Опосредованный семенами синтез золотых наностержней с настраиваемым соотношением сторон для фотоакустической визуализации в ближнем инфракрасном диапазоне

Фон

Одномерные (1D) наноструктуры, такие как нанопроволоки, наностержни, нанотрубки и наноленты, особенно интересны, потому что они не только являются новыми базовыми строительными блоками для наноустройств, но также обладают высоким геометрическим соотношением сторон, создающим анизотропные свойства для специальных приложений [1, 2,3,4,5,6]. Среди этих одномерных наноструктур новые металлические наностержни (NR) вызывают все больший интерес из-за их зависящей от формы полосы поверхностного плазмонного резонанса (SPR) [7, 8], легкости синтеза [9,10,11], благоприятной биосовместимости и легкости модификация [12,13,14]. Например, Yeh et al. сообщили о структуре наностержня Au (AuNR) в оболочке размером менее 100 нм, которая демонстрирует сильное продольное поглощение при 600-900 нм и хорошо подходит для фотоиндуцированной терапии [8]. Wang et al. успешно сконструировали анизотропные спиральные суперструктуры AuNR с заданной хиральностью, разместив функционализированные AuNR с ДНК на оригами разработанного X-образного паттерна расположения цепей захвата ДНК [12].

Кроме того, улучшения в синтезе и очистке AuNR позволили легко настроить продольную полосу SPR, регулируя длину и, следовательно, соотношение сторон [15,16,17] для конкретных приложений, таких как фотоакустическая визуализация (PAI) и фотоиндуцированные методы лечения [18,19,20,21,22,23], которые требуют продольного ППР Au NR, чтобы попасть в оптическое прозрачное окно биологической ткани (сначала при 700–950 нм, а затем при 1000–1350 нм) [8 , 18]. Например, Хуанг и его сотрудники синтезировали золотые NR с соотношением сторон от 2,4 до 5,6, которые продемонстрировали эффективную диагностику раковых клеток и селективную фототермическую терапию [19]. Jokerst et al. разработали NR золота и покрытые кремнеземом золотые NR с соотношением сторон около 3,5, которые показали высокий сигнал PAI для обнаружения рака яичников и визуализации мезенхимальных стволовых клеток [20, 21]. Ян и его сотрудники сообщили о магнитном золотом наностержне / PNIPAAmMA для двойного магнитного резонанса PAI и целевой фототермической терапии [23]. Хотя было разработано множество контрастных агентов на основе Au NR, простой, масштабируемый синтез больших AuNR с регулируемым соотношением сторон и их характеристики PAI, зависящие от поведения поглощения, все еще остаются проблемами.

Здесь AuNR с соотношением сторон от 8,5 до 15,6 были синтезированы с использованием модифицированного метода роста, опосредованного семенами, с помощью аскорбиновой кислоты. Было продемонстрировано, что AuNR обладают высокой биосовместимостью и дополнительно снижают их цитотоксичность с помощью модификации SH-PEG. Благодаря большому и регулируемому поглощению в ближней ИК-области синтезированные AuNR могут обеспечивать более высокий контраст и более высокие значения отношения сигнал-шум (SNR) в PAI, как в экспериментах in vitro, так и in vivo. Этот простой метод построения золотых NR с регулируемым соотношением сторон можно использовать для изготовления контрастного вещества при любой длине волны в первом окне NIR.

