Магнитный наносенсибилизатор, модифицированный аптамером для МРТ-визуализации HER2-экспрессирующего рака in vivo

Фон

Рецептор 2 эпидермального фактора роста человека (HER2), который принадлежит к семейству рецепторов эпидермального фактора роста (EGFR), играет ключевую роль в злокачественных новообразованиях человека и сверхэкспрессируется примерно в 30% случаев рака груди человека [1] и многих других типов рака. , включая рак желудка, мочевого пузыря, яичников и легких [1,2,3,4]. Пациенты с раком молочной железы с гиперэкспрессией HER2, как правило, имеют значительно более низкие показатели выживаемости, чем пациенты с раком без сверхэкспрессии HER2 [5]. Кроме того, сверхэкспрессия HER2 приводит к увеличению метастазов рака груди [6,7,8]. По этой причине HER2 служит важным биомаркером при диагностике рака. В клинических условиях HER2 используется в качестве типичного биологического маркера вместе с рецептором эстрогена (ER) и рецептором прогестерона (PR) для диагностики рака груди. Таким образом, пациенты с раком груди получают точный диагноз после гистологической проверки уровней экспрессии HER2, ER и PR. Однако гистологическая проверка является инвазивной и проводится только при ограниченном количестве поражений. По этой причине были проведены различные исследования для неинвазивной визуализации диагностических маркеров с помощью радиологического исследования перед гистологической проверкой на основе компьютерной томографии [9, 10], позитронно-эмиссионной томографии [11,12,13], однофотонной эмиссионной компьютерной томографии. [14,15,16], магнитно-резонансная томография (МРТ) [17,18,19,20] и средства мультимодальной визуализации [21,22,23].

Наночастицы оксида железа (IONP) используются в различных неинвазивных радиологических исследованиях для наблюдения за клинически значимыми биомаркерами [24, 25]. IONP совместимы с молекулярной визуализацией, поскольку они обладают более высокой магнитной чувствительностью или биосовместимостью, чем другие контрастные вещества для МРТ на основе тяжелых металлов, такие как контрастные вещества на основе гадолиния (GBCA) или никель- или кобальтсодержащие контрастные вещества. В частности, хотя коммерческие контрастные вещества для МРТ и GBCA связаны с проблемами, связанными с токсичностью in vivo из-за высвобождения Gd ³⁺ ионов, контрастные вещества для МРТ на основе IONP обладают более высокой безопасностью in vivo, чем GBCA, поскольку они могут расщепляться до железа, абсорбироваться или выводиться [26, 27].

Для применения IONP для молекулярной визуализации чрезвычайно важны целевые группы, которые могут быть химическими веществами, углеводами, белками, антителами или аптаперами [25, 28, 29]. Среди этих молекул аптамеры имеют стабильную трехмерную структуру однонитевой нуклеиновой кислоты, которая имеет высокое сродство связывания и специфичность по отношению к конкретным молекулам. Высокое сродство связывания аптамеров обусловлено их методикой разработки и систематической эволюцией лигандов путем экспоненциального обогащения (SELEX) [30]. SELEX использует очень большие библиотеки олигонуклеотидов со случайной последовательностью (~ 10 ¹⁵ ) можно получить путем химического синтеза и провести параллельный скрининг для поиска аптамеров, которые обладают высокой аффинностью связывания с молекулой-мишенью. В результате SELEX могут быть разработаны аптамеры с высокой аффинностью связывания с пикомолярным уровнем концентрации, в то время как у других биомолекул он находится в диапазоне от микромоля до субнаномоля [31, 32]. В случае недавно разработанных аптамеров третьего поколения они также обладают стабильностью in vitro и in vivo благодаря их повышенной устойчивости к ДНКазе или РНКазе за счет использования модифицированных нуклеиновых кислот [33, 34]. По этим причинам аптамеры становятся предпочтительными компонентами в исследованиях молекулярной визуализации [35].

Целью данного исследования была разработка модифицированного аптамером контрастного вещества Т2 на основе магнитных нанокристаллов (МНК) с высокой специфичностью к раковым клеткам, сверхэкспрессирующим HER2. Для достижения этой цели МНК, обладающие высокой магнитной чувствительностью, были приготовлены методом термического разложения и HER2-специфическим аптамером ( K _d =0,42 нМ). Синтезированные контрастные вещества охарактеризованы путем анализа морфологии, намагниченности и магнитной релаксации. Кроме того, мы провели тесты нацеливания in vitro и in vivo против белков HER2 на животной модели ксенотрансплантата опухоли, имплантированной линией раковых клеток, экспрессирующей HER2, соответственно.

