HER2-таргетированный магнитный наносенсибилайзер усиливает in vivo МРТ для HER2-позитивных раков

Аннотация

Цель этого исследования — разработка контрастного агента для магнитно-резонансной томографии (МРТ) с высокой магнитной чувствительностью, нацеленного на рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2). Аптамер-модифицированный анти-HER2 магнитный наносенсибилайзер (Apt_HER2-MNS) был приготовлен конъюгацией с 5′-тиол-модифицированными аптамерами и малеимидилрованными магнитными нанокристаллами (MNC). Физико-химические характеристики и таргетинговая способность Apt_HER2-MNS были подтверждены, а связывающая аффинность (K_d) к HER2 белку Apt_HER2-MNS составила 0,57 ± 0,26 нМ. In vivo способность усиливать МРТ-контраст также была верифицирована на ксенограффных моделях мышей с HER2+ раковыми клетками (NIH3T6.7) (n = 3) на 3Т клиническом МРТ сканере. Контрольный эксперимент проводился с немаркированными MNC. Результаты показали, что до 150% усиления контраста достигалось в области опухоли на T2-взвешенных МР-изображениях после инъекции Apt_HER2-MNS агента мышам, получившим клетки NIH3T6.7.

Введение

Рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), принадлежащий к семейству рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR), играет ключевую роль в человеческих злокачественностях и сверхэкспрессируется примерно в 30% раков груди у людей [1] и во многих других типах рака, включая желудочный, мочевой пузырь, яичниковый и легкие карциномы [1,2,3,4]. Пациенты с HER2-сверхэкспрессирующим раком груди имеют существенно более низкие показатели выживаемости, чем пациенты с не-сверхэкспрессирующими HER2 раками [5]. Кроме того, сверхэкспрессия HER2 приводит к увеличению метастазирования рака груди [6,7,8]. По этой причине HER2 служит важным биомаркером в диагностике рака. В клинической практике HER2 используется как типичный биологический маркер вместе с эстрогеновым рецептором (ER) и прогестероновым рецептором (PR) для диагностики рака груди. Таким образом, пациенты с раком груди получают окончательный диагноз после гистологической верификации уровней экспрессии HER2, ER и PR. Однако гистологическая верификация инвазивна и проводится только на ограниченном числе поражений. По этой причине различные исследования проводились для неинвазивной визуализации диагностических маркеров через рентгенологическое обследование до гистологической верификации на основе компьютерной томографии [9, 10], позитронно-эмиссионной томографии [11,12,13], однфотонной эмиссионной компьютерной томографии [14,15,16], магнитно-резонансной томографии (МРТ) [17,18,19,20] и мультимодальных инструментов визуализации [21,22,23].

Железооксидные наночастицы (IONP) используются в различных неинвазивных рентгенологических обследованиях для наблюдения клинически релевантных биомаркеров [24, 25]. IONP совместимы с молекулярной визуализацией, потому что они имеют более высокую магнитную чувствительность или биосовместимость, чем другие тяжело-металлические МРТ-контрастные агенты, такие как гадолиниевые контрастные агенты (GBCA) или никель- или кобальт-содержащие контрастные агенты. В частности, хотя коммерциализированные МРТ-контрастные агенты и GBCA ассоциированы с проблемами in vivo токсичности из-за выделения Gd³⁺ ионов, IONP-базированные МРТ-контрастные агенты имеют более высокую in vivo безопасность, чем GBCA, потому что они могут деградировать до железа, абсорбироваться или элиминироваться [26, 27].

