруженный FRT (FCP). Второе: таргетирующая молекула FA ковалентно конъюгировали с FCP карбодиимидным методом [8]. К FCP добавили 5 мг NH₂-PEG₂₀₀₀-FA с EDC (5 мг/мл) и NHS (20 мг/мл). 3 ч при комнатной температуре с легким перемешиванием. Диализ против дистиллированной воды (MWCO 12 кДа) 24 ч — получен FA-конъюгированный FCP (FA-FCP). Загрузка Cur определена УФ-спектрофотометром при 426 нм: (Aₐ−A_b)/A_c, где Aₐ, A_b, A_c — массы FA-FCP, FA-FP, FA-FP соответственно.

Характеризация

Размер и дзета-потенциал — Zeta Sizer (Malvern, NanoZS, UK). Морфология — ТЭМ (Hitachi, Япония) и АСМ (Agilent 5500LS, США). Клеточный захват — конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (LEXT OLS4100, Olympus, Япония) и потоковая цитометрия (BD, США). Абсорбционные спектры — УФ-спектрофотометр UV1800 (Shimadzu, Япония).

Клеточная культура и животная модель

Линия человеческого рака яичника SK-OV-3 — Shanghai Institute of Cell Biology, CAS. Культура: DMEM + 10% FBS + 1% пенициллин-стрептомицин, 5% CO₂, 37 °C.

Голые мыши Balb/c (самки, ~5 недель) — Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd (Пекин, Китай). Модель SK-OV-3: 1×10⁶ клеток субкутанно в правую спинную область. Все процедуры соответствуют руководству Sichuan Academy of Medical Sciences, одобрены Этический комитетом.

pH/LIFU-индуцированное высвобождение Cur

Раствор FA-FCP разделили на 4 части, загрузили в диализные мешки (MW 5000), диализировали в 10 мл PBS pH 5,0 и 7,4. Через 3 ч часть облучали LIFU (7 Вт, 5 мин, 50% duty cycle, пульсирующий режим). В заданные моменты забирали 1 мл диализата, восполняли равным объемом пустого раствора того же pH. Концентрацию Cur измеряли УФ-спектрометром.

ADV-свойства и УЗ-изображение FA-FCP

FA-FCP при pH 5,0 и 7,4 облучали LIFU мощностью 5, 6, 7 Вт в течение 3, 4, 5 мин в агарозном геле, УЗ-изображения регистрировали Esaote Mylab 90 (Италия), частота 5–12 МГц, механический индекс 0,06. Интенсивность УЗ-сигнала в области интереса анализировали ImageJ.

Таргетирующая способность FA-FCP

Для демонстрации таргетирования in vitro наночастицы маркировали FITC. 1 мг FITC в 1 мл DMSO смешали с FCP и FA-FCP на 30 мин с легкой агитацией. Диализ против деионизированной воды на ночь — удаление свободного FITC и DMSO. Клетки инкубировали 24 ч, затем добавили FITC-маркированные наночастицы на 3 ч. Промыли PBS (3 раза), окрасили DAPI (5 мин), LysoTracker Red (10 мин), фиксировали 4% параформальдегидом (15 мин). Конфокальная микроскопия. Флуоресцентные сигналы внутри клеток — потоковая цитометрия.

Кровообращение и аккумуляция в опухоли

Свободный Cur и FA-FCP (одинаковая концентрация Cur) внутривенно вводили нормальным мышам. Кровь забирали из орбитального сплетения в разные временные точки, лизировали в буфере лизиса. Концентрацию Cur в крови определяли УФ-спектрометром по абсорбционным спектрам, выражали в % введенной дозы на грамм ткани (ID%/g).

Содержание FA-FCP в опухоли — на мышах с опухолями. Через 0, 1, 6, 12, 18, 24 ч после инъекции собирали опухоли, взвешивали, давили акварегией 24 ч. Cur определяли УФ-спектрометром, ID%/g.

Антиопухолевая эффективность in vitro и in vivo

In vitro: клетки обрабатывали PBS, Cur, FA-FCP, FCP+LIFU, FA-FCP+LIFU (доза Cur 5 мг/кг) 3 ч, затем LIFU (5 мин, 7 Вт). Инкубация еще 21 ч. Жизнеспособность — CCK-8.

