Целевая pH-чувствительная липосомная доставка морина с использованием конъюгатов аптамер-золотые наночастицы для лечения рака

Аннотация

В данном исследовании предложен синтез нового типа антиканцерогенных наночастиц — pH-чувствительных липосом с морином, модифицированных конъюгатами аптамер-золотые наночастицы (Apt-Au@MSL), обладающих целевыми свойствами. Микросреда опухолей существенно отличается от нормальных тканей: более низкий pH опухолевой микросреды часто снижает эффективность препаратов. Поэтому pH-чувствительные препараты привлекают все больше внимания. Золотые наночастицы (AuNPs) проявляют потенциал как носители лекарств благодаря малому размеру, хорошей биосовместимости, простоте поверхностной модификации и высокой проникающей способности в клетки. Полученные Apt-Au@MSL демонстрируют отличную монодисперсность и способность к таргетированной доставке в опухоль, а также контролируемое высвобождение препарата в слабокислой среде (диализ). Методом МТТ установлено, что данные наночастицы эффективно подавляют пролиферацию клеток SGC-7901. In vivo эксперименты на ксенограммных моделях мышей подтвердили, что введение Apt-Au@MSL ингибирует рост опухоли. Гистохимическое окрашивание H&E и TUNEL-тест показали, что Apt-Au@MSL индуцирует апоптоз опухолевых клеток. Механизм действия, вероятно, связан с перепроизводством реактивных форм кислорода (РФК) и регуляцией множественных сигнальных путей. Анализ биохимических показателей крови и H&E-окрашивание органов подтвердили отсутствие острой токсичности и высокую биосовместимость материала. Благодаря комплексным свойствам Apt-Au@MSL представляет перспективный таргетированный антиканцерогенный агент для будущего клинического применения.

Введение

Рак остается одной из главных причин смертности во всем мире, нанося значительный ущерб экономике и здоровью людей. Разработка «умных» препаратов для онкотерапии — приоритетное направление современной науки. Полимерные наночастицы способны защищать лекарственные вещества до достижения мишени, улучшая их доставку. Для обеспечения селективности используются стимулореактивные наносистемы, меняющие свойства под воздействием биологических сигналов (pH, редокс-состояние) или внешних факторов (температура, свет). pH-чувствительные наночастицы особенно перспективны из-за изменения pH при эндоцитозе и в опухолевой микросреде. Они могут менять поверхностную химию, размер, форму или высвобождать вещество в ответ на pH, что позволяет контролировать клеточный захват и выделение препарата.

Морин гидрат (3,5,7,2′,4′-пентагидроксифлавон) — природное биоактивное вещество, извлекаемое из растений и китайских лекарственных трав. Это флавоноид с выраженными антиоксидантными, противораковыми и противовоспалительными свойствами. Однако клиническое применение морина ограничено крайне низкой водорастворимостью и биодоступностью.

Липосомы — везикулярные структуры с двуслойной оболочкой из амифильных липидов (лецитин, сфингомиелин и др.). Они обладают высокой биосовместимостью, способны инкапсулировать как гидрофильные, так и гидрофобные агенты, защищая их от деградации и доставляя в целевые ткани. Введение pH-чувствительных липидов (например, холестеролгемисцината) позволяет создавать липосомы, нестабильные в кислой среде эндосом и опухолевой интерстиции, что обеспечивает контролируемое высвобождение препарата именно в зоне опухоли.

Для повышения селективности pH-чувствительные липосомы модифицируют таргетирующими лигандами. ДНК-аптамеры — однцепочечные олигонуклеотиды с высокой аффинитетом к мишеням — широко используются как сенсоры и агенты таргетированной терапии. Аптамер AS1411 проявляет высокую аффиность к нуклеолину, переэкспрессированному в раковых клетках, и сам по себе обладает химиотерапевтической активностью. Комбинирование аптамеров с золотыми наночастицами (AuNPs) создает гибридные наноконструкты с улучшенными свойствами. AuNPs легко функционализируются тиолсодержащими молекулами через ковалентные Au-S связи, что делает их удобной платформой для конъюгации с аптамерами. Гибридные системы липосома-AuNP объединяют преимущества обоих компонентов: высокую грузоподъемность липосом и плазмонные/таргетирующие свойства золота.

