Мозг-нацеленные наночастицы допезила, эмульгированные полисорбатом-80: новая нейропротекторная стратегия

Аннотация

Лечение болезни Альцгеймера (БА) часто не достигает терапевтических концентраций в мозге из-за гематоэнцефалического барьера (ГЭБ). Мы спроектировали наночастицу из холестерин-модифицированного пуллана (CHP), загруженную ингибитором ацетилхолинэстеразы допезилом (DZP), и покрыли ее поверхность полисорбатом 80 (PS) для активной транцитозы через ГЭБ. Методами динамического светового рассеяния и изотермической титрокалориметрии определили оптимальное соотношение DZP:CHP 1:5 (вес/вес), обеспечивающее высокую инкапсуляцию (86,5%) и загрузку (13,4%). In vitro высвобождение демонстрировало устойчивый выпуск DZP за 72 ч. In vivo флуоресцентная визуализация на мышах подтвердила преференциальное накопление PS-покрытых наночастиц в мозговой ткани с пренебрежимым отторговым депозитом. Функциональные тесты на клетках PC12 и SH-SY5Y, предварительно обработанных Aβ25–35, показали, что DZP-CHP наночастицы восстанавливали жизнеспособность клеток, снижали утечку лактатдегидрогеназы (ЛДГ), сохраняли митохондриальный мембранный потенциал (ММП) и ингибировали апоптоз эффективнее свободного DZP. Микротермофорез выявил сильное связывание с ApoE (K_D = 3,6 мкМ), указывая на рецептор-медированный транспорт через ГЭБ. Результаты подтверждают клинический потенциал PS-покрытых DZP-CHP наночастиц для таргетированной нейропротекции при БА.

Введение

БА характеризуется прогрессирующим когнитивным снижением и амилоидно-β (Aβ) депонированием. Конвенциональный оральный допезил страдает от плохой водной растворимости, низкой оральной биодоступности и ограниченного проникновения через ГЭБ, требуя ежедневного дозирования и снижая приверженность пациентов. Нанопartikelлярные системы доставки (нано-ДС) обещают преодолеть эти барьеры, облегчая пассивную диффузию и рецептор-медированный транспорт через ГЭБ. Полисорбат 80, неионный поверхностно-активный вещество, адсорбирует сывороточные аполипопротеины (ApoE, ApoB), имитируя липопротеины низкой плотности, которые могут захватывать ЛПНП-рецепторы на эндотелиальных клетках и проходить через ГЭБ. Холестерин-модифицированный пуллан (CHP) самособирается в амфифильные наночастицы с гидрофобным ядром для инкапсуляции липофильных лекарств и гидрофильной оболочкой, снижающей опсонизацию.

В этом исследовании мы соединили CHP и PS для создания двоично-функциональной наночастицы, инкапсулирующей DZP, способствующей проникновению через ГЭБ и обеспечивающей устойчивые терапевтические уровни в мозге при митигации Aβ-токсичности in vitro.

Материалы и методы

Материалы

CHP (собственное приготовление), допезил (Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.), полисорбат 80 (Tianjin Fuchen Reagent Institute), индицианин грин (ICG) краситель (Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.), черные мыши C57BL/6, Aβ25–35 (US Sigma), МТТ реактив (US Sigma), набор ЛДГ (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.), АО/ЭБ набор для окраски (Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.), клеточные линии PC12 (раковая надпочечника крысы) и SH-SY5Y (человечная нейробластома) (ATCC).

Подготовка наночастиц

Три соотношения DZP:CHP (10:20, 4:20, 2:20 вес/вес) растворяли в водной среде и диализировали (MWCO 1 кДа) для формирования наночастиц. PS (0,7 мМ) добавляли к 10 мл каждой суспензии, мешали 1 ч и ультразвуково обрабатывали (100 Вт, импульсы 2 с) до однородности. PS-покрытые DZP-CHP (PS-DZP-CHP) наночастицы фильтровали для удаления примесей.

Характеризация

ТЭМ и СЭМ подтвердили сферическую морфологию. Динамическое световое рассеяние (DLS) измерило размер и дзета-потенциал. Изотермическая титрокалориметрия (ITC) оценила аффинность связывания PS и покрытие. In vitro высвобождение оценивали диализом против ФСБ pH 7,4 при 37 °C, забирая пробы до 72 ч и квантифицируя DZP УФ-виз (312 нм) по калибровочной кривой.

In vivo таргетинг мозга

ICG-маркированные DZP-CHP наночастицы готовили диализом 400 мг CHP-DZP с 20 мг ICG, затем ультразвуковой обработкой. PS-ICG-DZP-CHP наночастицы формулировали как выше. Десять черных мышей получали внутривенные инъекции 200 мкл (200 мкг/мл) PS-ICG-DZP-CHP или ICG-DZP-CHP. Флуоресцентная визуализация (экск 765–815 нм, эмисс 815–845 нм) фиксировала распределение во всем теле и органах через 30 мин после инъекции.

