Эмульгированный полисорбат 80-донепезил, нацеленный на мозг, наночастицы, содержащие лекарственное средство, для нейрозащиты

Введение

БА - заболевание центральной нервной системы со сложными патологическими механизмами, которое вызывает прогрессирующую когнитивную дисфункцию, но его очень трудно лечить из-за сложности введения лекарств и низкой концентрации лекарств, которые могут достигать ткани мозга [1, 2]. Прохождение ГЭБ стало серьезной трудностью в исследованиях систем доставки лекарств (DDS) [3, 4]. Большинство лекарств открывают ГЭБ биологическими, химическими или физическими средствами; среди них в настоящее время наиболее широко используются в клинической практике физические методы [5]. Из-за непреодолимых дефектов внутричерепной доставки лекарств, основанной на инвазивной технологии, получение липофильных пролекарств или активных транспортных субстратов путем химической модификации поверхности лекарственного средства имеет больше преимуществ [6]. Среди них наночастицы - один из лучших вариантов для внутричерепной доставки лекарств за счет активного воздействия на ГЭБ [7,8,9].

Нано-ДДС стали центром исследований, нацеленных на мозг, и включают полимерные наночастицы, органические наночастицы, липосомы, нановолокна и мицеллы, которые были разработаны для обеспечения лечения и диагностики [6, 10, 11, 12]. И наночастицы, содержащие лекарственные средства, и низкомолекулярные липофильные препараты могут проходить через ГЭБ. Разница в том, что наночастицы, содержащие лекарственное средство, с большей вероятностью проходят пассивную диффузию путем адсорбции на стенке капилляров в головном мозге. Кроме того, свободные препараты сталкиваются со вторым барьером - гематоэнцефалическим барьером (B-CSF) [13]. В отличие от других барьерных аналогов, большинство лекарств относительно проницаемы через спинномозговую жидкость и диффундируют в паренхиму головного мозга. Однако из-за очень медленного процесса диффузии концентрация свободных лекарств в спинномозговой жидкости намного выше, чем в паренхиме головного мозга, и высокая концентрация в спинномозговой жидкости вызывает некоторую токсичность [14, 15]. В этом процессе наночастицы обладают уникальными и значительными преимуществами. Если поверхность наноносителя покрыта гидрофильным поверхностно-активным веществом, ApoE будет адсорбироваться на поверхности, и CSF может способствовать перемещению наночастиц к паренхиме мозга через пространство вокруг кровеносных сосудов [16]. Наночастицы, покрытые неионогенным поверхностно-активным полисорбатом 80, полученным Kreuter et al. [17] были первыми лекарствами, успешно доставленными в систему мозга и транспортируемыми посредством адсорбции сывороточного протеина ApoE в плазме. Следовательно, модификация полисорбатом 80 на поверхности наночастиц с образованием лекарственно-специфического композита позволяет нацеливать лекарство и распознавать эндогенный рецептор BBB, значительно увеличивая биодоступность лекарств [18,19,20].

В настоящее время ингибитор ацетилхолинэстеразы (AChE) донепезил (DZP) обычно используется для лечения умеренной БА, но из-за его растворимости в жирах он плохо растворяется в vivo При низкой биодоступности при приеме внутрь обычные таблетки донепезила необходимо принимать ежедневно для поддержания терапевтического эффекта [21, 22]. Поскольку когнитивные способности пациентов с БА серьезно нарушены, что вызывает большие неудобства при соблюдении графика приема лекарств, разработка препарата ДЗП длительного действия с замедленным высвобождением является неотложной. Гипотеза амилоидного каскада предполагает, что причиной БА является отложение амилоидных бляшек вокруг паренхимы головного мозга и стенок сосудов головного мозга. Большое количество диффузных пятен также наблюдается в областях мозга, которые состоят из аморфных, сильно фиброзных и нерастворимых внеклеточных отложений Aβ [23, 24]. Boridy et al. обнаружили, что наночастицы полисахарида пуллулана, которые нетоксичны и легко разлагаются, могут образовывать комплекс с белком Aβ и эффективно предотвращать агрегацию белка и могут быстро выводиться из клеток для подавления токсичности клеток [25]. Холестерин-гидрофобно модифицированный пуллулан (ГПК) представляет собой амфифильное вещество, которое может самособираться в наноструктуру с гидрофобным ядром и гидрофильной оболочкой сахарной цепи в водном растворе [26, 27]. В то же время наночастицы КГП могут адсорбировать белок Aβ, предотвращая его отложение и агрегацию, играя синергетическую роль. Как наноноситель, ТЭЦ имеет значительное преимущество.

Основываясь на вышеизложенных знаниях, исследовательская группа разработала нанопрепарат DZP-CHP на ранней стадии и определила оптимальное соотношение дозировки лекарства к наноносителю. Затем полисорбат был адсорбирован на поверхности наночастиц для активного нацеливания на прохождение через ГЭБ и обогащения мозга. В этом исследовании была охарактеризована серия нанорастворов DZP-CHP, а также исследован и изучен процесс высвобождения лекарственного средства in vitro. После успешного получения наночастиц Aβ25-35 использовали для индукции повреждения нервных клеток для создания модели клеток AD [28, 29]. Затем защитный эффект нанораствора DZP-CHP был исследован на моделях клеток PC12 и SH-SY5Y.