Для применения IONP в молекулярной визуализации таргетинговые моети крайне важны и могут быть химическими, углеводными, белковыми, антителами или аптамерами [25, 28, 29]. Среди этих молекул аптамеры имеют стабильную трехмерную структуру однострандовой нуклеиновой кислоты, которая имеет высокую связывающую аффинность и специфичность к конкретным молекулам. Высокая связывающая аффинность аптамеров вызвана их техникой разработки и систематической эволюцией лигандов экспоненциальным обогащением (SELEX) [30]. SELEX использует очень большие библиотеки случайных последовательностей олигонуклеотидов (~10¹⁵), которые могут быть предоставлены химическим синтезом и скринированы параллельно для поиска аптамеров с высокой связывающей аффинностью к целевой молекуле. В результате SELEX аптамеры могут быть разработаны с высокой связывающей аффинностью пикомолярного уровня концентрации в общем, в то время как у других биомолекул она варьируется от микромолярного до субнаномолярного [31, 32]. В случае недавно разработанных третьего поколения аптамеров, они также имеют in vitro и in vivo стабильность благодаря улучшенной резистентности против ДНазы или РНазы за счет использования модифицированных нуклеиновых кислот [33, 34]. По этим причинам аптамеры возникают как предпочтительные моети в исследованиях молекулярной визуализации [35].

Целью этого исследования была разработка аптамер-модифицированного T2 контрастного агента на основе магнитных нанокристаллов (MNC) с высокой специфичностью к раковым клеткам, сверхэкспрессирующим HER2. Для достижения этой цели MNC, имеющие высокую магнитную чувствительность, были приготовлены методом термического разложения и использовался HER2-специфический аптамер (K_d = 0,42 нМ). Синтезированные контрастные агенты характеризовали, анализируя морфологию, магнитные свойства и магнитную релаксативность. Также мы провели in vitro и in vivo таргетинговые анализы против HER2 белков в модели ксенограффа опухоли, имплантированной с HER2-экспрессирующей раковой клеточной линией, соответственно.

Методы

Материалы

TWEEN® 80 (T80), 4-(диметиламино)пиридин, N,N'-дициклогексилкарбодиимид, триэтиламин, безводный дихлорметан, ацетилацетонат железа(III), 1,2-гексадекандиол, додекановая кислота, додетиламин и бензиловый эфир приобрели у Sigma-Aldrich (США), а 3-малеимидпропионовая кислота (MPA) — у TCI America (США). Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640), модифицированная среда Дюльбекко, фетальная бычья сыворотка и раствор Gibco® антибиотик-антимикотик приобрели у Life Technologies (США). NIH3T6.7 приобрели у American Tissue Type Culture (США). Вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (DEPC), приобрели у Biosesang Inc. (Корея). Тиолированный анти-HER2 аптамер [Apt_HER2, последовательность: 5′-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3′ (6: NapdU), 5′-SH модификация, 40-мер] приобрели у Aptamer Science Inc. (Корея).

Синтез MNC

Монодисперсные магнитные оксидные наночастицы железа синтезировали методом термического разложения Sun [36]. Эти магнитные наночастицы называются MNC из-за их предшественников ацетилацетоната железа(III) и олеиновой кислоты. Кратко, смесь ацетилацетоната железа(III) (2 ммоль), олеиновой кислоты (6 ммоль), 1-октадецена (6 ммоль), 1,2-гексадекандиола (10 ммоль) и бензилового эфира (20 мл) загружали в трехшейный круглый колбу и механически перемешивали. Для удаления остаточных молекул кислорода и воды смесь предварительно нагревали до 100 °C в течение 30 мин. Предварительно нагретую смесь затем нагревали до 200 °C в течение 2 ч и рефлюксировали при 300 °C в течение 30 мин под потоком азота. После охлаждения реактивов до комнатной температуры путем удаления источника тепла, реактивы очищали избыточным этиловым спиртом. Центрифугирование выполняли трижды для разделения продукта от недиспергированных остатков. Продукты Fe₃O₄ наночастиц затем передиспергировали в 5 мл гексана. Финальный продукт синтезировали повторением описанной выше процедуры с 100 мг Fe₃O₄ и его предшественниками. Морфологии MNC оценивали с помощью высокоразрешающего трансляционного электронного микроскопа (HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Япония). Насыщение намагниченности оценивали с помощью вибрирующего образцового магнитометра (VSM, MODEL-7300, Lakeshore, США) при комнатной температуре. Количество MNC в продукте анализировали путем измерения веса с помощью термогравиметрического анализатора (SDT-Q600, TA Instrument), и MNC вымывали до тех пор, пока содержание Fe₃O₄ не достигало примерно 80%.