Тканевое распределение

Сорок пять мышей C57BL/6 распределили по группам: свободный DZP, DZP-CHP, PS-DZP-CHP (0,25 мг/кг, внутривенно). Кровь и органы (мозг, сердце, печень, почка) собирали в 1, 3, 6 ч. Гомогенаты экстрагировали метанолом, центрифугировали и анализировали по ЖХ-МС/МС (мобильная фаза: 0,1% муравьиная кислота вода/метанол 70:30, расход 0,3 мл/мин). Квантификация использовала множественную реакционную мониторинг (MRM) с положительной электроспрей ионизацией.

Клеточные модели и нейропротективные тесты

Клетки PC12 и SH-SY5Y культивировали в DMEM + 10% ФКС, посеяли 1×10⁴ клеток/мл (96-колодчатые пластинки) или 2–3×10⁵ клеток/мл (остальные тесты). Aβ25–35 (20 мкМ) индуцировал нейротоксичность. Жизнеспособность измеряли МТТ (490 нм). Высвобождение ЛДГ (450 нм) оценивало мембранную целостность. ММП оценивали флуоресценцией رودамина 123. Морфологию апоптоза визуализировали АО/ЭБ окраской.

Результаты

Характеризация наночастиц

CHP وحده формировал ~257 нм сферы (дзета –2,8 мВ). Загрузка DZP незначительно увеличивала размер до 260–274 нм и смещала дзета до –5…–9 мВ в зависимости от соотношения. Формуляция 1:5 DZP:CHP (DCN2) дала наивысшую инкапсуляцию (86,5%) и загрузку (13,4%). PS-покрытие увеличило размер до 335 нм и дзета до –2,2 мВ, подтверждая успешную поверхностную модификацию.

Аффинность связывания PS

ITC показал аффинность PS: 1,47×10⁵, 2,98×10⁵, 3,67×10⁵ М⁻¹ для DCN1, DCN2, DCN3 соответственно, с покрытием 2,65, 2,70, 1,49 моль PS на моль наночастицы. Эндотермические, энтропийно-драйвованные взаимодействия указывают на гидрофобную ассоциацию.

In vitro высвобождение

Свободный DZP растворялся быстро. PS-DZP-CHP высвободил 35% за 6 ч, 70% к 24 ч, 90% к 72 ч, указывая на устойчивое высвобождение. Непокрытые DZP-CHP высвобождались быстрее, вероятно, из-за более слабого экранирования PS.

Таргетинг мозга

Флуоресцентная визуализация показала пренебрежимый сигнал в контроле свободного ICG. PS-ICG-DZP-CHP дал яркую флуоресценцию в мозге через 30 мин после инъекции, с минимальным сигналом в периферических органах. Тканевая квантификация подтвердила 3–4-кратное повышение концентрации DZP в мозге для PS-DZP-CHP против свободного DZP, и задержанный пик (6 ч против 1 ч), указывающий на устойчивое высвобождение.

Связывание с ApoE

МСТ дал K_D 3,63 мкМ для взаимодействия PS-ICG-CHP–ApoE, подтверждая рецептор-медированную транцитозу через ГЭБ.

Нейропротекция в клеточных моделях

Aβ25–35 20 мкМ снизил жизнеспособность PC12 до 49,5% и SH-SY5Y до 49,7%. Предварительная обработка DZP-CHP (5 мкМ, 10 мкМ) восстановила жизнеспособность до 68–75% (против 48% для свободного DZP). Высвобождение ЛДГ уменьшилось на 30% с DZP-CHP, ММП осталось >80% контроля, тогда как свободный DZP давал только ~70%. АО/ЭБ окраска показала снижение апоптотической морфологии в группах DZP-CHP.

Обсуждение

Наши PS-покрытые DZP-CHP наночастицы достигли таргетированной доставки в мозг, устойчивого высвобождения лекарства и превосходной нейропротекторной эффективности in vitro. Высокая аффинность PS и адсорбция ApoE облегчают ЛПНП-медированную транцитозу через ГЭБ, в то время как CHP-ядро предоставляет липофильный резервуар, снижающий Aβ-агрегацию. По сравнению с конвенциональным свободным DZP, нанопartikelлярная платформа продлевает интервалы дозирования, потенциально улучшая приверженность пациентов и снижая побочные эффекты. Будущие in vivo исследования сфокусируются на фармакокинетике, токсичности и терапевтической эффективности в животных моделях БА.

Заключение

Холестерин-модифицированные пуллановые наночастицы, загруженные допезилом и покрытые полисорбатом 80, демонстрируют оптимальную загрузку (1:5 DZP:CHP), устойчивое высвобождение, эффективное проникновение через ГЭБ и усиленную нейропротекцию против Aβ-индуцированной токсичности. Эти результаты подтверждают PS-DZP-CHP как перспективную наномедицину для лечения болезни Альцгеймера.