Материалы и методы

Материалы

Были использованы:пуллулан, гидрофобно модифицированный холестерином (домашний) [30]; донепезил (Shanghai Ziqi Biotechnology Co., Ltd.); полисорбат 80 (Тяньцзиньский институт реагентов Фучэн); краситель индоцианиновый зеленый (ICG) (Tianjin Baiying Biological Technology Co., Ltd.); полисорбат 80 (Tween 80, PS) (офис реагентов Tianjin Fuchen); черные мыши (Hunan Slake Jingda Laboratory Animal Co., Ltd.); Aβ25-35 (US Sigma); соль тетраметилазозола (МТТ) (US Sigma); сыворотка новорожденного крупного рогатого скота (U.S. Gibco); набор лактатдегидрогеназы (LDH) (Nanjing Jiancheng Biological Co., Ltd.); Набор для флуоресценции с двойным окрашиванием AO / EB (Sino Pharmaceutical Group Chemical Reagent Co., Ltd.); и клетки PC12 (клетки феохромоцитомы надпочечников крысы), полученные из отделения неврологии второй больницы Сянъя Центрального южного университета. Клетки SH-SY5Y (клетки нейробластомы костного мозга человека) были приобретены в Банке клеток АТСС (Манассас, Вирджиния, США).

Подготовка наночастиц

Три типа наночастиц с различными соотношениями DZP и CHP (w / w) (10:20, 4:20 и 2:20) были успешно получены сначала с помощью водного диализа в соответствии с методами, описанными в литературе [31]. Определенную концентрацию наночастиц DZP-CHP добавляли в стакан с постоянным объемом 10 мл, а затем отсасывали в другой стакан, содержащий эмульгатор полисорбат 80 (PS) (концентрация 0,7 ммоль) для осаждения в течение 1 часа. Затем смесь помещали в трубку EP и обрабатывали ультразвуком в течение 3 мин (выходная мощность 100 Вт, режим работы с прерывистым импульсом:ширина импульса 2,0 с, время прерывания 2,0 с). Операцию повторяли трижды до получения однородной дисперсии [32]. Эмульгированные наночастицы донепезила, нагруженные полисорбатом 80 (PS-DZP-CHP), были окончательно получены после удаления примесей фильтрацией.

Характеристика наночастиц

Морфология наночастиц

Форму, морфологию поверхности и размер наночастиц DZP-CHP (DCP) с отношениями DZP к CHP 1:2, 1:5 и 1:10 анализировали с помощью просвечивающего электронного микроскопа Tecnai F20. Капля наночастиц CHP, DZP-CHP и PS-DZP-CHP была помещена на покрытую углеродом медную сетку для образования тонкой жидкой пленки. Затем использовали 2% (мас. / Об.) Раствор фосфорновольфрамовой кислоты для получения отрицательного окрашивания образца после естественного высыхания пленки. Свежеприготовленный водный раствор наночастиц добавляли по каплям на чистую силиконовую пластину, сушили при комнатной температуре и затем помещали под автоэмиссионный сканирующий электронный микроскоп JSM-6700F для наблюдения за структурой поверхности.

Размер наночастиц и дзета-потенциал

Размер, коэффициент полидисперсности (PDI) и дзета-потенциал наночастиц DZP-CHP и PS-DZP-CHP анализировали с использованием динамического рассеяния света (DLS). Средний размер частиц и гранулометрический состав полученной гомогенной суспензии измеряли по три раза каждая.

Выпуск лекарства in vitro

Высвобождение донепезила измеряли с помощью динамического водного диализа. Один миллиграмм наночастиц DZP-CHP и PS-DZP-CHP растворяли в 5 мл фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,4, концентрация 0,01 M), а затем переносили в диализный мешок, который хранили в том же растворе при постоянная температура 37 ° C с магнитной мешалкой. Четыре миллилитра PBS при 0, 0,5, 1, 2, 4, 8, 12, 24, 48 и 72 часах разбавляли таким же объемом PBS при том же pH. Спектрофотометрия в ультрафиолетовом и видимом диапазонах была использована для определения оптической плотности диализата при 312 нм в разное время; содержание раствора определяли по стандартной кривой, и тест высвобождения повторяли три раза in vitro. Процент высвобождения донепезила рассчитывали по следующей формуле:

Cn - концентрация образца в момент времени Tn, мкг / мл; V - общий объем высвобождающего раствора PBS, мл; Vn - объем высвобождаемой жидкости PBS в момент времени Ti, мл; и Ci - концентрация донепезила в момент времени Ti, мкг / мл.

Изотермическая калориметрия титрования (ITC)

Раствор ПС определенной концентрации капали по каплям на растворы наночастиц ГПК, и изменения тепла измеряли с помощью ITC (vip-itc, Microcal, Нортгемптон, Массачусетс, США). Раствор наночастиц ГПК включал три типа наночастиц с различным соотношением DZP-CHP (1:2, 1:5 и 1:10). Все растворы перед титрованием дегазировали. Температура всей системы поддерживалась постоянной на уровне 25 ° C.

Эксперименты на животных по наблюдению за таргетингом на мозг

Приготовление меченных ICG наночастиц донепезила CHP

Четыреста миллиграммов CHP-DZP и 20 мг ICG взвешивали с использованием аналитических весов и добавляли соответствующее количество ДМСО для тщательного перемешивания и растворения. Затем полученный выше раствор по каплям добавляли в диализный мешок с помощью пипетки, и дистиллированную воду заменяли один раз в час. Через три часа дистиллированную воду заменяли каждые 2 часа и добавляли 400-800 мл дистиллированной воды каждый раз в течение 48 часов до полного диализа ДМСО. После этого полученный раствор переносили пипеткой в ​​мерную колбу для получения постоянного объема и затем обрабатывали ультразвуковой волной в течение 2 мин. Фильтрация через фильтрующую мембрану 0,45 мкм привела к получению меченных ICG наночастиц DZP-CHP (ICG-DZP-CHP), которые были упакованы отдельно и хранились в холодильнике при 4 ° C для будущего использования.

