Биоразлагаемые, реагирующие на опухоль наночастицы для дуальной модальности визуализации рака груди

Аннотация

Газонаполненные ультразвуковые (УЗ) контрастные агенты легко коллапсируют в организме, газ легко выходит, что ограничивает эффективность УЗ-визуализации. Для решения этой проблемы разработана инъекционная газогенерирующая мультимодальная система, несущая МР-негативный контрастный агент Fe₃O₄, флуоресцентный краситель Cy5.5 и донор CO₂ (Na₂CO₃). Наночастицы непрерывно генерируют углекислый газ (CO₂) в кислой опухолевой ткани в организме, давая опухоли сильный эхо-сигнал при ультразвуковой визуализации. Кроме того, наночастицы обеспечивают отличные эффекты для МР и флуоресцентной визуализации опухолевой ткани. Результаты показывают, что эта pH-реагирующая наночастичная система дает хорошие эффекты в МР/УЗ/флуоресцентной визуализации. Работа дает полезную референцию для мультимодальной визуализации опухолей.

Введение

В клинической практике микропузыри в основном применяются как УЗ-контрастные агенты для реального времени визуализации различных органов и сосудов [1–3]. Традиционные УЗ-контрастные агенты обычно состоят из липидов или белков, обрамляющих воздух или перфторуглероды. Газ в микросферах имеет низкую стабильность в крови и короткий полупериод из-за быстрой диффузии дефектов микропузырей [4–6]. Более того, размер газонаполненных микропузырей обычно велик (~1–8 мкм), что затрудняет проникновение в микросреду опухоли через экстравазацию тканей. Поэтому применение микронных пузырей в внутрисосудистой визуализации ограничено [7]. Идеальные УЗ-контрастные агенты должны иметь: оптимальный размер для транспорта через сосудистое пространство тканей, адекватную длительность акустического эффекта, хорошее таргетирование и биосовместимость, легкую экскрецию [8, 9]. Концепция «газогенерирующих наночастиц» предложена в предыдущих исследованиях, они имеют потенциал для УЗ-контрастной визуализации [10–12]. Эти наночастицы превосходят текущие газонаполненные микропузыри по производительности, непрерывно генерируемый газ обеспечивает интенсивную УЗ-визуализацию. Газогенерирующие наночастицы усиливают проникновение и удержание, стабильно циркулируют в крови и эффективно накапливаются в опухолевой ткани [13, 14].

Остается вызовом обнаружение крошечных и скрытых опухолей традиционными методами: МРТ, КТ, УЗ — ограничены длительным временем съема, высокой дозой излучения и низкой чувствительностью [15, 16]. Необходимо интегрировать разные методы визуализации и разрабатывать мультимодальные технологии для достижения интегральной синергии для раннего обнаружения рака [17–19]. Сверхпарамагнитные оксид железа (Fe₃O₄) наночастицы используются как негативные МР-контрастные агенты в T2-взвешенной визуализации [20, 21]. Fe₃O₄ имеет привлекательные свойства: малый размер, сильное проникновение, высокая намагниченность, хороший метаболизм, относительно низкая токсичность [22, 23]. Fe₃O₄ контрастные агенты для МРТ диагностики ранних стадий рака изучаются из-за высокой релаксации и контраста [24–26]. Кроме того, флуоресцентная визуализация в реальном времени имеет отличное разрешение и может быть ценным методом для определения стадии опухоли, направления резекции и мониторинга лечения [27, 28].

Здесь наночастицы в основном инкапсулированы поли(лактид-ко-гликолид) кислотой (PLGA), одобренной FDA как биобезопасный материал [29, 30]. PLGA частицы модифицированы RGD пептидом для связи с αvβ3 интегрином на поверхности клеток рака груди и Cy5.5 как флуоресцентный краситель для in vivo визуализации, инкапсулированы с Fe₃O₄ как T2-негативный контрастный агент в МРТ (Схема 1a). Из-за усиленного гликолиза в опухолевой ткани, дающего больше молочной кислоты и протонов во внеклеточной среде, pH опухолевых тканей (6,8–7,2) ниже нормальных (pH 7,4) [31–33]. Поэтому спроектировали карбонат натрия (Na₂CO₃) в PLGA для производства CO₂ пузырей при низком pH опухолевых тканей для УЗ-визуализации. Для верификации перспективного применения в визуализации опухолей комплексные свойства этих мультимодальных наночастиц для in vitro визуализации систематически охарактеризованы: цитотоксичность, таргетирующая специфичность и биодистрибуция в опухолевой ткани тремя модальностями визуализации.

