Инженерные флуоресцентные полиэлектролитные микрокапсулы с квантовыми точками кодированием для передовых тераностических применений

Аннотация

Полиэлектролитные микрокапсулы выступают универсальными носителями для лекарств, агентов визуализации и наноматериалов. Здесь мы сообщаем о надежном маршруте фабрикации, включающем водорастворимые CdSe/ZnS квантовые точки (КТ), стабилизированные трифункциональным полиэтиленгликолем (PEG) лигандом, в полиэлектролитные оболочки. Полученные КТ-кодированные капсулы полностью охарактеризованы динамическим световым рассеянием, электрофоретной подвижностью, сканирующей электронной микроскопией и флуоресцентной/конфокальной микроскопией. Мы квантифицировали распределение размера, заряд поверхности, морфологию, оптические свойства и динамику времени жизни флуоресценции, и идентифицировали оптимальную загрузку КТ, максимизирующую яркость при сохранении структурной целостности. Наконец, мы продемонстрировали эффективную интернализацию капсул муриными макрофагами, подтверждая их пригодность для живой-клеточной визуализации и тераностических применений.

Введение

Нацеленная доставка и визуализация терапевтиков остаются центральными для трансляционной медицины. Полиэлектролитные микрокапсулы, собираемые слой-за-слоем депозицией противоположно заряженных полимеров, могут инкапсулировать лекарства, металлические наночастицы или флуоресцентные зонды, обеспечивая контролируемое высвобождение и отслеживание груза в реальном времени. Кодируя эти оболочки полупроводниковыми КТ, мы получаем агенты, одновременно доставляющие терапевтические полезные нагрузки и предоставляющие высококонтрастные, фотостабильные сигналы визуализации.

Слой-за-слоем (LbL) подход предлагает тонкий контроль над толщиной стенки, пористостью и поверхностной химией, делая его идеальным для стимуло-реактивных систем. КТ, с их широким поглощением и узкими полосами эмиссии, позволяют мультиплексное возбуждение от единственного источника света, превосходя обычные красители в яркости и фотостабильности.

Предыдущие работы кодировали полиэлектролитные капсулы органическими красителями или углеродными точками, но эти стратегии часто требовали сурового термического обращения или приводили к жестким, менее реактивным структурам. Наше исследование вводит более мягкий, водный метод переноса КТ, сохраняющий гибкость и реактивность капсул при доставке превосходной оптической производительности.

Экспериментальная часть

Растворимость и характеристика квантовых точек

CdSe/ZnS core/shell КТ (λmax = 590 нм) были предоставлены д-ром Pavel Samokhvalov (МЭФИ). Гидрофобные КТ сделаны водорастворимыми обменом лиганда: TOPO вытесняли d,l-цистеином, затем заменяли на HS-PEG12-COOH (Thermo Fisher). После последовательных промывок КТ диспергировали в 0,1 M NaOH, ультразвуковые, центрифугировали и фильтровали через 0,22 мкм мембрану. Концентрация КТ определялась спектрофотометрически на первом экситонном пике, и частицы стабилизировали добавлением HS-PEG12-COOH в молярном соотношении 1:4,6, за которым следовала 24–48 ч инкубация при 2–8 °C.

Синтез микрчастиц карбоната кальция

Карбонат кальция микросферы готовили смешиванием равно-молярных растворов Na₂CO₃ и CaCl₂ (0,33 M каждый) под контролируемым перемешиванием (250, 500, 750 об/мин). После 15–60 с смесь кавили, промывали MilliQ водой и сушили при 60 °C в течение 90 мин. Оптимальный размер частиц (4–6 мкм) и регулярная морфология достигались при 250 об/мин и 30 с перемешиванию, как подтверждено SEM (Рис. 1).

Подготовка полиэлектролитных микрокапсул, кодированных КТ

Ядра карбоната кальция сначала покрывали пятью парами слоев PAH/PSS (поли(аллиламин гидрохлорид) и поли(натрий 4-стиренсульфонат)), завершая PAH слоем. КТ затем адсорбовали на положительно заряженную поверхность, за чем следовали дополнительные PAH/PSS слои и финальный PAH слой. Ядро удаляли тремя последовательными 15-минутными инкубациями в 0,2 M EDTA (pH 6,5), давая полые микрокапсулы. Для клеточно-взаимодействия исследований финальное BSA покрытие (1%) наносили для снижения неспецифического связывания.