Приготовление эмульгированных флуоресцентных наночастиц донепезила CHP

Соответствующее количество ICG-DZP-CHP помещали в химический стакан на 10 мл и добавляли 1 л (об. / Об.) Эмульгатора полисорбат 80 (PS). Стакан выдерживали в течение 1 ч, а затем переносили в пробирку EP для обработки ультразвуком на 2 мин при 100 Вт. Вышеупомянутую операцию повторяли три раза до получения однородного нанораствора. Наконец, были получены отфильтрованные и меченные ICG эмульгированные наночастицы донепезила, нагруженные лекарственным средством (PS-ICG-DZP-CHP).

Эксперименты с MST для проверки привязки APOE к наночастицам

Все эксперименты MST проводились на системе Monolith NT.115 (201810-BR-N024). Все растворы были приготовлены с использованием деионизированной воды и реагентов ЧДА. Буферы готовили и хранили при комнатной температуре. До использования образцы белка хранили на льду [33]. Наночастицы PS-ICG-CHP (55,6 мкМ) разбавляли до 40 нМ деионизированной водой и загружали ICG для флуоресценции. Готовили раствор APOE (30 мкл, 55,6 мкМ), и 16 капиллярных пробирок были помечены от 1 до 16; сначала 20 мкл APOE добавляли в пробирку 1 и 10 мкл добавляли в пробирки со 2 по 16. Затем 10 мкл раствора переносили из пробирки 1 в пробирку 2 и тщательно перемешивали. После этого 10 мкл раствора удаляли из пробирки 2 и переносили в пробирку 3. Эту операцию повторяли до тех пор, пока 10 мкл раствора не было окончательно удалено из пробирки 16, чтобы гарантировать, что раствор в каждой пробирке имел одинаковый объем. В каждую пробирку добавляли десять микролитров разбавленных наночастиц и тщательно перемешивали, чтобы начать измерение. Данные теста MST были проанализированы с помощью программного обеспечения NT-анализа, а подгонка KD была проведена в соответствии с законом действия масс в соответствии с инструкциями программного обеспечения.

Технология флуоресцентной визуализации in vivo для наблюдения за таргетингом на мозг

Была выбрана партия здоровых черных мышей весом приблизительно 18–22 г каждая и случайным образом разделена на 2 группы:группу PS-ICG-DZP-CHP и группу ICG-DZP-CHP. Каждой мыши вводили 200 мкл 200 мкг / мл препаратов вышеуказанной группы через хвостовую вену, а через 0,5 часа мышей анестезировали 1% пентобарбиталом натрия (50 мг / кг). После этого всех мышей помещали в зону фотографирования живого имидж-сканера с параметрами визуализации, установленными на длину волны возбуждения 765-815 нм и длину волны поглощения 815-845 нм для получения флуоресцентного изображения всего животного. . После визуализации всех мышей препарировали и удаляли почки, сердце, селезенку, легкие, печень и мозг для получения флуоресцентных изображений. Параметры изображения соответствовали описанным выше.

Исследование тканевого распределения наночастиц

Группирование и выборка мышей

Сорок пять мышей C57BL / 6 были случайным образом разделены на 15 групп:5 группам вводили свободный донепезил (свободная группа), 5 группам вводили наночастицы донепезила (наногруппа), а еще 5 группам вводили наночастицы донепезила, модифицированные PS (группа PS), при 0,25 мг / кг через хвостовую вену. Затем кровь брали через 1 ч, 3 ч и 6 ч после инъекции. После этого всех животных забивали, собирали и измельчали ​​ткани сердца, мозга, печени и почек. Затем 0,2 г указанной ткани точно взвешивали и добавляли приблизительно к 1 мл 0,9% раствора NaCl и гомогенизировали с помощью гомогенизатора (65 Гц, 150 с). Сто микролитров гомогената ткани аккуратно набирали в 1,5 мл пробирку EP с 0,7 мл метанола, встряхивали для перемешивания в течение 30 с для осаждения белка, а затем центрифугировали при 12000 об / мин ^-1 на 10 мин. Наконец, 100 мкл супернатанта переносили в колбу для инъекций для анализа.

Метод определения

Впервые для исследования использовалась ВЭЖХ, но чувствительность оказалась недостаточно высокой. Поэтому были проведены последующие эксперименты ЖХ-МС, которые показали сильную специфичность и отсутствие эндогенных веществ, мешающих определению лекарственного средства. Протокол ЖХ – МС соответствует руководящим принципам по определению биологических образцов. Хроматографические условия были следующими:подвижная фаза А, вода (содержащая 0,1% муравьиной кислоты); подвижная фаза B, метанол (содержащий 0,1% муравьиной кислоты); изократическое элюирование:A30% -B70%; скорость потока 0,3 мл · мин ^-1 ; температура колонки 35 ° С; объем инъекции, 10 мкл. Условия столкновения были следующими:температура источника ионизации электрораспылением (ESI) 150 ° C; расход дымового газа, 550 л · ч ⁻¹ ; температура дымового газа 500 ° C. Условия детектирования положительных ионов были следующими:капиллярное напряжение 3 кВ; конусное напряжение 30 В; режим сканирования, мониторинг множественных реакций (MRM).