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP

Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP спроектированы как RGD-таргетированные мультимодальные контрастные агенты инкапсуляцией биосовместимого полимера PLGA с Fe₃O₄ и Na₂CO₃ и интегрином-таргетирующим агентом через биоразлагаемую химическую связь (Схема 1b).

TEM показал (Рис. 1a), что наночастицы — четкие сферы с равномерно диспергированными частицами оксида железа в оболочке. Средний гидродинамический размер — 117,6 нм (динамическое световое рассеяние), полидисперсность — 0,234 (Рис. 1c). Зета-потенциал — –21,7 мВ (Рис. 1d). Флуоресцентный спектр: максимум эмиссии 685 нм — Cy5.5 успешно инкапсулирован в ядре PLGA (Рис. 1e). Насыщенная намагниченность Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD и свободных Fe₃O₄ NP: 32,6 и 42,5 эму/г (Рис. 1f) — сверхпарамагнитная характеристика при комнатной температуре. FTIR: N-H растяжение и –OH пик ~3432 см⁻¹. Усиление C=O растяжения 1628 см⁻¹. По сравнению с нетаргетированными NP, характерный пик карбоксила 1735 см⁻¹ таргетированных NP значительно снижен — подтверждает связывание карбоксил группы на поверхности микросферы с аминогруппой RGD пептида. In vitro связывание показано на Рис. 1f.

In vitro связывание Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP

αvβ3 интегрин высоко экспрессируется на эндотелиальных клетках опухоли рака груди и способствует метастазированию [33–36]. Клеточная иммунофлуоресценция экспрессии αv интегрина в MDA-MB-231 значительно выше, чем в MCF-7; A549 — положительный контроль (Рис. 2a). Клеточное поглощение NP изучали CLSM (Рис. 2b). Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP показали значительно более высокий уровень связывания с MD-MB-231, чем нетаргетированные NP. Флуоресцентные изображения показали, что NP связаны с цитоплазмой клетки, объединенные изображения показали те же локации, что и экспрессия αv интегрина [37, 38].

Цитотоксичность

In vitro цитотоксичность Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP оценивали CCK-8 на MDA-MB-231, A549 и MCF-7 как контролы (Рис. 2c). В диапазоне концентраций Fe 5–80 мкг/мл живучесть A549 и MB231 не снижалась значительно, оба >70%. Напротив, MCF-7 показали значительное снижение до ~50% при Fe >40 мкг/мл. CCK-8 показал, что NP демонстрируют значительно меньшую цитотоксичность в MDA-MB-231 в заданном диапазоне концентраций.

In vitro контрастная визуализация

Использовали 아가рообразный фантом для изучения производительности NP in vitro при разных pH (Рис. 3a). УЗ-контрастные изображения таргетированных NP значительно усилились при слабокислом pH (6,8) по сравнению с pH 7,2, вероятно, потому что pH 7,2 не производит достаточно CO₂ пузырей для УЗ. В слабокислой среде генерируется достаточно пузырей для УЗ. Эта характеристика релевантна опухолям с высокой тканевой гетерогенностью и разнообразными pH (6,8–7,2) in vivo [32, 39, 40]. Анализ интенсивности УЗ-сигнала (Рис. 3b): соотношения интенсивности нетаргетированных NP (pH 7), нетаргетированных NP (pH 5), таргетированных NP (pH 7), таргетированных NP (pH 5) относительно пустого образца: 112%, 145%, 167%, 178±4% — таргетированные NP при pH 5 дают самый сильный УЗ-сигнал.

Для in vitro МРТ: с увеличением Fe концентрации в NP T2-взвешенная интенсивность сигнала значимо снижается — возможность использования как T2 МР-контрастных агентов (Рис. 3c). Поперечная релаксация r2 NP = 19,597 мМ⁻¹с⁻¹. Хотя r2 ниже многих других сверхпарамагнитных МР-агентов, состав Fe₃O₄ увеличивает r2, который в 2,94 раза выше r2 клинически используемых SPIO частиц.