Техники характеристики

Гидродинамический диаметр и ζ-потенциал измеряли DLS и электрофоретной подвижностью (Malvern Zetasizer NanoZS). Время жизни флуоресценции записывали используя пульсирующий YAG:Nd³⁺ лазер (350 пс, 50 Гц) и фотомножительный детектор. Загрузка КТ квантифицировали измерением несвязанных КТ в supernatанте. SEM (JEOL JSM-7001F) визуализировал морфологию частиц, в то время как флуоресцентная и конфокальная микроскопия (Zeiss Axio Scope, Leica TCS SP5) оценивали оптические свойства и клеточный захват.

Клеточные исследования захвата

Муриные альвеолярные макрофаги (MH-S) инкубировали с ~1,2 × 10⁶ BSA-покрытыми КТ-кодированными капсулами в течение 4 ч (краткосрочно) или 24 ч (долгосрочно). После контр-окраски ядер DRAQ5, конфокальные изображения раскрыли интернализацию отдельных капсул и агрегатов, с более высоким захватом после продолжительного воздействия (Рис. 9).

Статистический анализ

Данные представляют средние ± SD из минимум трех независимых экспериментов, анализируемые с Excel и Origin Pro.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика микрчастиц карбоната кальция

Оптимальные условия перемешивания (250 об/мин, 30 с) дали почти сферические частицы (4–6 мкм) с минимальной агрегацией (Рис. 1). SEM изображения подтвердили пористую поверхность, состоящую из суб-микронных зерен, подходящую для последующей LbL сборки.

Подготовка и характеристика КТ-кодированных микрокапсул

КТ демонстрировали узкий эмиссионный пик при 590 нм и гидродинамический диаметр ~25 нм (Рис. 2). Последовательная PAH/PSS депозиция инвертировала заряд поверхности как ожидалось (Таблица 1). SEM изображения (Рис. 4) показывают прогрессивное утолщение оболочки, в то время как флуоресцентная микроскопия подтверждает присутствие КТ внутри оболочки (Рис. 5). Конфокальное изображение (Рис. 6) раскрывает четкое полое ядро, указывая на успешное растворение ядра.

Эффективность кодирования

КТ адсорбовали на положительно заряженную поверхность с линейным увеличением до ~2,24 мг загрузки; более высокие концентрации вели к насыщению и снижению адсорбции (Рис. 7a). Флуоресцентная интенсивность плато на загруженном диапазоне, обеспечивая достаточный контраст для визуализации (Рис. 7b).

Время жизни флуоресценции

Чистые КТ показывали наибольшее время жизни, которое снижалось при включении в микрчастицы и далее при удалении ядра (Таблица 2). Времена жизни стабилизировались после 48 ч, предполагая пренебрежимый долгосрочный фотообесцвечивающий эффект.

Клеточное взаимодействие

Конфокальные изображения демонстрируют эффективную фагоцитоз одиночных капсул и агрегатов MH-S клетками после обоих 4 ч и 24 ч инкубации (Рис. 9). Капсулы четко отличимы от ядер и часто появляются прикрепленными к или внутри клеток, подтверждая их потенциал как агентов живой-клеточной визуализации.

Заключение

Мы установили масштабируемый, водный метод для включения водорастворимых, PEG-стабилизированных КТ в полиэлектролитные микрокапсулы. Полученные капсулы демонстрируют единообразный размер, надежную флуоресценцию и эффективный клеточный захват, позиционируя их как перспективные тераностические платформы для нацеленной доставки лекарств и визуализации в реальном времени.

Аббревиатуры

EDTA

Ди натрия этилендиаминтетраацетат

PAA

Полиакриловая кислота

PAH

Поликатион поли(аллиламин гидрохлорид)

PEG

Полиэтиленгликоль

PSS

Полианион поли(натрий 4-стиренсульфонат)

QD

Квантовая точка

RPMI среда

Roswell Park Memorial Institute среда

SEM

Сканирующая электронная микроскопия

TOPO

Триоктилфосфиновый оксид