Эксперименты с ячейками

Культура клеток и их пассаж

Клетки PC12 и SH-SY5Y культивировали в среде DMEM с высоким содержанием сахара с добавлением 10% (об. / Об.) Инактивированной нагреванием фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1% (об. / Об.) Пенициллина и стрептомицина, а затем хранили в инкубаторе, содержащем 5 % CO ₂ при 37 ° С. Клетки использовали в различных экспериментах или пассировали, как только они достигли 80% слияния. Перед экспериментами клетки PC12 и SH-SY5Y высевали на планшеты с предварительно нанесенным коллагеном I типа при требуемой плотности клеток в соответствии с экспериментальным масштабом.

Криоконсервация клеток

При наблюдении роста до логарифмической фазы под микроскопом клетки PC12 и SH-SY5Y были заморожены и дважды промыты PBS, трипсинизированы для образования клеточной суспензии и помещены в стерильную центрифужную пробирку для сбора центрифугированием (1000 об / мин ^{- 1} , 3 мин). Затем добавляли раствор для криоконсервации клеток, и клетки хранили в пробирке с пометкой имени клетки и даты. Клетки помещали в холодильник при 4 ° C на 1 час, -20 ° C на 2 часа, -80 ° C (замораживали) на ночь и, наконец, переносили в резервуар с жидким азотом.

Метод MTT для определения выживаемости клеток

Жизнеспособность клеток измеряли с помощью анализа восстановления МТТ. Вкратце, клетки PC12 и SH-SY5Y высевали в 96-луночные планшеты (предварительно покрытые коллагеном типа I) при плотности 1 × 10 ⁴ клеток / мл, чтобы клетки могли прилипнуть к каждой лунке. После инкубации в течение 24 ч клетки предварительно инкубировали с различными концентрациями нанораствора донепезила ХР или свободного раствора донепезила в течение 2 ч. Затем в каждую лунку добавляли Aβ25-35 (конечная концентрация 20 мкМ). Обработанный 96-луночный планшет инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов. После этого добавляли МТТ (50 мкл, 5 мг / мл) и инкубировали с обработанными клетками при 37 ° C в течение 4 часов. Наконец, среду осторожно удаляли и кристаллы формазана растворяли в 150 мкл ДМСО. Поглощение получали при 490 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов. Жизнеспособность клеток выражается как процент живых клеток в обработанной группе и процент живых клеток в необработанной контрольной группе.

Определение активности ЛДГ в супернатанте клеток

Клетки PC12 и SH-SY5Y высевали в 96-луночные культуральные планшеты (предварительно покрытые коллагеном типа I) при плотности 2 × 10 ⁵ и 3 × 10 ⁵ клеток / мл соответственно. После инкубации в течение 24 ч клетки предварительно инкубировали с различными концентрациями нанораствора донепезила ХР или свободного раствора донепезила в течение 2 ч. Затем в каждую лунку добавляли Aβ25-35 (конечная концентрация 20 мкМ). Активность ЛДГ измеряли в соответствии с инструкциями, прилагаемыми к набору. Вкратце, культивированные клетки со средой собирали и затем центрифугировали при 3500 об / мин. Супернатант (50 мкл) смешивали с равным объемом реагента, чтобы инициировать реакцию LDH. Оптическую плотность получали при 450 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов и рассчитывали активность ЛДГ.

Метод окрашивания AO / EB для наблюдения морфологии апоптоза

Флуоресцентный краситель АО / ЕВ использовали для оценки характеристик апоптозных клеток. Клетки PC12 и SH-SY5Y высевали в черные 12-луночные культуральные планшеты (предварительно покрытые коллагеном типа I) при плотности 3 × 10 ⁵ и 4 × 10 ⁵ клеток / лунка соответственно. После инкубации в течение 24 ч клетки предварительно инкубировали с различными концентрациями нанораствора донепезила ХР или свободного раствора донепезила в течение 2 ч. Затем в каждую лунку добавляли Aβ25-35 (конечная концентрация 20 мкМ). После лечения операции проводились по комплекту. Света избегали на протяжении всего эксперимента. Наконец, наблюдали морфологию клеток.

Метод окрашивания родамином 123 для определения потенциала митохондриальной мембраны

ММП измеряли с использованием флуоресцентного красителя родамин 123 (Rh123), проницаемого для клеток катионного красителя, который преимущественно распределяется в митохондриях из-за своих крайне отрицательных свойств. Клетки PC12 и SH-SY5Y высевали в черные 24-луночные культуральные планшеты (предварительно покрытые коллагеном типа I) при плотности 2 × 10 ⁵ и 3 × 10 ⁵ клеток / лунка соответственно. После инкубации в течение 24 ч клетки предварительно инкубировали с различными концентрациями нанораствора донепезила ХР или свободного раствора донепезила в течение 2 ч. Затем в каждую лунку добавляли Aβ25-35 (конечная концентрация 20 мкМ). После обработки клетки промывали PBS и инкубировали с 10 мкг / мл родамина 123 в течение 30 мин в темноте при 37 ° C. После инкубации клетки промывали 3 раза PBS и измеряли интенсивность флуоресценции при 488 нм и 510 нм с помощью считывающего устройства для флуоресцентных планшетов.