Синтез Малеимидил-TWEEN® 80

Для приготовления малеимидил T80 (Tm80), 15,3 ммоль MPA и 22,9 ммоль N,N'-дициклогексилкарбодиимида растворяли в 10 мл дихлорметана соответственно, и затем смешивали. Смесь затем добавляли к 20 мл дихлорметана, содержащему 7,6 ммоль T80, за чем следовало добавление 3,2 мл триэтиламина в смесь. Наконец, 22,9 ммоль 4-(диметиламино) пиридина растворяли в 10 мл дихлорметана, и все реактивы смешивали в 70-ml флаконе. Финальная смесь перемешивали магнитом в течение 48 ч. Цвет смеси менялся от абрикосового на цвет красного вина. После реакции 48 ч кристаллизовавшийся мочевину удаляли фильтрацией. Для устранения дихлорметана реакцию фильтровали испарением в ротационном испарителе (N-1100, EYELA, Япония). Полученный продукт взвешивали в деионизированной воде, а неконъюгированные реактивы удаляли диализом (Spectra/Por®, 1 кДа MWCO, Spectrum Laboratory Inc., США). Финальный продукт приготовляли сублимационной сушкой. Синтезированный Tm80 подтверждали сравнением с MPA и T80 с помощью УФ-ВИС спектрометра (UV-1800, Shimadzu, Япония), Фурье-трансформ инфракрасного (FT-IR) спектрометра (PerkinElmer, spectrum two) и ¹H-ядерной магнитной резонансной (NMR) спектрометра (Bruker Biospin, Advance II, см. дополнительный файл 1: Рисунок S1).

Подготовка Малеимидил MNC

Вододиспергируемые малеимидил MNC (mWMNC) приготовили методом наноэмульсии [37]. Кратко, 100 мг Tm80 полностью растворяли в 20 мл деионизированной воды, и 4 мл n-гексана, содержащего 20 мг MNC, быстро впрыскивали в растворенную Tm80 воду с ультразвуком (190 Вт) и перемешиванием (1200 об/мин). Эмульсионный процесс продолжался 10 мин в ледяной бане. Оставшийся органический растворитель испаряли 12 ч при комнатной температуре, а продукты очищали диализом (Spectra/Por®, 3,5 кДа MWCO, Spectrum Laboratory Inc., США) для удаления избыточного ПАВ 3 дня. mWMNC затем концентрировали с помощью центрифугирующего фильтра (NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Германия) до 1,25 мг_Fe/мл в DEPC-обработанной воде. T80-обернутые MNC (WMNC) также приготовили тем же методом.

Подготовка Apt_HER2-MNS

Перед конъюгацией между mWMNC и анти-HER2 аптамерами проводили этап восстановления тиол-модифицированных аптамеров. Кратко, 1 нмоль аптамера растворяли в 0,3 мл деионизированной воды, и триэтиламинацетат и раствор 1,4-дитиотреитола добавляли, чтобы финальная концентрация была 50 и 25 ммоль соответственно. Эта смесь встряхивали при комнатной температуре 1,5 ч, и очищали и десалинизировали этаноловым осадком. Для приготовления Apt_HER2-MNS, HER2-специфического МРТ зонда, молекулярный вес MNC рассчитывали теоретически (см. дополнительный файл 1: Рисунок S2) и соотношение смеси mWMNC и аптамера назначали как 1:7. Поэтому 100 мкг (Fe) mWMNC (как Fe₃O₄, 45 пмоль) растворяли в PBS (1 мл) и добавляли 5 мкг (0,35 нмоль) аптамера. Смесь перемешивали при комнатной температуре 5 мин и инкубировали при 4 °C 2 ч. Распределение гидродинамического диаметра Apt_HER2-MNS затем анализировали с помощью динамического лазерного рассеяния (ELS-Z, Otsuka Electronics, Япония). Для подтверждения способности Apt_HER2-MNS как МРТ контрастного агента, анализ T2 релаксативности (R2) выполняли на 1,5 Т клиническом МРТ приборе с микро-47 поверхностной катушкой (Intera, Philips Medical System, Нидерланды) используя различные концентрированные фантомы Apt_HER2-MNS. R2 Apt_HER2-MNS измеряли последовательностью Карра-Перселла-Мейбума-Гилл (CPMG) при комнатной температуре: TR = 10 с, 32 эхо с 12 мс равномерным эхо-пространством, число усреднений = 1, точечное разрешение = 156 мкм × 156 мкм, толщина среза = 0,6 мм. R2 определяли как 1/T2 в единицах с⁻¹.