В данной работе мы разработали pH-чувствительные липосомы, инкапсулирующие морин, с поверхностно иммобилизованными конъюгатами Au-Apt (Apt-Au@MSL). Это позволило преодолеть ограничения морина (растворимость, биодоступность) и наделить систему свойствами активного таргетирования и pH-контролируемого высвобождения. Морфология, размер, заряд, стабильность и профиль высвобождения полученных наночастиц были детально охарактеризованы. Антираковая активность изучалась in vitro (на линейках клеток) и in vivo (ксенограммная модель).

Материалы и методы

Реактивы

Использовались: L-α-фосфатидилхолин (PC), холестерин (Chol), холестеролгемисцинат (CHEMS), морин (≥99,99%), натрий цитрат, HAuCl₄·3H₂O, поливинилпирролидон (PVP), NaOH, HCl (Sigma-Aldrich). Аптамер AS1411 с дисульфидной модификацией (5′-HS-T-(C6-S-S-C6)-TTG GTG GTG GTG GTT GTG GTG GTG GTG G-3′) синтезирован в TaKaRa (Далянь, Китай). МТТ, йодид пропидия (PI), кальцеин, Annexin V-FITC — Sigma-Aldrich. Все растворы готовили на двужды дистиллированной воде.

Синтез золотых наночастиц (AuNPs)

1 мл 1% HAuCl₄·4H₂O растворили в 25 мл Milli-Q воды (pH 5,5), добавили 50 мг PVP. Смесь облучали микроволнами (МВ) 5 мин при механическом перемешивании в трехшейном колбе. Быстро ввели 1,5 мл 1% раствора натрий цитрата и продолжили МВ-облучение 3 мин. Частицы осадили центрифугированием (10 000 об/мин, 5 мин).

Получение конъюгатов Apt-AuNPs

Дисульфидную связь аптамера разлагали трис(2-карбоксиэтил)фосфином (30 мин). Раствор аптамера (100 мкл, 100 мкМ) добавили к 10 мл 5 нМ раствора AuNPs и инкубировали 24 ч. Затем дважды с интервалом 4 ч солили смесь 2,5 мл 500 мМ NaCl для стабилизации конъюгата.

Приготовление pH-чувствительных липосом

Липосомы (молярное соотношение PC:CHEMS:Chol = 33:13:5, 5% морина) получали методом гидратации пленки. Липиды и морин растворили в хлороформе, удалили раствотитель ротационным испарением (40 °C). Пленку гидратировали 2% ФСБ (pH 7,4) и соницировали в ледяной ванне 15 мин. Для Apt-Au@MSL гидратацию проводили в растворе Au-Apt NPs (475 мкг/мл) в 5% дектрозе с последующей соникацией.

Характеризация

Применяли: UV-Vis спектроскопию, FT-IR, ТЭМ (HT7700, Hitachi), СЭМ (S-4800, Hitachi), ДСФ (DLS) и ζ-потенциал (Brookhaven ZetaPALS). Высвобождение морина определяли UV-Vis спектроскопией в ФСБ различного pH (7,4; 6,5; 5,0), имитирующих кровь, опухолевую микросреду и эндосомы.

Клеточные линии и культивирование

Использовали линии SGC-7901, BGC-823, A549, HeLa, MCF-7, Hs68 (ATCC), культивированные в RPMI-1640 + 10% ФСК, 37 °C, 5% CO₂.

Исследование антиопухолевой активности in vitro

Клетки посеяли в 96-колодчатых пластинках (2×10³ клеток/колодезь), инкубировали с Apt-Au@MSL (0–30 мкг/мл по морину) 24/48/72 ч. Контроль: свободный морин, AuNPs, необработанные клетки. Жизнеспособность оценивали МТТ-тестом (IC₅₀). Адгезию и пролиферацию мониторили системой RT-CES (iCELLigence) в реальном времени (75 ч). Морфологию оценивали по флуоресцентной микроскопии (LIVE/DEAD тест: кальцеин-AM/PI).