Методы

Материалы

TWEEN® 80 (T80), 4- (диметиламино) пиридин, N , N '-Дициклогексилкарбодиимид, триэтиламин, безводный дихлорметан, ацетилацетонат железа (III), 1,2-гексадекандиол, додекановая кислота, додециламин и бензиловый эфир были приобретены у Sigma-Aldrich (США), а 3-малеимидопропионовая кислота (MPA) была приобретена у TCI America (США). Roswell Park Memorial Institute (RPMI-1640), модифицированная Дульбекко среда Игла, фетальная бычья сыворотка и раствор антибиотик-антимикотик Gibco® были приобретены у Life Technologies (США). NIH3T6.7 был приобретен в American Tissue Type Culture (США). Вода, обработанная диэтилпирокарбонатом (DEPC), была приобретена у Biosesang Inc. (Корея). Тиолированный аптамер против HER2 [Apt _HER2 , последовательность:5'-6CC 6GG CA6 G66 CGA 6GG AGG CC6 66G A66 ACA GCC CAG A-3 '(6:NapdU), модификация 5'-SH, 40-мерный] был приобретен у Aptamer Science Inc. (Корея).

Синтез MNC

Монодисперсные магнитные наночастицы оксида железа были синтезированы методом термического разложения Сан [36]. Эти магнитные наночастицы называют МНК из-за их предшественников ацетилацетоната железа (III) и олеиновой кислоты. Вкратце, смесь ацетилацетоната железа (III) (2 ммоль), олеиновой кислоты (6 ммоль), 1-октадецена (6 ммоль), 1,2-гексадекандиола (10 ммоль) и бензилового эфира (20 мл) загружали в трехгорлую круглодонную колбу и механическое перемешивание. Для удаления остаточных молекул кислорода и воды смесь предварительно нагревали до 100 ° C в течение 30 мин. Затем предварительно нагретую смесь нагревали до 200 ° C в течение 2 часов и кипятили с обратным холодильником при 300 ° C в течение 30 минут в токе азота. После охлаждения реагентов до комнатной температуры путем удаления источника тепла реагенты очищали избытком этилового спирта. Центрифугирование проводили в трех экземплярах, чтобы отделить продукт от любого недиспергированного остатка. Fe ₃ О ₄ Затем продукты в виде наночастиц повторно диспергировали в 5 мл гексана. Конечный продукт синтезировали, повторяя описанную выше процедуру с 100 мг Fe ₃ . О ₄ и его предшественники. Морфологию МНК оценивали с помощью просвечивающего электронного микроскопа высокого разрешения (HR-TEM, JEM-2100, JEOL Ltd., Япония). Насыщение намагниченности оценивали с помощью магнитометра с вибрирующим образцом (VSM, MODEL-7300, Lakeshore, США) при комнатной температуре. Количество МНК в продукте анализировали путем измерения веса с помощью термогравиметрического анализатора (SDT-Q600, TA Instrument), и МНК промывали до содержания Fe ₃ О ₄ достигла примерно 80%.

Синтез малеимидил-ТВИН ^® 80

Для приготовления малеимидила T80 (Tm80) 15,3 ммоль МПА и 22,9 ммоль N , N '-Дициклогексилкарбодиимид растворяли в 10 мл дихлорметана, соответственно, и затем смешивали. Затем смесь добавляли к 20 мл дихлорметана, содержащего 7,6 ммоль Т80, с последующим добавлением к смеси 3,2 мл триэтиламина. Наконец, 22,9 ммоль 4- (диметиламино) пиридина растворяли в 10 мл дихлорметана, и все реагенты смешивали в сосуде на 70 мл. Конечную смесь перемешивали с помощью магнита в течение 48 часов. Цвет смеси изменился с абрикосового на винно-красный. После реакции в течение 48 часов кристаллизованную мочевину удаляли фильтрацией. Для удаления дихлорметана реакционную смесь фильтровали упариванием в роторном испарителе (N-1100, EYELA, Япония). Полученный продукт суспендировали в деионизированной воде, и неконъюгированные реагенты удаляли диализом (Spectra / Por®, MWCO 1 кДа, Spectrum Laboratory Inc., США). Конечный продукт был приготовлен сублимационной сушкой. Синтезированный Tm80 был подтвержден сравнением с MPA и T80 с использованием УФ-видимого спектрометра (UV-1800, Shimadzu, Япония), инфракрасного спектрометра с преобразованием Фурье (FT-IR) (PerkinElmer, спектр два) и ¹ Спектрометр H-ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (Bruker Biospin, Advance II, см. Дополнительный файл 1:Рисунок S1).