Анализ связывающей аффинности Apt_HER2-MNS

Для валидации HER2-специфичности Apt_HER2-MNS использовали метод связи нитроцеллюлозного фильтра [38]. Наглый Apt_HER2 и Apt_HER2-MNS дефосфорилировали с помощью щелочной фосфатазы (New England Biolabs, MA, США). 5′ или 3′ конец аптамеров маркировали T4 полинуклеотидной кинезой и [³²P]-ATP (Amersham Pharmacia Biotech, NJ, США) [39]. Связывающие анализы проводили инкубацией ³²P-маркированных аптамеров при концентрации 10 пМ с HER2 белком при концентрациях от 100 до 10 пМ в селекционном буфере (20 ммоль Tris·HCl, pH 7,5 при 4 °C, 6 ммоль NaCl, 5 ммоль 2-меркаптоэтанол, 1 ммоль Na₃EDTA, 10% v/v глицерол) при 37 °C в течение 30 мин. Смесь ³²P-маркированных аптамеров и HER2-белка фильтровали колонкой G-50 (GE Heathcare Life Science, UK) для удаления свободных радиоизотопов. Отфильтрованные смеси разрабатывали на многоразовой пленке, и фракции HER2-белка-связанных аптамеров kvantифицировали с помощью фосфоримагера (Fuji FLA-5100 Image Analyzer, Токио, Япония). Для устранения эффекта неспецифического фонового связывания радиомаркированного аптамера к нитроцеллюлозному фильтру, сырые данные связи корректировали проведением эксперимента только с ³²P-маркированными аптамерами.

In vivo МРТ

Все животные эксперименты проводили под одобрением Ассоциации по оценке и аккредитации лабораторных животных International. In vivo МРТ сканирование проводили используя сингеническую мышиную опухолевую модель, сгенерированную имплантацией клеток NIH3T6.7 (1,0 × 10⁷ клеток) в бедра 5-недельных самок BALB/c голых мышей. Через 2 недели размер опухоли оценивали МРТ. Когда размер опухоли достигал примерно 500 мм³, 100 мкг (5 мг/кг) Apt_HER2-MNS инъецировали в хвостовую вену. In vivo МРТ эксперименты выполняли используя 3,0 Т клинический МРТ прибор и 8-канальную человеческую запястную катушку. Для T2-взвешенной МРТ при 3,0 Т принимали следующие параметры: TR/TE = 1054/70 мс, число усреднений = 2, точечное разрешение = 400 × 319 мм, толщина среза = 1 мм TSE фактор = 8. Контрольные эксперименты проводили с WMNC тем же методом. Все T2 сигнальные интенсивности рассчитывали усреднением примерно пяти областей интереса (ROI), нарисованных на T2-взвешенных МР-изображениях каждой мышиной модели (n = 3), и значение R2 (или R2*), обратное значение T2, использовали в анализе сигнальной интенсивности. Изменения во времени относительной сигнальной интенсивности нормализовывали по начальной сигнальной интенсивности (до инъекции). Гистограммный анализ также проводили на R2 сигнальной интенсивности вокселя в ROI.