Анализ апоптоза (цитометрия)

Клетки SGC-7901 (1×10⁵/колодец 6-колодчатой пластинки) инкубировали с Apt-Au@MSL (5–30 мкг/мл) 12 ч. Окрасили Annexin V-FITC/PI, анализировали на CytoFLEX (Beckman Coulter).

Ультравструктурный анализ (ТЭМ)

После инкубации с Apt-Au@MSL (5–30 мкг/мл, 12 ч) клетки фиксировали 2,5% глютаральдегидом, дегидратировали в ацетоне, контрастировали и изучали ТЭМ (HT-7700).

Вестерн-блоттинг

Определяли экспрессию каспаз-3, -8, -9 и PARP. Клетки (4×10⁵/блюдце 9 см) обрабатывали 20 мкг/мл Apt-Au@MSL 1, 6, 12, 24 ч. Белки извлекали лизисным буфером, разделяли СДС-ПААГ (10% трицин), переносили на нитроцеллюлозу, инкубировали с первичными и вторичными антителами, визуализировали ЭХЛ. β-актин — контроль загрузки. Квантификация — Quantity-One.

Животная модель (ксенограмма)

Самцы голых мышей BALB/c (~17 г) подкожно инъциировали 100 мкл суспензии SGC-7901 (1×10⁶ клеток/мл) в область плеча. Через 15 дней опухоли достигли ~50 мм³. Мышей рандомизировали на 5 групп (n=6–8): ФСБ, морин, морин-липосомы, Au-Apt, Apt-Au@MSL. Внутривенно (хвостовой вене) вводили 2 мг/кг препарата каждые 3 дня (всего 24 дня). Объем опухоли = длина × ширина² × 0,5. Массу тела и выживаемость фиксировали ежедневно. В конце эксперимента собирали опухоли и органы для H&E и TUNEL.

Оценка токсичности in vivo

Через 30 дней мышей эвтаназировали. Органы (печень, селезенка, почки, сердце, легкие, опухоль) окрашивали H&E. В крови определяли глюкозу. Массу тела отслеживали динамически.

Результаты и обсуждение

Характеризация наночастиц

Apt-Au@MSL синтезировали по модифицированному протоколу. UV-Vis спектры: AuNPs — пик ~530 нм; после конъюгации с аптамером и покрытия липосомами пики смещаются (362 и 550 нм), подтверждая успешную сборку. FT-IR показывает красный сдвиг характерных полос морина в Apt-Au@MSL.

pH-зависимое высвобождение: при pH 5,0 за 24 ч высвобождается ~54% морина, далее — устойчивое продолжение до 96 ч; при pH 7,4 — только ~10% за 24 ч. Это подтверждает высокую стабильность в кровотоке и активное высвобождение в кислой микросреде опухоли/эндосом.

Морфология и размер: СЭМ: чистые липосомы — униламеллярные везикулы ~120 нм (DLS). Apt-Au@MSL — гибридные везикулы ~150 нм (DLS). ТЭМ AuNPs: ~10 нм. ТЭМ Apt-Au@MSL: AuNPs локализуются преимущественно на периферии липосомной бидвойки.

ζ-потенциал: AuNPs: −57,1 мВ; Au-Apt: −31,7 мВ; Apt-Au@MSL (после модификации положительно заряженными морин-липосомами): +36,4 мВ. Связывание происходит за счет электростатического взаимодействия.

Инкапсуляционная эффективность (EE): морин-липосомы — 90,2%; Apt-Au@MSL — 89,6%. Стабильность EE сохраняется ≥24 ч.

Антираковая активность in vitro

МТТ-тест: свободный морин не проявляет активности. Инкапсуляция в pH-липосомы (Морин-липосомы) значительно повышает цитотоксичность. Модификация Apt-Au (Apt-Au@MSL) усиливает эффект дополнительно. IC₅₀ для SGC-7901: Apt-Au@MSL — 15,6±1,5 мкг/мл. Селективность: высокая токсичность к раковым клеткам, низкая — к нормальным (Hs68).

RT-CES (адгезия/пролиферация): данные коррелируют с МТТ: Apt-Au@MSL дозизависимо ингибирует адгезию и рост SGC-7901.