Экспериментальный

Синтез золотых наностержней

AuNR с регулируемым аспектным соотношением были синтезированы модифицированным методом затравочного синтеза [16, 17]. В типичной процедуре объем 10,3 мл 0,025 М HAuCl ₄ (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., ≥ 99,9%) и 3,644 г поверхностно-активного вещества цетилтриметиламмонийбромида (CTAB) (Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, ≥ 99,0%) сначала добавляли в химический стакан. Затем добавляли деионизированную воду (18 МОм), чтобы довести концентрацию HAuCl ₄ быть 2,5 × 10 ⁻³ M и CTAB из 0,1 М. 10 мл, 4,5 мл, 4,5 мл и 45 мл вышеупомянутого раствора были отдельно перенесены в четыре колбы, помеченные как A, B, C и D. Затем объем 350 мкл , 0,01 М ледяной NaBH ₄ (Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd., ≥ 98,0%) добавляли в колбу A и перемешивали в течение 3 минут. 0,4 мл раствора из колбы A и 25 мкл 0,1 M L (+) - аскорбиновой кислоты (AA) (Tianjin Shentai Chemical Industry Co., Ltd., ≥ 99,7%) переносили в колбу B, перемешивали еще 3 мин. Затем в колбу C добавляли 0,4 мл раствора из колбы B и 25 мкл 0,1 M AA и снова перемешивали в течение 3 мин. Наконец, 4 мл раствора из колбы C и 250 мкл 0,1 M AA добавляли в колбу D, перемешивали в течение 5 с, а затем оставляли в покое на водяной бане при 28 ° C на 12 часов. Верхний раствор осторожно удаляли, осадок центрифугировали и несколько раз промывали дистиллированной водой, чтобы убедиться, что избыток CTAB был полностью удален. Таким образом, конечные продукты были обозначены как типичные наностержни Au (AuTR).

Повторите описанный выше процесс и просто измените дозировку AA, и тогда можно будет разработать Au NR с соотношением сторон от 8,5 до 15,6. Подробности следующие:дозировка АК составляет (35 мкл, 35 мкл, 350 мкл) для стержня Au 1, (30 мкл, 30 мкл, 300 мкл) для стержня Au 2, (20 мкл, 20 мкл, 200 мкл) для стержня Au. Au стержень3 и (15 мкл, 15 мкл, 150 мкл) для стержня Au4.

Модификация поверхности AuNR

Сначала 10 мг SH-PEG (Nanjing Pengsheng Biological Technology Co. Ltd) растворяли в 1 мл деионизированной воды и обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин. Затем раствор обрабатывали 50 мл 0,1 М NaBH ₄ . раствор под воздействием ультразвука в течение еще 15 мин для восстановления возможного димеризованного SH-PEG (PEG-S-S-PEG). Во-вторых, очищенные Au NR диспергировали в 10 мл деионизированной воды и смешивали с указанным выше раствором SH-PEG (10 мл), перемешивали в течение 5 минут, а затем помещали в неподвижном состоянии на 5 часов. Наконец, образец центрифугировали и промывали деионизированной водой для дальнейшего применения.

Методы характеризации

Морфология и структура синтезированных AuNR были идентифицированы с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM; JEOL JSM-7001F) и просвечивающей электронной микроскопии (TEM; JEOL 2100F, 200 кВ). УФ-видимая абсорбция различных AuNR была измерена на спектрофотометре (Shimadzu, 3100 УФ-видимая ИК-область). Фотоакустические сигналы регистрировались блоком вращающейся сканирующей фотоакустической системы обнаружения, которая содержит лазерное устройство (Surelite I-20, Continuum), оптический параметрический генератор (OPO) (Surelite OPO Plus), несфокусированный ультразвуковой преобразователь (PMUT) (V310- SU, Olympus, 5 Гц), поворотный стол с шаговым двигателем и его блок управления двигателем (MC) (M600, Beijing Zolix Instrument Co., Ltd.), предусилитель (5077PR, Olympus), карта сбора данных (DAQ) PCI4732 и т. Д. вкл.

Эксперименты по жизнеспособности клеток

Все биоэкспериментальные процедуры были одобрены комитетом IACUC Технологического университета Тайюань. И эксперименты проводились в соответствии с утвержденными инструкциями.

Клетки Hela культивировали в стандартной клеточной среде, рекомендованной Американской коллекцией типовых культур (ATCC), при 37 ° C и 5% CO ₂ Атмосфера. Клетки, высеянные в 96-луночные планшеты, инкубировали с разными концентрациями AuNR и AuNR-PEG в течение 24 часов. Относительную жизнеспособность клеток определяли с помощью стандартного анализа метилтиазолилтетразолия (МТТ) и отображали под оптическим микроскопом.