Статистическая обработка и анализ данных

Все эксперименты были повторены трижды, и результаты выражены как среднее значение ± стандартное отклонение. Использовалось статистическое программное обеспечение GraphPad Prism и односторонний дисперсионный анализ Стьюдента t test и другие методы использовались для статистического анализа. P <0,05 означает, что разница статистически значима.

Результаты

Характеристики наночастиц

КГП самоагрегируется с образованием наночастиц с гидрофобными ядрами, которые могут быть загружены ДЗП. Нагруженные DZP наночастицы КГП (DCN) с соотношением лекарственного средства и наноматериала 1:2, 1:5 и 1:10 были названы DCN1, DCN2 и DCN3. Согласно результатам сканирующей электронной микроскопии, наночастицы ГПК показали сферическую структуру, а после загрузки DZP DCN также были сферическими, как показано на рис. 1. Средний размер и дзета-потенциал наночастиц ГПК составляли 257 ± 3,05 нм и - 2,81 нм. ± 0,27 мВ соответственно. После загрузки DZP средние размеры составляли 273 ± 3,72, 260,7 ± 1,76 и 266,8 ± 4,56 нм, а дзета-потенциалы составляли -6,20 ± 0,40, -5,75 ± 0,64 и -9,30 ± 0,39 мВ для DCN1, DCN2 и DCN3 соответственно. , как показано в Таблице 1. Процент захвата лекарственного средства составлял 42,00 ± 5,65%, 86,54 ± 1,31% и 59,71 ± 4,43%, а процентное содержание лекарственного средства составляло 12,02 ± 1,90%, 13,42 ± 2,03% и 7,40 ± 1,72%, соответственно.

Изображения, полученные с помощью сканирующей электронной микроскопии ( a , a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3), распределение по размерам ( b a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) и дзета-потенциал ( c a-CHP, b-DCN1, c-DCN2, d-DCN3) наночастиц

Измерение ITC

Для DCN в течение всего процесса реакции реакция в основном показывала восходящий пик (рис. 2), и реакция была эндотермической, поскольку восходящий пик указывает на реакцию с выделением тепла. Следовательно, PS может самопроизвольно адсорбироваться на поверхности DCN. Сродство к PS составляло (14,7 ± 2,76) × 10 ⁴ . M ^-1 , (29,8 ± 1,66) × 10 ⁴ M ^-1 и (36,7 ± 3,84) × 10 ⁴ M ^-1 , а степень покрытия PS составила 2,65 ± 0,193, 2,70 ± 0,372 и 1,49 ± 0,434 для DCN1, DCN2 и DCN3 соответственно. Этот результат указывает на то, что PS адсорбируется на поверхности DCN с высоким сродством и имеет большую степень покрытия на DCN2. ∆H > 0 и ∆S > 0 указывает на то, что три частицы в основном были связаны гидрофобными взаимодействиями с ПС.

Данные изотермической калориметрии для титрования ПС (0,9 мМ) в a DCN1, b DCN2 и c Растворы DCN3 (0,02 мМ) при 25 ° C. Степень покрытия, сродство (KA), а также изменения энтальпии и энтропии для связывания ПС с наночастицами (НЧ) после титрования в растворы НЧ

Характеристика трех типов наночастиц

КГП НЧ и ДХН, полученные диализом, имели однородную сферическую форму (рис. 3а). Согласно вышеупомянутому исследованию, мы выбрали наночастицы DZP-CHP с соотношением лекарства к наноматериалам 1:5 в качестве объектов следующего эксперимента. Наночастицы DZP-CHP имели относительно однородный размер частиц 260,7 ± 1,76 нм, а индекс дисперсии составлял 0,196 ± 0,019. Хотя размер частиц оставался относительно стабильным после загрузки лекарственного средства, он резко увеличился до 335,2 ± 5,46 нм после адсорбции ПС. Дзета-потенциал наночастиц DZP-CHP составлял -0,66 ± 0,04 мВ, а после покрытия полисорбатом 80 дзета-потенциал упал до -2,22 ± 0,86 мВ (рис. 3b).

Характеристика различных наночастиц. а Фотография, полученная с помощью просвечивающей электронной микроскопии, АЭС ТЭЦ, б Фотография АЭС ДЗП-ТЭЦ, полученная с помощью просвечивающей электронной микроскопии, c Фотография НЧ ПС-ДЗП-ТЭЦ, полученная с помощью просвечивающей электронной микроскопии. B:Диаграмма размера частиц и диаграмма дзета-потенциала НЧ ТЭЦ-ДЗП (соотношение сырья 1:5) и НЧ ДЗП-ТЭЦ, модифицированных полисорбатом 80 (соотношение сырья 1:5)

Высвобождение наночастиц лекарством in vitro

Результаты показали, что по сравнению со свободным донепезилом, НЧ DZP-CHP и НЧ PS-DZP-CHP высвобождали DZP в течение 72 часов с очевидными эффектами контролируемого высвобождения. Быстрая скорость высвобождения нагруженных лекарством наночастиц может быть связана с быстрым растворением и высвобождением молекул лекарства, а затем замедление может быть вызвано снижением концентрации лекарства, на которое может повлиять только растворение и диффузия. Затем исследовали высвобождение лекарственного средства in vitro НЧ DZP-CHP, покрытых и не покрытых полисорбатом 80. Причина более медленного высвобождения НЧ PS-DZP-CHP может быть связана с сильной адсорбцией полисорбата 80 небольшими гидрофобными молекулярными лекарствами (рис. 4).