Получение МНК малеимидила

Диспергируемые в воде малеимидиловые МНК (мМНК) получали методом наноэмульсии [37]. Вкратце, 100 мг Tm80 было полностью растворено в 20 мл деионизированной воды, и 4 мл н-гексана, содержащего 20 мг MNC, быстро впрыснули в воду, растворенную в термически растворенном Tm80, с обработкой ультразвуком (190 Вт) и перемешиванием (1200 об / мин). Процесс эмульсии продолжался 10 мин на ледяной бане. Оставшийся органический растворитель выпаривали в течение 12 ч при комнатной температуре, и продукты очищали диализом (Spectra / Por®, MWCO 3,5 кДа, Spectrum Laboratory Inc., США) для удаления избытка поверхностно-активного вещества в течение 3 дней. Затем mWMNC концентрировали с использованием центробежного фильтра (NMWL 3000, Amicon® Ultra, Merk Milipore Ltd., Германия) до 1,25 мг _Fe / мл в воде, обработанной DEPC. MNC с оболочкой T80 (WMNC) также были приготовлены с использованием того же метода.

Подготовка Apt _HER2 -MNS

Перед конъюгацией между mWMNC и анти-HER2-аптамерами проводили стадию восстановления тиол-модифицированных аптамеров. Вкратце, 1 нмоль аптамера растворяли в 0,3 мл деионизированной воды и добавляли раствор триэтиламинацетата и 1,4-дитилтретола, при этом конечная концентрация составляла 50 и 25 мМ соответственно. Эту смесь встряхивали при комнатной температуре в течение 1,5 ч, очищали и обессоливали осаждением этанолом. Для подготовки Apt _HER2 -MNS, HER2-специфический МРТ-зонд, молекулярная масса MNC была рассчитана теоретически (см. Дополнительный файл 1:Рисунок S2), а соотношение mWMNC и аптамера в смеси было обозначено как 1:7. Следовательно, 100 мкг (Fe) мМНК (в виде Fe ₃ О ₄ , 45 пмоль) растворяли в PBS (1 мл) и добавляли 5 мкг (0,35 нмоль) аптамера. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 5 минут и инкубировали при 4 ° C в течение 2 часов. Распределение гидродинамического диаметра Apt _HER2 -MNS затем анализировали с использованием анализатора динамического лазерного рассеяния (ELS-Z, Otsuka Electronics, Япония). Для подтверждения способности Apt _HER2 -MNS в качестве контрастного вещества для МРТ, анализ релаксации T2 (R2) выполняли с помощью клинического прибора MRI 1,5 Тл с поверхностной катушкой micro-47 (Intera, Philips Medical System, Нидерланды) с использованием различных концентрированных фантомов Apt _HER2 -MNS. R2 объекта Apt _HER2 -MNS измеряли с использованием последовательности Карра-Перселла-Мейбума-Гилла (CPMG) при комнатной температуре:TR =10 с, 32 эхо-сигнала с четным пространством эхо-сигналов 12 мс, количество захватов =1, разрешение точки =156 мкм × 156 мкм, и толщиной сечения =0,6 мм. R2 был определен как 1 / T2 с s ⁻¹ ед.