Гистологический анализ

Прусский синий окрас, который может использоваться для обнаружения Fe иона в тканях опухоли, проводили для подтверждения таргетинга Apt_HER2-MNS HER2-экспрессирующего рака после сбора ткани опухоли из каждой опухолевой модели после in vivo МРТ. Собранные ткани опухоли фиксировали в 10% формалиновом растворе 24 ч и встраивали в парафин после дегидратации увеличивающими концентрациями этанола и прояснении в Histo-Clear® (National Diagnotics, США). Прусский синий окрас проводили монтированием тканевых срезов (толщина = 5 мкм) на стеклянные слайды, депарафинизацией и гидратацией с использованием Histo-Clear® и концентрированных этанолов соответственно. После этого слайды помещали в рабочий раствор Прусского синего (10% ферроцианид калия и 20% соляная кислота = 1:1) на 1 ч. Ядра окрашивали ядерным быстрым красным окрасом (Sigma Aldrich, США). После промывки тканевых образцов трижды по 30 мин, добавляли 2–3 капли монтажного раствора на слайды и затем накрывали слайды стеклами. Окрашенные тканевые срезы наблюдали с использованием Olympus BX51 и Olyvia программного обеспечения (Olympus, Япония).

Результаты и обсуждение

Apt_HER2-MNS был спроектирован как одиночно-молекулярный таргетинговый агент на базе IONP для молекулярной визуализации HER2-экспрессирующих опухолей с использованием МРТ. Следовательно, Apt_HER2-MNS должен иметь высокую специфичность к целевой молекуле и большую магнитную восприимчивость. Для получения высокой магнитной чувствительности сначала MNC, монодисперсные Fe₃O₄ наночастицы, синтезировали методом термического разложения и метода роста семян [36]. Экспериментальная процедура приготовления и in vivo применения Apt_HER2-MNS описана на рис. 1. Во-первых, размер и форма MNC подтверждались HR-TEM (рис. 2a, b). На рис. 2c средний размер MNC измеряли случайным выбором 130 MNC из ТЭМ изображения, и наблюдали очень узкое распределение размеров (10,49 ± 1,74 нм) и сферическую форму. Сверхпарамагнитное свойство MNC также оценивали VSM, которое дало значение насыщения намагниченности MNC 98,8 эму/г_Fe (рис. 2d). T2 контрастный агент, который сейчас доступен внутривенным введением, основан на сверхпарамагнитных оксидах железа (SPIO) или ультрамалых сверхпарамагнитных оксидах железа (USPIO) [40]. SPIO или USPIO также имеют сверхпарамагнитные свойства, но у них значение насыщения намагниченности менее 70 эму/г_Fe [40,41,42,43]. Сверхпарамагнитное свойство необходимо для использования IONP как внутривенного контрастного агента, потому что оно заставляет IONP иметь магнитное свойство только когда они в магнитном поле, и предотвращает агломерацию IONP. Кроме того, более высокое значение насыщения намагниченности MNC может помочь снизить инъекционную дозу по сравнению с SPIO или USPIO-базированными контрастными агентами.