Кривые высвобождения лекарств in vitro для НЧ DZP, DZP-CHP (1:5) и PS-DZP-CHP

Эффект нацеливания наночастиц на мозг

Наблюдение за нацеливанием на мозг с использованием технологии визуализации живой флуоресценции

Мозг мышей, которым вводили свободную ICG, не демонстрировал флуоресценции, но мозги, которым вводили наночастицы, эмульгированные с PS, демонстрировали более сильную флуоресценцию в мозге, чем те, которым вводили неэмульгированные наночастицы, потому что обе наночастицы смогли достичь мозга после инъекции через хвостовую вену (рис. . 5а). Чтобы проверить это, мы вскрыли мышей через 30 минут после внутривенной инъекции растворов ICG-DZP-CHP и PS-ICG-DZP-CHP, удалили все органы, необходимые для исследования, а затем выполнили флюоресцентную визуализацию. Наночастицы PS-ICG-DZP-CHP проявляли сильную флуоресценцию в головном мозге, но не наблюдались в других органах (рис. 5b). Изображения показали, что наночастицы, модифицированные ФС, демонстрируют самую сильную флуоресценцию в ткани мозга, в то время как немодифицированные частицы демонстрируют слабую флуоресценцию. В ткани мозга мышей, которым вводили свободный ICG, флуоресценции не наблюдалось (рис. 5c).

Флуоресцентные изображения in vivo после введения различных растворов через хвостовую вену. а Флуоресцентные изображения целых животных, которым через хвостовую вену вводили 200 мкг / мл наночастиц DZP-CHP или PS-DZP-CHP, нагруженных ICG в качестве красителя. Свободный раствор ICG (интенсивность флуоресценции × 10 ⁹ ), b Наночастицы ICG-DZP-CHP (интенсивность флуоресценции × 10 ⁷ ), c Наночастицы ICG-DZP-CHP, модифицированные ФС (интенсивность флуоресценции × 109). б Флуоресцентные изображения различных органов после введения модифицированных ФС наночастиц ДЗП-ХП через хвостовую вену. c Fluorescence images of the brain after dissection. d Brain of mice injected with ICG-PS-DZP-CHP nanoparticles, e brain of mice injected with ICG-DZP-CHP nanoparticles modified with PS, f brain of mice injected with free ICG

Tissue Distribution of Nanoparticles in Mice

Donepezil was distributed in various tissues and mainly in the brain after injection of PS-DZP-CHP nanoparticles. Because it is metabolized through the kidney, the concentration of donepezil is very high in the kidney at certain times (Fig. 6a). In the brain, the concentration of free donepezil reached a peak in a very short time and then decreased rapidly. However, the concentration of donepezil nanoparticles reached a peak much more slowly and then decreased, especially nanoparticles modified with PS, which indicates a sustained-release effect with a delayed peak and prolonged retention time. Obviously, the nanoparticles improved the bioavailability of the drug (Fig. 6b).

а The concentration of donepezil in the brain, heart, liver and kidney at different times. б The concentrations of free DZP, DZP-CHP nanosolution and DZP-CHP nanosolution modified with PS in brain tissue at different times

MST Results

MST results showed that the thermal surge changed regularly with increasing ligand concentration, and the K_D value was 3.63 μM, indicating that the ligand effectively binds to the target protein, which verifies that PS can bind to Apo E and is relatively stable. After surface modification with PS, CHP nanoparticles can promote adsorption of Apo E, theoretically confirming that the nanoparticles we designed can specifically target brain tissue because the nanoparticles adsorbed Apo E, which may mediate passage through the blood–brain barrier (Fig. 7).

а Raw MST data. The fluorescently labeled molecules were observed for 5 s. At this time, the infrared laser was turned on, and a small part of the capillary tube was heated to 2–5 °C. The molecules migrated along a thermal gradient, resulting in changes in fluorescence intensity. When the infrared laser is turned off, the molecules diffuse along the concentration gradient. б The binding curve is generated by the difference between the initial fluorescence intensity and the intensity in the presence of heat, and the curve conforms to the standard 1:1 binding model

Establishment of a Nerve Injury Model Induced by Aβ_25–35

MTT tests were used to detect the effect of different concentrations of Aβ25-35 on the activity of PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 8a (i), Fig. 8b (i)], and the results showed that with increasing Aβ_25–35 concentration, PC12 and SH-SY5Y cell proliferation activity gradually decreased compared with that in the normal control group. When PC12 and SH-SY5Y cells were treated with 20 μM Aβ_25–35 , PC12 cell activity decreased to 49.5 ± 3.3% that observed in the control group (P  < 0.01), and SH-SY5Y cell activity decreased to 49.7 ± 0.8% (P  < 0.01). An LDH kit was used to detect the effect of different concentrations of Aβ_25–35 on LDH activity in both cell supernatants. Colorimetric tests showed that activity in both supernatants increased gradually with increasing Aβ25–35 concentration. After treatment of the cells with 20 μM Aβ_25–35 , PC12 cell LDH release increased to 359.3 ± 18.3% that in the control group (P  < 0.01), and SH-SY5Y cell LDH release increased to 360.0 ± 18.2% (P  < 0.01). Rhodamine 123 staining was used to detect the effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on the mitochondrial membrane potential in both cell lines [Fig. 8a (ii), b (ii)]. The test showed that the mitochondrial membrane potential in both cell lines decreased gradually with increasing Aβ_{25– 35} concentration (5, 10, 20, 40 μmol/L). Treatment of the cells with 20 μM Aβ_25–35 decreased the PC12 cell mitochondrial membrane potential to 51.3 ± 1.6% that in the control group (P  < 0.01); for SH-SY5Y cells, the MMP decreased to 47.9 ± 1.7% that in the control group (P  < 0.01).