Apt _HER2 -Аффинность связывания MNS

Для подтверждения HER2-специфичности Apt _HER2 -MNS, использовался метод связывания нитроцеллюлозным фильтром [38]. Голый Апт _HER2 и Apt _HER2 -MNS дефосфорилировали с использованием щелочной фосфатазы (New England Biolabs, MA, США). 5'- или 3'-конец аптамеров был помечен полинуклеотидкиназой Т4 и [ ³² P] -АТФ (Amersham Pharmacia Biotech, Нью-Джерси, США) [39]. Анализы связывания проводили путем инкубации ³² Р-меченые аптамеры в концентрации 10 пМ с белком HER2 в концентрациях от 100 до 10 пМ в буфере для отбора (20 мМ Трис · HCl, pH 7,5 при 4 ° C, 6 мМ NaCl, 5 мМ 2-меркаптоэтанол, 1 мМ Na ₃ ЭДТА, 10% об. / v глицерин) при 37 ° C в течение 30 мин. Смесь ³² Р-меченые аптамеры и белок HER2 фильтровали на колонке G-50 (GE Heathcare Life Science, UK) для удаления свободных радиоизотопов. Отфильтрованные смеси проявляли на многоразовой пленке, и фракции аптамеров, связанных с белком HER2, определяли количественно с использованием фосфорного сканера (Fuji FLA-5100 Image Analyzer, Токио, Япония). Чтобы исключить эффект неспецифического фонового связывания радиоактивно меченного аптамера с нитроцеллюлозным фильтром, исходные данные связывания были скорректированы путем проведения эксперимента с использованием ³² Только P-меченые аптамеры.

МРТ In Vivo

Все эксперименты на животных проводились с одобрения Ассоциации по оценке и аккредитации Международной организации по уходу за лабораторными животными. Сканирование МРТ in vivo проводили с использованием сингенной модели опухоли мыши, которая была создана путем имплантации клеток NIH3T6.7 (1,0 × 10 ⁷ клетки) в бедра 5-недельных самок бестимусных мышей BALB / c. Через 2 недели размер опухоли оценивали с помощью МРТ. Когда размер опухоли достигал примерно 500 мм ³ , 100 мкг (5 мг / кг) Apt _HER2 -МНС был введен в хвостовую вену. Эксперименты МРТ in vivo проводились с использованием клинического прибора МРТ 3,0 Тл и 8-канальной катушки для запястья человека. Для T2-взвешенной МРТ при 3,0 Тл были приняты следующие параметры:TR / TE =1054/70 мс, количество захватов =2, разрешение точки =400 × 319 мм, толщина среза =1 мм, коэффициент TSE =8. Контрольные эксперименты проводились с использованием WMNC по той же методике. Все интенсивности сигналов T2 были рассчитаны путем усреднения приблизительно пяти областей интереса (ROI), нарисованных на T2-взвешенных МРТ-изображениях каждой модели мыши ( n =3), а значение R2 (или R2 *), обратное значение T2, использовалось при анализе интенсивности сигнала. Изменения во времени относительной интенсивности сигнала нормализовали по начальной интенсивности сигнала (предварительная инъекция). Также был проведен анализ гистограммы интенсивности сигнала R2 вокселя в области интереса.

Гистологический анализ

Окрашивание берлинской лазурью, которое можно использовать для обнаружения иона Fe в опухолевых тканях, было проведено для подтверждения Apt _HER2 -MNS-нацеливание на HER2-экспрессирующий рак после сбора опухолевой ткани из каждой модели опухоли после МРТ in vivo. Собранные опухолевые ткани фиксировали в 10% растворе формалина в течение 24 ч и заливали парафином после обезвоживания в увеличивающихся концентрациях этанола и осветления в Histo-Clear® (National Diagnotics, США). Окрашивание берлинской лазурью проводили путем нанесения срезов ткани (толщиной 5 мкм) на предметные стекла с последующей депарафинацией и гидратацией с использованием Histo-Clear® и концентрированных этанолов соответственно. После этого предметные стекла помещали в рабочий раствор берлинской синей (10% -ный раствор ферроцианида калия и 20% -ный раствор соляной кислоты =1:1) на 1 час. Ядра окрашивали красителем Nuclear Fast Red (Sigma Aldrich, США). После трехкратной промывки образцов ткани в течение 30 мин мы добавляли 2–3 капли фиксирующего раствора на предметные стекла, а затем покрывали предметные стекла покровными стеклами. Окрашенные срезы ткани наблюдали с использованием программного обеспечения Olympus BX51 и Olyvia (Olympus, Япония).