Для использования MNC в in vivo экспериментах WMNC и mWMNC приготовили методом наноэмульсии используя T80 или Tm80 соответственно. Физико-химические характеристики приготовленного Tm80 и его предшественников, MPA и T80, подтверждали абсорбцией, FT-IR, ¹H-NMR спектральным анализом (см. дополнительный файл 1: Рисунок S1). Как опубликовано ранее [44], mWMNC приготовленные методом наноэмульсии с использованием Tm80 стабильно диспергированы в воде. Кроме того, малеимидил группы mWMNC могут легко конъюгироваться с молекулой, имеющей нейтральный pH тиол группы, и эта конъюгация не генерирует никаких побочных продуктов. Кроме того, NapdU-модифицированный аптамер использовался для увеличения in vivo полужизни, и его полужизнь составляла 151 ч в человеческой сыворотке (см. дополнительный файл 1: Рисунок S3). Apt_HER2-MNS приготовили конъюгацией между mWMNC и Apt_HER2-SH, и гидродинамические свойства Apt_HER2-MNS оценивали динамическим лазерным рассеянием и МР релаксативностью (рис. 3). Диаметры WMNC и Apt_HER2-MNS составляли 28,8 ± 7,2 и 34,1 ± 8,2 нм соответственно (рис. 3a). Поскольку Apt_HER2 состоял из 40-мер олигонуклеотидов и был примерно 5–10 нм в длине, наличие Apt_HER2 могло вызывать разницу гидродинамического диаметра. Релаксативность WMNC и Apt_HER2-MNS составляла 265,7 и 257,2 мМ⁻¹_Fe с⁻¹ соответственно (рис. 3b), что оценивали для подтверждения их магнитной чувствительности как МРТ контрастного агента. В случае T2 контрастных агентов на базе SPIO или USPIO, которые одобрены FDA, они почти синтезировались методом ко-преципитации. По этой причине их кристалличность снижалась, что вызывало низкую релаксативность (менее 190 мМ⁻¹ _Fe с⁻¹) под магнитным полем [40]. Используя MNC в этом исследовании, Apt_HER2-MNS имел 35 ~ 500%-повышенную магнитную релаксативность по сравнению с SPIO- или USPIO-базированными T2 контрастными агентами.

Связывающая аффинность Apt_HER2-MNS к HER2 белку оценивали методом фильтрационной связи (рис. 4a), и полученные K_d значения Apt_HER2-SH и Apt_HER2-MNS измеряли как 26,88 ± 8,24 и 0,57 ± 0,26 нМ соответственно (рис. 4b, c). Apt_HER2-OH имеет очень высокую специфичность к HER2 белкам со значением K_d 0,42 ± 0,05 нМ, и эта связывающая аффинность примерно в 10 раз выше 5 нМ Herceptin® [45]. Однако связывающая аффинность наглого Apt_HER2 может измениться конъюгацией с химикатами, молекулами или наночастицами. Поэтому связывающая аффинность Apt_HER2 к HER2 белкам должна оцениваться после конъюгации с mWMNC. Связывающая аффинность Apt_HER2-SH к HER2 была снижена наличием тиол-группы а не наглым Apt_HER2, потому что тиол группа может связываться с другими тиол остатками в белках или других тиол-модифицированных аптамерах. Однако связывающая аффинность Apt_HER2-MNS измерялась как похожая на Apt_HER2, этот результат означает, что ни нет достаточного несвободного Apt_HER2-SH, который может прерывать взаимодействие между аптамером и HER2 белком, ни mWMNC не имеют никакого или очень малого влияния на связывающую аффинность аптамеров.