Effects of different concentrations of Aβ_25–35 on injury to PC12 and SH-SY5Y cells. а , b The effect of different concentrations of Aβ_25–35 on the cell survival rate, LDH activity and cell mitochondrial membrane potential in PC12 cells and SH-SY5Y cells (*P  < 0.05, ** P < 0.01 vs control group). c The effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on damage to the morphology of PC12 cells:a control group, b Aβ_{25– 35} (5 μM) injury group, c Aβ_{25– 35} (10 μM) injury group, d Aβ_{25– 35} (20 μM) injury group, e Aβ_{25– 35} (40 μM) injury group. D:the effect of different concentrations of Aβ_{25– 35} on injury to the morphology of SH-SY5Y cells:f—control group, g Aβ_{25– 35} (5 μM) injury group, h—Aβ_{25– 35} (10 μM) injury group, i—Aβ_{25– 35} (20 μM) injury group, j—Aβ_{25– 35} (40 μM) injury group

Inverted fluorescence microscopy was used to observe morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells injured by different concentrations of Aβ_{25– 35} (Fig. 8c, d). The PC12 and SH-SY5Y cells in the control group had higher density, fusiform shapes, fuller cell bodies and longer protrusions. As the concentration of Aβ_{25– 35} increased (5, 10, 20, 40 μmol/L), the number of cells in both cell lines gradually decreased, the cell bodies shrank slightly, and the protrusions began to shrink sharply. When the concentration of Aβ_{25– 35} was increased to 40 μmol/L, the protrusions broke significantly, most of the cells contracted sharply, their shape became irregular, and some cells detached and became suspended in the solution.

Therefore, we treated PC12 and SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h to establish a nerve injury model.

Neuroprotective Effect of Drug-Loaded Nanoparticles (DZP-CHP)

MTT assays were used to detect the activity of different concentrations of DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) in PC12 and SH-SY5Y cells [Fig. 9a (i), b(i)]. Tests showed that treatment of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.4 ± 2.8% that in the control group (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (2.5 μM, 5 μM, 10 μM) solutions, the viability of PC12 cells increased significantly. The viability of PC12 cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0,05). Similarly, treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ_{25– 35} alone resulted in a significant reduction in cell viability to 48.5 ± 4.0% that in the control group (P  < 0.01), while after pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (2.5 μM, 5 μM, 10 μM, respectively), the viability of SH-SY5Y cells increased significantly. The viability of SH-SY5Y cells in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0,05).

Effect of DZP-CHP on Aβ25-35-injured PC12 and SH-SY5Y cells. а and b The effects of DZP-CHP on the cell survival rate, LDH activity, and mitochondrial membrane potential of PC12 and SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35 (#P  < 0.05, ## P  < 0.01 vs Aβ25-35 group; ▲ P < 0.05 vs DZP group). c The effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of PC12 cells injured by Aβ25-35; a—control group, b—Aβ25-35 injury group, c—DZP (5 µM), d—DZP -CHP (5 µM), e—DZP (10 µM), f—DZP-CHP (10 µM). D:the effect of DZP-CHP on the apoptosis morphology of SH-SY5Y cells injured by Aβ25-35; g—control group, h—Aβ25-35 injury group, i—DZP (5 µM), j—DZP-CHP (5 µM), k—DZP (10 µM), l—DZP-CHP (10 µM). E:red/green fluorescence ratio

LDH kits were used to detect the effects of different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) on the release of LDH from PC12 and SH-SY5Y cells into the culture medium [Fig. 9a (ii), b (ii)]. Colorimetric measurements showed that the release of LDH from PC12 cells that were exposed to 20 μM Aβ25-35 alone increased significantly by 355.1 ± 16.6% (P  < 0.01). In the presence of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from PC12 cells dropped significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P  < 0.01). Similarly, the release of LDH from SH-SY5Y cells exposed to 20 μM Aβ25-35 increased significantly to 357.8 ± 12.5% (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM), LDH release from SH-SY5Y cells decreased significantly. The effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0,05).

According to previous reports, depolarization of the MMP leads to loss of Rh123 from mitochondria, which in turn leads to a decline in intracellular fluorescence. Therefore, to characterize changes in the mitochondrial membrane potential in PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35, DZP, and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), rhodamine 123 was used for detection [Fig. 9a (iii), b (iii)]. The results showed that the fluorescence intensity of rhodamine 123 decreased significantly to 44.3 ± 3.8% (P  < 0.01) after incubation of PC12 cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM) solutions resulted in a significant increase in fluorescence intensity in a dose-dependent manner, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group (P <0,05). Similarly, after treatment of SH-SY5Y cells with 20 μM Aβ25-35 for 24 h, the fluorescence intensity of rhodamine 123 significantly decreased to 42.5 ± 4.6% (P  < 0.01). However, after pretreatment with DZP and DZP-CHP (5 μM, 10 μM), the fluorescence intensity increased significantly, and the effect in the DZP-CHP group was higher than that in the DZP group.