Результаты и обсуждение

Кв. _HER2 -MNS был разработан как нацеленный на одну молекулу агент на основе IONP для молекулярной визуализации опухолей, экспрессирующих HER2, с использованием МРТ. Следовательно, Apt _HER2 -MNS должен обладать высокой специфичностью к целевой молекуле и большой магнитной восприимчивостью. Для получения высокой магнитной чувствительности, во-первых, МНК, монодисперсный Fe ₃ О ₄ наночастицы были синтезированы методом термического разложения и роста семян [36]. Экспериментальная методика приготовления и применения Apt _HER2 in vivo -MNS был описан на рис. 1. Во-первых, размер и форма MNC были подтверждены с помощью HR-TEM (рис. 2a, b). На рис. 2с средний размер МНК был измерен путем случайного выбора 130 МНК из изображения ПЭМ, и наблюдались очень узкое распределение по размерам (10,49 ± 1,74 нм) и сферическая форма. Суперпарамагнитные свойства МНК также были оценены с помощью VSM, которая дала значение намагниченности насыщения МНК 98,8 ЭМЕ / г _Fe (Рис. 2d). Контрастное вещество Т2, которое в настоящее время доступно для внутривенных инъекций, было основано на суперпарамагнитных оксидах железа (SPIO) или сверхмалых суперпарамагнитных оксидах железа (USPIO) [40]. SPIO или USPIO также обладают суперпарамагнитными свойствами, но имеют значение намагниченности насыщения менее 70 emu / g _Fe [40,41,42,43]. Суперпарамагнитное свойство необходимо для использования IONP в качестве внутривенного контрастного вещества, потому что оно заставляет IONP иметь магнитные свойства только тогда, когда они находятся в магнитном поле, и предотвращает агрегацию IONP. Кроме того, более высокое значение намагниченности насыщения МНК может быть полезным для снижения дозы инъекции, чем контрастные вещества на основе SPIO или USPIO.

Схематическое изображение, показывающее экспериментальную процедуру приготовления модифицированного аптамером магнитного наносенсибилизатора (Apt _HER2 -MNS) и оценка их способности к визуализации in vivo

Результат морфологической и магнитной характеристики МНК. а ТЕМ изображение. б Увеличенное изображение ПЭМ. c Измерение распределения размеров по ПЭМ-изображению (общее количество 100). г График намагничивания

Чтобы использовать MNC для экспериментов in vivo, WMNC и mWMNC были приготовлены методом наноэмульсии с использованием T80 или Tm80, соответственно. Физико-химические характеристики полученного Tm80 и его предшественников, MPA и T80, были подтверждены с помощью оптической плотности FT-IR, ¹ Спектральный анализ H-ЯМР (см. Дополнительный файл 1:Рисунок S1). Как было опубликовано ранее [44], mWMNCs, полученные методом наноэмульсии с использованием Tm80, стабильно диспергированы в воде. Кроме того, малеимидильные группы mWMNC могут быть легко конъюгированы с молекулой, которая имеет тиоловые группы с нейтральным pH, и эта конъюгация не дает никаких побочных продуктов. Кроме того, аптамер, модифицированный NapdU, использовался для увеличения периода полужизни in vivo, и его период полужизни составлял 151 час в сыворотке крови человека (см. Дополнительный файл 1:рисунок S3). Кв. _HER2 -MNS получали конъюгацией между mWMNC и Apt _HER2 -SH и гидродинамические свойства Apt _HER2 -MNS были оценены с использованием динамического лазерного рассеяния и анализа релаксации MR (рис. 3). Диаметры WMNC и Apt _HER2 -MNS были 28,8 ± 7,2 и 34,1 ± 8,2 нм соответственно (рис. 3а). Поскольку Apt _HER2 состоит из 40-мерных олигонуклеотидов и имеет длину примерно 5-10 нм, присутствие Apt _HER2 может вызвать разницу в гидродинамическом диаметре. Релаксивность WMNC и Apt _HER2 -MNS было 265,7 и 257,2 мМ ^-1 _Fe s ⁻¹ соответственно (рис. 3b), что было оценено для подтверждения их магнитной чувствительности в качестве контрастного агента для МРТ. В случае контрастных агентов T2 на основе SPIO или USPIO, одобренных FDA, они были почти синтезированы методом соосаждения. По этой причине их кристалличность была снижена, что привело к низкой релаксивности (менее 190 мМ ⁻¹ _Fe s ⁻¹ ) в магнитном поле [40]. Используя MNC в этом исследовании, Apt _HER2 -MNS имел на 35 ~ 500% увеличенную магнитную релаксацию, чем контрастные вещества T2 на основе SPIO или USPIO.