Ультразвуковая контрастная визуализация in vivo

Для демонстрации потенциала NP для УЗ-визуализации опухолей, ввенечно вводили Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP в нюд-мyx с ксенограммой рака груди, мониторили УЗ-изображения во времени (Рис. 4a). До инъекции записали изображения опухоли, печени, подкожной области. Сразу после инъекции область опухоли не показывала контрастного усиления. Усиление наблюдалось начиная с 30 мин и длилось 90 мин. In vivo УЗ результаты: NP генерируют достаточно пузырей в кислой опухолевой ткани для эхогенной отражательной способности УЗ. В контроле также получали изображения печени и подкожных тканей в разное время после инъекции таргетированных NP. В течение периода наблюдения в подкожной зоне инъекции не было значительного усиления, усиление в печени, уменьшавшееся во времени, было значительно ниже, чем в опухолях (Рис. 4b). Это указывает, что NP, циркулирующие в организме при физиологическом pH, не производят существенного количества CO₂ пузырей для УЗ-контраста.

МРТ в vivo

Для in vivo МРТ, чтобы показать, что NP могут использоваться для опухоль-специфической визуализации, Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP инъецировали напрямую в опухоли и мышцы. Результаты: область опухоли показала значительное снижение T2-МР контраста после инъекции таргетированных NP, интенсивность сигнала снизилась с 8875 при 0 мин до 5972 при 120 мин (Рис. 5a, b). При том же количестве NP в подкожной мышце T2 сигнал снижался гораздо меньше. Это демонстрирует эффективность NP с гиперчувствительным интегрином-таргетированным T2-МР контрастным агентом для опухоль-таргетированной визуализации. В группе в/в инъекции T2-МРТ также показал очевидное снижение контраста в опухоли через 24 ч после инъекции, демонстрируя высокое накопление NP в опухоли (Рис. 5c, d). Кроме того, снижение T2 сигналов наблюдалось в печени и почках, указывая, что ионы железа в NP могут быстро очищаться из организма. МРТ показал, что PLGA-обернутые Fe₃O₄ наночастицы демонстрируют эффективное пассивное таргетирование опухоли через эффект усиленного проникновения и удержания (EPR), особенно RGD-медированное таргетирование, но могут разлагаться и быстро экскретироваться in vivo.

Флуоресцентная визуализация и гистология

200 мкл NP в/в инъецировали в мышей для in vivo флуоресцентной визуализации. В группе с RGD-таргетированными NP флуоресцентный сигнал Cy5.5 постепенно увеличивался в области опухоли, достигая пика через 4 ч после инъекции — NP эффективно накапливаются в опухоли. В нетаргетированной группе NP распределялись по всему телу после инъекции и быстро очищались, не накапливались в опухоли долго (Рис. 6a). Мышей вскрывали, основные органы и опухоли собирали для in vitro флуоресцентной визуализации — высокое накопление таргетированных NP в опухоли (Рис. 6b, c). Флуоресцентная интенсивность Cy5.5 в опухолях мышей с таргетированными NP была в 1,5 раза выше, чем с нетаргетированными.

Далее, опухоль-специфическое таргетирование NP верифицировано тканевой флуоресцентной визуализацией замороженных срезов опухоли (Рис. 7a). Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов антителами к αv и β3 интегрину показало значительную экспрессию αvβ3 интегрина в опухолевых тканях. Флуоресценция αv и β3 интегрина объединили с флуоресценцией Cy5.5 NP для получения иммунообъединенного изображения, показывающего колокализацию. Иммунофлуоресценция в опухолевых тканях указала, что NP специфически связываются с αvβ3 интегрином в злокачественном раке груди MB231. Более того, H&E окрашивание NP по сравнению с нетаргетированной группой показало, что все срезы органов имели нормальную патологическую морфологию и никакого гистопатотического ущерба (Рис. 7b). Все результаты цитотоксичности и гистологического анализа указали, что NP не индуцируют значительной токсичности к основным органам in vivo, их хорошая биосовместимость можно обоснованно приписать PLGA.

Заключение

Результаты демонстрируют творческий и успешный подход для МРТ рака груди через магнитное таргетирование и газогенерирующую систему, активируемую в микросреде опухоли. Na₂CO₃/Fe₃O₄@PLGA/Cy5.5/RGD NP демонстрируют отличную визуализационную производительность и хорошую биосовместимость в МР/УЗ/флуоресцентных модальностях. Работа показывает сильный потенциал для диагностики опухолей с улучшенной мультимодальной визуализацией.