An AO-EB double staining kit was used to detect morphological changes of PC12 and SH-SY5Y cells treated with different concentrations of DZP and DZP-CHP (5 μM and 10 μM) (Fig. 9c, d). After AO-EB double staining, the nuclei of living cells presented green fluorescence under a fluorescence, and the fluorescence of apoptotic cells was orange-red; the higher the degree of apoptosis is, the brighter the fluorescence. Compared with the untreated control group, PC12 and SH-SY5Y cells treated with Aβ25-35 alone showed typical apoptotic characteristics, such as highly condensed and broken nuclei and obvious cell injury. However, pretreatment with DZP and DZP-CHP solution (5 μM and 10 μM) significantly inhibited cell damage and improved cell morphology.

Discussion

Although nanoparticles have been shown to be an effective delivery medium for nervous system diseases, the complexity of their structure and performance makes it challenging to detect and evaluate their physical–chemical properties and biological safety [34,35,36]. Therefore, after nanodrugs are designed, experiments to verify the safety and effectiveness of the nanomaterials at the cell and animal levels are extremely necessary. In the early laboratory stage, PS-DZP-CHP nanoparticles were successfully synthesized, and the optimal dosing ratio of the drug to CHP was set at 1:5. Due to the stable adsorption of PS to apolipoproteins ApoB and ApoE, brain targeting of nanoparticles can be achieved by permeation through the BBB [37]. The expected goal is that nanoparticles begin to decompose after reaching the brain; DZP is released and increases the concentration of cholinesterase; CHP reduces Aβ protein deposition and improves the brain environment; and administration frequency decreases because of the sustained release from nanoparticles [38,39,40,41].

Therefore, this study conducted an in vitro drug release test to assess the sustained release effect of nanoparticles. Compared with free DZP, nanoparticles achieved local sustained release in the brain, and PS can adsorb plasma proteins and reduce the loss of nanoparticles and prolong the release time to achieve a long cycle. After injection of ICG-labeled DZP-CHP and PS-DZP-CHP nanoparticles into rats, emulsified nanoparticles showed stronger fluorescence in the brain than those not emulsified with Tween 80. After organ biopsy, fluorescence imaging of various organs revealed that only the brain presented strong fluorescence, while other organs did not, indicating that nanoparticles did not release the drug until they reached the brain, which met the expected goal. In addition, nanoparticles modified with polysorbate 80 adsorbed ApoE to the surface and simulated low-density lipoprotein to bind to lipoprotein receptors on the surface of endothelial cells and enter the brain through LDLR induction [42, 43]. Moreover, the mechanisms by which nanoparticles regulate the tight junctions between endothelial cells and the inhibition of P-glycoprotein may produce a synergistic effect on their transcellular transport into the brain parenchyma [44]. However, since polysorbate 80 is prone to produce toxic substances, which cause untoward reactions, such as hypotension, dyspnea and shock, the dosage should be strictly controlled [45, 46]. Although a large number of nanodrugs have been developed for treatment of CNS diseases, most have shown poor effects [4]. In this study, we built a brain model of AD patients to evaluate the protective effect of nanoparticles on the brain. Because the toxicity of the Aβ protein to nerve cells varies with the concentration, it is better to screen an appropriate concentration to better simulate the brain environment of AD patients. The model was treated with DZP and DZP-CHP nanosolutions in advance to investigate the protective effect of DZP-CHP against PC12 and SH-SY5Y cell damage induced by Aβ25-35. The results showed that both solutions improved the cell proliferation activity caused by Aβ25-35, LDH release declined, and the mitochondrial potential rose. The inhibitory effect of the DZP-CHP nanosolution on cell damage induced by Aβ25-35 was significantly better than that of free DZP solution, and a concentration of 10 M DZP-CHP nanosolution proved to be the best, which may be due to the optimal drug concentration approach.

Basically, this study deduced the activity process of nanoparticles in vivo , verifying that PS-DZP-CHP nanoparticles have strong brain targeting, a good sustained release effect and a good AD therapeutic effect, thus demonstrating that they are clinically promising nanodrugs. The difficulty of treating the brain with medication has always been a major problem for researchers. The BBB leads to difficulty in curing CNS diseases, such as Parkinson's disease, brain tumors and brain stroke [47]. PS-DZP-CHP nanoparticles can effectively pass the BBB without destroying it, and DZP can be replaced as a model drug. Loading other drugs with high fat solubility and poor dissolution in vivo into the hydrophobic center of the NPs can not only increase brain targeting but also improve the water solubility of the drug. In addition, the design of CHP nanoparticle solutions is simple, and the drug dosage of the hydrophobic center can be flexibly controlled to ensure the best therapeutic effect while minimizing cytotoxicity [48, 49]. In future work, we will conduct in vivo research on DZP-CHP nanoparticles, such as evaluation of drug metabolism and side effects. These studies supplied a new strategy for brain drug delivery, and it is advantageous to clinical application of nanodrug with AD treatment.

Conclusion

DZP-CHP nanoparticles showed an optimal drug to nanomaterials dosing ratio of 1:5, which led to higher PS coverage and drug loading. DZP-CHP nanoparticles with PS adsorption exhibited slow release and significant brain targeting. Nanoparticle surface modification with PS can promote adsorption of Apo E and thus is vital for brain targeting. DZP-CHP nanoparticles had a protective effect on neurotoxicity and were superior to free donepezil.

Доступность данных и материалов

Not applicable.