Характеристика WMNC и Apt _HER2 -MNS для использования в качестве контрастного вещества для МРТ in vivo. а гидродинамический диаметр ( n =5, WMNC 28,8 ± 7,2 нм, Apt _HER2 -МНС 34,1 ± 8,2 нм). б График анализа релаксации ( n =3, WMNC R ² =265,7 мМ ⁻¹ s ⁻¹ , R ² =0.99 и Apt _HER2 -MNS R ² =257,2 мМ ⁻¹ s ⁻¹ , R ² =0,99)

Сродство связывания Apt _HER2 -MNS для белка HER2 оценивали с помощью анализа связывания с фильтром (рис. 4a), и полученный результат K _d значения Apt _HER2 -SH и Apt _HER2 -MNS были измерены как 26,88 ± 8,24 и 0,57 ± 0,26 нМ, соответственно (рис. 4b, c). Кв. _HER2 -OH имеет очень высокую специфичность для белков HER2 с K _d значение 0,42 ± 0,05 нМ, и это сродство связывания примерно в 10 раз выше, чем 5 нМ Герцептина® [45]. Однако сродство связывания голого Apt _HER2 могут быть изменены путем конъюгации с химическими веществами, молекулами или наночастицами. Следовательно, аффинность связывания Apt _HER2 белки HER2 следует оценивать после конъюгации с mWMNC. Сродство связывания Apt _HER2 -SH для HER2 был снижен присутствием тиоловой группы, а не голым Apt _HER2 потому что тиоловая группа может быть связана с другим тиоловым остатком в белках или других аптамерах, модифицированных тиолом. Однако сродство связывания Apt _HER2 -MNS был измерен аналогично Apt _HER2 , этот результат означает, что нет достаточного количества несвязанных Apt _HER2 -SH, который может прерывать взаимодействие между аптамером и белком HER2, ни mWMNC не имеют или очень мало влияют на сродство связывания аптамеров.

Данные о сродстве связывания аптамера против HER2 (Apt _HER2 -OH) тиолированный аптамер против HER2 (Apt _HER2 -SH) и Apt _HER2 -MNS на белки HER2 путем измерения анализа связывания фильтра. а Схематическая иллюстрация, показывающая процесс анализа связывания аптамеров фильтром. б График зависимости фракции связанного аптамера от концентрации HER2. c K _d график значений Apt _HER2 -ОН (0,42 ± 0,05 нМ, R ² =0,99, p <0,0001), Apt _HER2 -SH (26,88 ± 8,24 нМ, R ² =0,98, p <0,0001) и Apt _HER2 -MNS (0,57 ± 0,26 нМ, R ² =0,91, p =0,001) рассчитано из b . Планки погрешностей были представлены положительным знаком y только ось

Для оценки способности Apt _HER2 были проведены эксперименты МРТ in vivo с использованием моделей сингенных опухолей мыши. -MNS для нацеливания на опухоли со сверхэкспрессией HER2. Используя модель опухоли, созданную путем имплантации клеток NIH3T6.7 в бедро, эксперимент МРТ был проведен от предварительной инъекции до 120 минут после инъекции WMNC или Apt _HER2 -MNS (Рис. 5, см. Также Дополнительный файл 1:Рисунок S4). Эффект усиления контраста T2 с помощью контрастных агентов на основе IONP наблюдается как затемнение изображения, потому что они вызывают эффект сокращения T2 вокруг протонов. Следовательно, при анализе интенсивности сигнала значения T2 или T2 * были представлены как R2 или R2 *. R2, инвертированное значение T2, используется для сравнения интенсивности сигнала с положительным значением. В случае WMNC наибольшая интенсивность сигнала R2 наблюдалась через 30 мин после введения WMNC, после чего она постепенно снижалась (рис. 5а, б). Через 120 мин после инъекции WMNC интенсивность сигнала T2 напоминала состояние до инъекции. Скорость изменения среднего значения интенсивности сигнала R2 была менее 10%; таким образом, его было трудно распознать в Т2-взвешенном МРТ невооруженным глазом. В предыдущем исследовании было продемонстрировано, что наночастицы оксида железа, покрытые оболочкой Т80, накапливаются вокруг опухолевых тканей, несмотря на отсутствие каких-либо нацеливающих групп [46]. Однако в этом исследовании доза контрастного вещества 1,4 мг _Fe на мышь использовалась в Т2-взвешенной МРТ, которая была в 14 раз выше, чем доза, использованная в этом исследовании. Это означает, что WMNC не смогли показать эффективную эффективность усиления контраста в эксперименте при дозе 0,1 мг _Fe на мышь (5 мг _Fe /кг). Изменение интенсивности сигнала R2 * во временном ряду также было менее 10%, и не было статистической значимости. Напротив, через 120 минут после инъекции Apt _HER2 -MNS вызывал усиление интенсивности сигнала на 130% выше, чем до инъекции Apt _HER2 -MNS, несмотря на использование той же дозы инъекции, что и WMNC (рис. 5c, d). Эта инъекционная доза была в 2–30 раз ниже, чем в других исследованиях контрастного агента на основе магнитных наночастиц, модифицированных аптамером [44, 47, 48]. Этот результат показал, что Apt _HER2 -MNS обладает более высокой способностью нацеливания, чем WMNC или другой контрастный агент, модифицированный аптамером, а также предположил, что эффект усиления высокой контрастности Apt _HER2 -MNS можно ожидать, несмотря на более низкую дозу, чем WMNC. Увеличение контраста в основном проявлялось в периферических сосудах и в центре опухолевой ткани. Хотя периферические сосуды потемнели вскоре после инъекции Apt _HER2 -MNS, усиление контраста в центре опухолевого поражения впервые проявилось через 60 минут и имело тенденцию к увеличению до 120 минут.