In vivo МРТ эксперименты проводили используя сингенические мышиные опухолевые модели для оценки способности Apt_HER2-MNS таргетить HER2-сверхэкспрессирующие опухоли. Используя опухолевую модель, сгенерированную имплантацией клеток NIH3T6.7 в бедро, МРТ эксперимент проводили от до-инъекции до 120 мин после инъекции WMNC или Apt_HER2-MNS (рис. 5, см. также дополнительный файл 1: Рисунок S4). T2 контрастное усиление эффектом IONP-базированных контрастных агентов наблюдается как потемнение изображения, потому что они индуцируют T2 сокращающий эффект вокруг протонов. Поэтому в анализах сигнальной интенсивности T2 или T2* значения представляли R2 или R2*. R2, обратное значение T2, используется для сравнения сигнальной интенсивности с положительным значением. В случае WMNC, наивысшая R2 сигнальная интенсивность наблюдалась 30 мин после инъекции WMNC, после чего она постепенно снижалась (рис. 5a, b). В 120 мин после инъекции WMNC, T2 сигнальная интенсивность напоминала до-инъекционное состояние. Темп изменения среднего значения R2 сигнальной интенсивности был менее 10%; таким образом, было трудно распознать на T2-взвешенном МР невооруженным глазом. В предыдущем исследовании демонстрировали, что T80-обернутые оксидные наночастицы железа накапливаются вокруг тканей опухоли несмотря на отсутствие любых таргетинговых моети [46]. Однако в том исследовании доза контрастного агента 1,4 мг_Fe на мышь использовалась в T2-взвешенной МРТ, что было в 14 раз выше дозы, использованной в этом исследовании. Это означает, что WMNC не могли показать эффективную эффективность усиления контраста в эксперименте при дозе 0,1 мг_Fe на мышь (5 мг_Fe/кг). Временной ряд изменения R2* сигнальной интенсивности также был менее 10%, и не было статистической значимости. В противовес, 120 мин после инъекции, Apt_HER2-MNS вызывал 130% более высокую интенсивность усиления сигнала, чем до инъекции Apt_HER2-MNS, несмотря на использование той же инъекционной дозы, что и WMNC (рис. 5c, d). Эта инъекционная доза была в 2-30 раз ниже, чем в других исследованиях об аптамер-модифицированных магнитных наночастицах-базированных контрастных агентах [44, 47, 48]. Этот результат указывал на то, что Apt_HER2-MNS имеет более высокую таргетинговую способность, чем либо WMNC или другие аптамер-модифицированные контрастные агенты, и также предполагал, что высокий эффект усиления контраста Apt_HER2-MNS может ожидаться даже при более низкой дозе, чем WMNC. Усиление контраста в основном появлялось в периферических сосудах и в центре ткани опухоли. Хотя периферические сосуды потемнели вскоре после инъекции Apt_HER2-MNS, усиление контраста в центре опухолевого поражения впервые появилось в 60 мин и тендовало увеличиваться до 120 мин.

Для подчеркивания видимого изменения в эффектах усиления контраста до и после инъекции Apt_HER2-MNS, гистограммный анализ R2 сигнальной интенсивности проводили в ROI на T2-взвешенных МР изображениях (рис. 5e). Поскольку T2 сигнал очевиден как негативное усиление в T2-взвешенных МР изображениях, он представлялся R2. После инъекции Apt_HER2-MNS центр гистограммы смещался вправо. Примерно 10% увеличение усиления контраста наблюдалось, когда разница центров гистограмм вычислялась.

Для подтверждения присутствия Apt_HER2-MNS в опухоли гистологически, Прусский синий окрас проводили (рис. 5f). В Прусский синий окрашенной ткани ядро и цитоплазма окрашивались как глубокий или светлый розовый цвет, и несколько синих точек наблюдались вокруг опухолевых клеток. Мы предполагали, что ткани опухоли окрашены в синий цвет, если Apt_HER2-MNS таргетит опухоль. В результатах Прусского синего окраса синие точки наблюдались в тканях опухоли, и тканевые слайды Apt_HER2-MNS имели примерно в 3 раза больше число синих точек, чем WMNC. Прусский синий окрас может детектировать Fe ион в тканях; таким образом, он использовался для подтверждения накопления контрастного агента на базе IONP в тканях опухоли [44, 49, 50].

Заключение

В заключение, мы подтвердили, что Apt_HER2-MNS работает как in vivo HER2-таргетируемый МРТ контрастный агент физико-химической характеристикой и in vivo МРТ экспериментами в HER2-экспрессирующих мышиных опухолевых моделях. Apt_HER2-MNS имеет высокую релаксативность и специфичность к HER2, и он продемонстрировал выраженные эффекты усиления контраста несмотря на более низкую администрированную дозу, чем другие T2 контрастные агенты, благодаря оксидным наночастицам железа. Этот контрастный агент ожидается предоставить информацию относительно экспрессии HER2 рака у пациентов с раком и может быть использован для мониторинга HER2+ пациентов с раком во время химиотерапии с использованием HER2-таргетированных лекарств. Мы ожидаем, что результаты этой работы предложат перспективную стратегию для диагностики HER2-сверхэкспрессирующего рака и для лечения пациентов.