Материалы и методы

Реактивы

Поли(лактид-ко-гликолид) кислота (PLGA) (лактид:гликолид = 75:25, Mw = 20 000), краситель Cyanine5.5, поливиниловый спирт (PVA) — от Sigma-Aldrich (Shanghai, China). RGD пептид — кастомный синтез GenicBio BioTech Co. Ltd (Shanghai, China). Fe₃O₄ наночастицы и карбонат натрия (Na₂CO₃) — от Xian Ruixi Biological Technology Co. Ltd (Henan, China). Дихлорметан (CH₂Cl₂) и диметилсульфоксид (DMSO) — от Solarbio (Beijing, China). Все реактивы аналитическогоgrades.

Синтез Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD наночастиц

Сначала 12,5 мг PLGA и 0,25 мл хлороформа смешивали. Затем последовательно добавляли: 5 мкл Cy5.5, 15 мкл олеиновой кислотой модифицированных магнитных наночастиц в хлороформе (OA@Fe₃O₄, 10 мг/мл), 5 мкл Na₂CO₃, 1,5 мл 1% PVA раствора, эмульгировали ультразвуковым процессором 2 мин. Добавляли 12,5 мл 0,3% PVA раствора, перемешивали 3–4 ч при комнатной температуре, затем 12,5 мл 0,4% PVA раствора для перемешивания (500 об/мин) на ночь для удаления остаточного органического растворителя. Раствор подвергали нескольким ультрафильтрационным промывкам ddH₂O и разбавляли ФБ (pH 7,4) до конечного объема 1,25 мл. Добавляли 0,25 мг EDC и 1,25 мг NHS, перемешивали 30 мин при 25 °C, затем трижды промывали ультрафильтрацией и ресуспендировали в ФБ (pH 7,4). Добавляли 1,25 мг cRGD, перемешивали при 4 °C на ночь. Для удаления EDC, NHS и остаточного cRGD прозрачный раствор фильтровали ультрафильтрационной трубкой. Финально Fe₃O₄/Na₂CO₃@PLGA/Cy5.5/cRGD NP ресуспендировали в 1,25 мл деионизированной воды и хранили при 4 °C.

Характеристика наночастиц

Динамические диаметры и дзета-потенциал измеряли Zetasizer Nano-ZS (Malvern, UK). Морфологию — проходным электронным микроскопом FEI Tecnai F20. Загрузку Cy5.5 — флуоресцентным спектрометром Hitachi F-7000. FTIR — фурье-инфракрасным спектрометром (Alpha II, Bruker, Switzerland). Вибрирующий образцовый магнетометр (VSM, Lake Shore 7410) для гистерезисных кривых NP и свободных Fe₃O₄.

Клетки и животные

Человеческие клетки рака груди MDA-MB-231 — от Банка стволовых клеток, Китайская академия наук. Культура при 37 °C, 95% воздуха, 5% CO₂. Самки BALB/c (4 недели) — от Shanghai Slaccas Laboratory Animal Co. Ltd., содержание по протоколам, одобренным Центром лабораторных животных Guangxi Medical University. Эксперименты на животных следовали Руководству по уходу и использованию лабораторных животных, Этического комитета Центра лабораторных животных Guangxi Medical University. MDA-MB-231 трансплантировали в правый бок BALB/c (2×10⁶ в 200 мкл на мышь), выращивали 10–14 дней (средний диаметр 5 мм) до визуализации.

Клеточная экспрессия αv интегрина

Клеточная иммунофлуоресценция для подтверждения высокой экспрессии αv интегрина в MDA-MB-231. A549 и MCF-7 — контролы. Клетки посеяли на 35-мм стеклянных донных чашках (MatTek, USA) 2×10⁴ клеток/мл 24 ч. После инкубации фиксировали 4% параформальдегидом 20 мин при комнатной температуре. Инкубировали с кроличьим моноoclonalным антителом к интегрину αv (ab179475, Abcam) при 4 °C на ночь, анти-кроличьим IgG антителом 1 ч при комнатной температуре. Окрашивали DAPI. Изображения конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (TCS SP8, Leica, Germany).

Для оценки таргетирующей эффективности NP проводили исследование клеточного поглощения CLSM. Клетки посеяли аналогично. Инкубировали с RGD-таргетированными NP (30 мкг/мл, 0,5 мл) при pH 7,4 2 ч, нетаргетированные NP — контроль. После инкубации фиксировали 4% параформальдегидом 20 мин, инкубировали с αv антителом. Колокализацией верифицировали таргетированное связывание NP с интегрином на клетках.