Флуоресцентная микроскопия (LIVE/DEAD): при обработке Apt-Au@MSL дозазависимо увеличивается доля мертвых клеток (красная флуоресценция PI), снижается — живых (зеленая кальцеин).

Индукция апоптоза (цитометрия Annexin V/PI)

Апоптоз (ранний + поздний) в контрольной группе: 1,57%. Морин: 3,51%. Apt-Au@MSL (5, 10, 20, 30 мкг/мл): 7,44%, 10,75%, 15,53%, 40,77%. Четкая дозазависимость подтверждает апоптотический механицит.

Нарушение клеточной целостности (ТЭМ)

Контроль: целые клетки с ядером. Морин/Морин-липосомы: частичное повреждение, конденсация хроматина. Apt-Au@MSL: масштабное разрушение цитоплазмы и ядерной оболочки, вытекание цитоплазмы, образование фрагментов, распад клеточной стенки. При повышении концентрации в ядре визуализируются области AuNPs (красные стрелки), указывающие на внутриклеточную доставку и высвобождение морина.

Молекулярный механизм (вестерн-блоттинг)

Apt-Au@MSL дозазависимо активирует каспазы-3, -8, -9. Каспаза-9 активируется сильнее каспазы-8, что указывает на доминирование митохондриального (внутреннего) пути апоптоза. Временная динамика (1–24 ч): кливка PARP и активация каспаз растут во времени. Количественный анализ подтверждает статистическую значимость (*p<0,05, **p<0,01).

Антиопухолевое действие in vivo

Рост опухоли: Apt-Au@MSL кардинально снижает массу и объем опухоли по сравнению с контролем (ФСБ, морин, морин-липосомы, Au-Apt). Объем опухоли в группе Apt-Au@MSL — ~1/10 от контрольной и ~1/6 от групп морина/морин-липосом. Свободный морин и морин-липосомы при 40 мг/кг не ингибируют рост.

Масса тела и выживаемость: вес мышей во всех группах стабилен (нет острой токсичности). Группа Apt-Au@MSL демонстрирует значительное удлинение выживаемости без признаков токсичности.

Гистологический анализ (H&E и TUNEL)

H&E: группа Apt-Au@MSL — выраженное повреждение опухолевой ткани, множественные а폽тотические тела. Контроль и группы морина/морин-липосом/Au-Apt — плотная упаковка живых опухолевых клеток.

TUNEL: в группе Apt-Au@MSL масштабная зеленая флуоресценция (апоптоз), в контрольных — единичные а폽тотические клетки. Результаты H&E и TUNEL согласованы.

Токсикологическая безопасность in vivo

Биохимия крови (глюкоза) — без изменений по сравнению с контролем. Динамика массы тела — плавный рост во всех группах. H&E органов (печень, селезенка, почки, сердце, легкие) — нет признаков воспаления, некроза или структурных повреждений в группе Apt-Au@MSL. Материал проявляет пренебрежимо малую острой токсичность и хорошую биосовместимость.

Заключение

Синтезирован новый наноматериал Apt-Au@MSL с отличной монодисперсностью, таргетирующими свойствами и pH-контролируемым высвобождением морина. Ключевые результаты:

• Размер ~150 нм, положительный ζ-потенциал (+36,4 мВ), EE ~89,6%.
• Максимальное высвобождение морина при pH 5,0 (~54% за 24 ч), минимальное — при pH 7,4 (~10%).
• IC₅₀ на SGC-7901 — 15,6±1,5 мкг/мл; высокая селективность.
• Индуцирует апоптоз через митохондриальный путь (каспаза-9 > каспаза-8) с участием РФК.
• In vivo: мощная ингибиция роста ксенограмм, пролонгация выживаемости, гистологическое подтверждение апоптоза (H&E, TUNEL).
• Отсутствие острой токсичности (биохимия крови, H&E органов, масса тела).

Apt-Au@MSL представляет собой перспективную платформу для таргетированной доставки малорастворимых антиканцерогенных агентов с контролем по pH, пригодную для дальнейшей до klinической разработки.