In vivo: мыши с опухолями рандомизировали в 5 групп (n=6), внутривенно: физраствор (контроль), свободный Cur, FA-FCP, FCP+LIFU, FA-FCP+LIFU. 24 дня лечения, мониторинг объема опухоли и массы тела каждые 3 дня. Объем = длина×ширина²/2. Относительный объем V/V₀ (V₀ — начальный).

Оценка биобезопасности

SK-OV-3 в 96-лунках (1×10⁴ клеток/лунка) 24 ч. Концентрации FA-FRT-PFH 0, 20, 40, 100, 200, 500 мкг/мл. 24 ч инкубации, затем DMEM + 10% CCK-8 20 мин. Абсорбция при 450 нм — Multimode Plate Reader (Thermo Scientific). Основные органы (сердце, печень, селезенка, легкие, почки) здоровых мышей через 25 суток после инъекции FA-FCP — гемоксилин-эозиновое окрашивание, световая микроскопия.

Статистический анализ

Данные — среднее ± SD. SPSS 22.0. Student's t-тест, p < 0,05 — значимая разница.

Результаты и обсуждение

Подготовка и характеристики FA-FCP

Схема 1 иллюстрирует синтез FA-FCP и применение в УЗ-визуализации и комбинированной УЗ-химиотерапии in vitro и in vivo. FA-FCP получен простой биосовместимой самосборкой. ТЭМ и АСМ (рис. 1a, вставка и доп. файл 1: рис. S1) — сферическая структура. DLS: средний диаметр ~47 нм, дзета-потенциал ~−37 мВ в воде (рис. 1a, b). Через 4 недели в воде, PBS, физрастворе, FBS размер стабилен (рис. 1c) — высокая физиологическая стабильность (PEG-покрытие и природа FRT [32]). УФ-Vis-NIR спектр FA-FCP показывает пик Cur, подтверждая наличие Cur. Загрузка Cur — 125,8 ± 2,1%.

Профиль высвобождения Cur (рис. 2). Без LIFU при pH 5,0 за 24 ч вышло ~30% Cur, при pH 7,4 — 5,3% (p<0,01). Под LIFU (7 Вт, 4 мин) высвобождение резко возрастает при обоих pH, но при pH 5,0 (50%) значительно выше. Это свойство идеально для микросреды опухоли. Причина: (1) FRT в кислоте распадается, открывая наноклетку для выхода Cur; (2) LIFU вызывает мгновенный фазовый переход PFH, Cur выходит через расширенную пористую оболочку.

In vitro ADV-эффект FA-FCP

FA-FCP облучали LIFU 5, 6, 7 Вт, 3–5 мин при pH 7,4 и 5,0 для оптимизации параметров. УЗ-интенсивность = ADV-эффект. По УЗ-изображениям (рис. 3a, b) и средним значениям серого (рис. 3c, d): при pH 7,4 ADV растет со временем/мощностью, пик при 7 Вт, 5 мин. При pH 5,0 пик при 7 Вт, 4 мин. Ниже 5 Вт, 3 мин — недостаточно пузырей; выше 7 Вт, 4 мин — большинство пузырей коллапсируют. Оптимум: 7 Вт, 4 мин при pH 5,0.

Таргетирующая способность FA-FCP

FITC-маркировка наночастиц. Флуоресцентная интенсивность FITC-FCP и FITC-FA-FCP при одинаковой концентрации не отличается (доп. файл 1: рис. S2) — разница в маркировке не влияет на захват. Конфокальные изображения и FCM (рис. 4a, b): FCP входит в клетки с захватом 19,5% (возможно, ферритиновые рецепторы). FA-FCP — 44,3% захвата. Предварительная инкубация с свободной FA снижает захват до 13,8%. FA-конъюгация значительно повышает захват через FA-рецепторную эндоцитозу.

Органелльная локализация: LysoTracker Red. На рис. 4c в цитоплазме яркие зеленый (FA-FCP) и красный (LysoTracker) сигналы, при наложении — интенсивный желтый, подтверждающий количеризацию FA-FCP в лизосомах (pH≈5,0), что благоприятствует высвобождению препарата в клетках.