CCK-8 анализ

Биосовместимость NP оценивали цитотоксичностью. MDA-MB-231, A549, MCF-7 посеяли в 96-ямчатые пластинки 5×10³ клеток/мл 24 ч. Добавляли 0,1 мл подвески NP при Fe концентрациях 5, 10, 20, 40, 80 мкг/мл, инкубировали 24 ч. Добавляли 10 мкл CCK-8, инкубировали еще 1 ч. Результаты микропластинчатым фототометром (Thermo Scientific, USA) при 450 нм.

Контрастная ультразвуковая визуализация

УЗ-визуализация NP на Vevo 2100 (Fujifilm Visual Sonics Inc., Canada). RGD-таргетированные и нетаргетированные NP добавляли в агарозную модель, PBS — контроль. Изображения в B-режиме и CEUS-режиме при pH буферах 7,2 и 6,8. Область интереса обводили, среднее серое значение измеряли в B-режиме.

Для in vivo УЗ: мыши анестезировали 2% изофлураном (Hebei Yipin Pharmaceutical Co., Ltd., China), температура тела 37 °C нагревательной подложкой. 200 мкл RGD-таргетированных NP в/в через хвостовую вену. Контроль — подкожная инъекция того же количества NP. УЗ-изображения 7-МГц преобразователем непрерывно для опухолей, печени, подкожных областей. Акустический фокус в центре опухоли с наибольшим поперечным сечением, поле зрения содержало опухоль и смежные ткани.

Магнитно-резонансная визуализация

МРТ NP на 3,0 T MR (GE Healthcare, USA) и животной катушке (RF TECH LIMITED, China). NP с разными Fe концентрациями (0,031–1 мМ) сканировали в 1 мл эппендорфовских трубках, PBS — контроль. T2 МРТ для каждой трубки T2-взвешенной FSE последовательностью (толщина среза 3 мм, TR/TE 2000/74,4 мс, FOV 8×8 см, матрица 320×256). Релаксативность (r2) линейной аппроксимацией обратного времени релаксации как функции Fe концентрации.

Для in vivo МРТ: мыши случайно в две группы (n=3): (1) локальная инъекция NP в подкожную мышцу и опухоль; (2) в/в инъекция NP. Базовые изображения до инъекции. Для группы 1: одинаковое количество NP в подкожную и опухоль, МРТ каждые 30 мин для записи перехода сигнала. Для группы 2: визуализация опухоли в аксиальных и корональных срезах, параметры МР как in vitro. Интенсивность сигнала (SI) в области интереса (ROI) измеряли и сравнивали с тканевыми сигналами в разное время до и после инъекции.

Опухоль флуоресцентная визуализация

Для in vivo флуоресцентной визуализации использовали систему (FX PRO, Bruker, Switzerland). Мыши случайно в две группы (n=3): (1) RGD-таргетированные NP; (2) нетаргетированные NP. Изображения каждые 30 мин 4 ч после инъекции. Затем важные органы и опухоли извлекали и визуализировали, наблюдали распределение флуоресценции в органах. Количественный анализ интенсивности флуоресценции молекулярным ПО (Bruker, Switzerland). Эти органы проходили H&E окрашивание для оценки токсичности тканей. Замороженные срезы опухолей также подвергали флуоресцентному иммуноокрашиванию с антителами к αv и β3 интегрину.

Доступность данных и материалов

Выводы рукописи основаны на данных, все представлены и показаны в этой работе.

Аббревиатуры

Cy5.5:

Сульфо-Cyanine5.5 NHS эфир

DAPI:

4′,6-диамидино-2-фенилиндол

EDC:

1-Этил-3-(3-диметиламинопропильный)карбодиимид гидрохлорид

FSE:

Быстрое спин-эхо (Fast spin echo)

MR:

Магнитно-резонанс (Magnetic resonance)

NHS:

N-гидроксисукцинимид

PB:

Фосфатный буфер (Phosphate buffer)

PBS:

Фосфатно-буферный раствор (Phosphate buffered saline)

PEG:

Полиэтиленгликоль (Polyethylene glycol)

PVA:

Поливиниловый спирт (Polyvinyl alcohol)

RGD:

Аргинин-глицин-аспарагин (Arginine–glycine–aspartate)

TE:

Время эха (Echo time)

TR:

Время повторения (Repetition time)