МРТ-изображения модели опухоли HER2 + на мышах in vivo с использованием WMNC ( n =3) или Apt _HER2 -MNS ( n =3). а МРТ-изображения, взвешенные по T2 и T2 *, до или после инъекции WMNC. б График относительной интенсивности сигнала, измеренный от a . c МРТ-изображения, взвешенные по T2 и T2 *, до или после инъекции Apt _HER2 -MNS. г График относительной интенсивности сигнала и e гистограмма интенсивности области опухоли, измеренная от c . е Данные гистологического анализа, полученные после МРТ. Планки погрешностей были представлены положительным знаком y только ось. Относительные интенсивности сигналов b , d и e были измерены на основе красной сплошной линии рентабельности инвестиций a , c , и Дополнительный файл 1:Рисунок S4

Чтобы подчеркнуть видимые изменения в эффектах повышения контрастности до и после инъекции Apt _HER2 -MNS, анализ гистограммы интенсивности сигнала R2 был проведен в областях интереса на T2-взвешенных изображениях МРТ (рис. 5e). Поскольку сигнал T2 проявляется как отрицательное усиление на T2-взвешенных изображениях МРТ, он был представлен как R2. После инъекции Apt _HER2 -MNS, центр гистограммы смещен вправо. При вычислении разницы в центрах гистограмм наблюдалось увеличение контрастности примерно на 10%.

Для подтверждения наличия Apt _HER2 -MNS в опухоли гистологически было проведено окрашивание берлинской лазурью (фиг. 5f). В ткани, окрашенной берлинским синим, ядро ​​и цитоплазма были окрашены в темно-розовый или светло-розовый цвет, и вокруг опухолевых клеток наблюдали несколько точек синего цвета. Мы предположили, что ткани опухоли окрашиваются в синий цвет, если Apt _HER2 -MNS нацелился на опухоль. По результатам окрашивания берлинской лазурью в опухолевых тканях наблюдались синие точки, а на предметных стеклах ткани Apt _HER2 -MNS примерно в 3 раза больше синих точек, чем WMNC. Окрашивание берлинской лазурью позволяет обнаружить ион Fe в тканях; таким образом, его использовали для подтверждения накопления контрастного вещества на основе IONP в опухолевых тканях [44, 49, 50].

Выводы

В заключение мы подтвердили, что Apt _HER2 -MNS работает как in vivo HER2-нацеленное контрастное вещество для МРТ посредством физико-химической характеристики и экспериментов in vivo MRI на моделях опухолей мышей, экспрессирующих HER2. Кв. _HER2 -MNS обладает высокой релаксирующей способностью и специфичностью по отношению к HER2, и он продемонстрировал заметные эффекты усиления контраста, несмотря на более низкую дозу введения, чем другие контрастные агенты T2, из-за наночастиц оксида железа. Ожидается, что этот контрастный агент предоставит информацию относительно экспрессии рака HER2 у онкологических пациентов и может быть использован для мониторинга пациентов с раком HER2 + во время химиотерапии с использованием лекарственных препаратов-мишеней HER2. Мы ожидаем, что результаты этой работы предложат многообещающую стратегию диагностики рака со сверхэкспрессией HER2 и лечения пациентов.