Кровообращение и аккумуляция FA-FCP в опухоли

Полупериод выведения FA-FCP ~7,31 ч (в 8 раз выше свободного Cur) (рис. 5a) — благодаря PEG и инкапсуляции FRT [32, 33]. Удлиненный полупериод улучшает удержание препарата в кровотоке и аккумуляцию в опухоли. Динамика аккумуляции (рис. 5b): пик FA-FCP — 18 ч, свободного Cur — ~1 ч. FA-FCP показывает значительно более высокую аккумуляцию в опухоли, вероятно, за счет EPR-эффекта и FA-опосредованного активного таргетирования [34, 35].

In vivo УЗ-визуализация

Опухоли голых мышей в 4 группах (контроль+LIFU, FCP+LIFU, FA-FCP+LIFU, FA-FCP без LIFU) наблюдали УЗ с/без LIFU (7 Вт, 4 мин). На рис. 6a: в контрольной группе под LIFU нет УЗ-сигнала. Через 18 ч после инъекции в группе FA-FCP+LIFU внутри опухоли виден значительно более сильный УЗ-сигнал, чем в FCP+LIFU и FA-FCP без LIFU (рис. 6a, b). FA-FCP+LIFU усиливает УЗ-контраст опухоли.

In vitro и in vivo антиопухолевая терапия

In vitro цитотоксичность (CCK-8, рис. 7a): жизнеспособность клеток зависит от концентрации Cur. Без LIFU FA-FCP подавляет жизнеспособность сильнее свободного Cur при всех концентрациях — FA-таргетирование. FA-FCP+LIFU дает значимо более высокое подавление, чем FP+LIFU, FCP+LIFU, FA-FCP без LIFU — лучшая антиопухолевая эффективность. Причина: LIFU и кислая среда лизосомы индуцируют высвобождение препарата и кавитацию, плюс FA-таргетирование [36–38].

In vivo (рис. 7b–d): LIFU начинали через 18 ч после инъекции каждые 2 дня, всего 3 сеанса. Относительный объем опухоли в группе FA-FCP+LIFU через 24 дня значительно ниже контрольных, Cur, FA-FCP, FP+LIFU, FCP+LIFU. Масса опухоли в группах FA-FCP и FCP+LIFU ниже контроля и Cur, в FA-FCP+LIFU — еще ниже. Масса тела не менялась значимо (рис. 7d). Высокая эффективность FA-FCP+LIFU обусловлена таргетированной аккумуляцией в опухоли и акустически/pH-реагируемым высвобождением [39–41], а также задержанным очищением наночастиц из опухоли благодаря удлиненному полупериоду в крови [42].

In vitro и in vivo биосовместимость

Биосовместимость FA-FCP: CCK-8 и H&E окрашивание. Рис. 8a, b: жизнеспособность клеток при FA-FP и LIFU 0–8 Вт >90% — нет значимой цитотоксичности in vitro. Рис. 8c: H&E органов мышей группы FA-FCP+LIFU через 24 дня — нет гистологических изменений vs контроль. Высокая биосовместимость in vitro и in vivo.

Заключение

Создана мультифункциональная наноплатформа FA-FCP на основе ферритиновых наноклеток, загруженных антиопухолевым препаратом куркумином и таргетирующей молекулой фолиевой кислотой. FA-FCP обладает способностью к контрастному УЗ-изображению и точной таргетированной химиотерапии. Высокая биосовместимость in vitro и in vivo. Превосходная таргетирующая способность, акустически/pH-индуцируемое высвобождение Cur, акустически-реагирующий фазовый переход под LIFU для УЗ-визуализации. FA-FCP может служить мощным фактором подавления опухоли без системной токсичности. Ожидается, что такая биосовместимая тераностическая наноплатформа интегрирует УЗ-визуализацию с улучшенной терапевтической эффективностью, предлагая перспективную парадигму лечения рака.

Доступность данных и материалов

Выводы основаны на данных (основной текст и рисунки), представленных в работе.

Аббревиатуры

US:

Ультразвук

FA:

Фолиевая кислота

FRT:

Ферритин

PFH:

Перфторгексан

LIFU:

Фокусированный ультразвук низкой интенсивности

ADV:

Акустическая кавитация капли

FITC:

Флуоресцеин изотиоцианат

CCK-8:

Cell Counting Kit-8

FBS:

Фетовый сывороточный белок

EDC:

1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимид

NHS:

N-гидрокси숙цинимид

Cur:

Куркумин