In Vitro и In Vivo PAI

Два грамма порошка агара (Gene Company Ltd.) растворяли в 100 мл деионизированной воды и хорошо перемешивали стеклянным стержнем в химическом стакане. Мутную жидкость нагревали до кипения в микроволновой печи (Midea Group Limited by Share Ltd.). Затем жидкость вынимали и перемешивали на водяной бане в течение 20 мин при 60 ° C, пока жидкость не загустела. Затем вязкие материалы выливали в цилиндрическую форму диаметром 4,5 см, охлаждали и затвердевали. Наконец, агар со сгустками был использован в качестве фантома биологической ткани из-за их приблизительного поглощения для БИК-лазеров.

Стеклянный капилляр диаметром 0,9 мм имплантировали на поверхность фантома для имитации кровеносного сосуда, который в конкретном эксперименте заполнялся бы свежей бычьей кровью или кровью, смешанной с различной концентрацией AuNR-PEG. Фантом помещали под воду и облучали лазером с длиной волны 680 или 800 нм при плотности мощности 11 мДж / см ² . .

Наркотизируйте мышь изофлураном временно, затем внутрибрюшинно вводили 0,04 мл / 10 г 10% хлоралгидрата для тщательной анестезии мыши. Голову мыши осторожно сбривали с волос и гладко смазывали ультразвуковым связующим (Boline Healthcare Ltd.). Длину волны лазера отрегулировали до 800 нм, и мышь поместили под воду. Затем были визуализированы мозговые кровеносные сосуды мыши до и после, и мыши были внутривенно (внутривенно) введены контрастные вещества (1 нМ, 0,1 мл / 10 г). Лазер изменили на 680 нм и повторили эксперимент, описанный выше. Примечание. После смены контрастного вещества внутривенная инъекция должна занять не менее 24 часов, чтобы остаток полностью метаболизировался.

Результаты и обсуждения

Типичная морфология и структура AuTR систематически обсуждались с помощью ПЭМ (рис. 1). Как показано на рис. 1а, синтезированные AuTR (дозировка АК составляла 25 мкл) однородны по форме, с диаметром 22 ± 1,5 нм, длиной 290 ± 13 нм и соотношением сторон примерно 13,2. На рис. 1b показано изображение некоторых репрезентативных AuTR с помощью просвечивающего электронного микроскопа с большим увеличением. ПЭМ-изображение с высоким разрешением (ПЭМВР) концевой области одиночного наностержня (прямоугольная область «1» на рис. 1b) показано на рис. 1c. Результат показывает, что полосы решетки, перпендикулярные длинной оси наностержня, можно различить с d-расстоянием 1,44 Å, соответствующим плоскости решетки (110). Наностержень растет в направлении [110], что определяется кубической структурой Au на основе анализа картины дифракции электронов на выбранной области (SAED) и изображения HRTEM [16,17]. Спектры поглощения AuTR в УФ-видимой области на рис. 1d демонстрируют два пика поглощения, характерный пик около 520 нм и продольный пик около 900 нм. Когда функционализирован HS-PEG (красная линия), полоса поглощения показывает небольшое снижение (около 5%) силы пика, но без явного сдвига положения пика.

Типичная морфология и структура наностержня Au, синтезированного при 25 мкл 0,1 M AA (AuTR): a Светлопольное изображение ПЭМ. б Усиление ПЭМ-изображения одного стержня. c Изображение HRTEM одиночного стержня в прямоугольной области «1» с панели b . г УФ-видимые спектры поглощения AuTR и AuTR-PEG

Хорошо известно, что кинетический контроль концентрации мономера и скорости роста кристаллов являются ключевыми факторами для управления размером частиц, а также формой материала, инициированной анизотропным ростом [24, 25]. Таким образом, в данной работе были проведены эксперименты в зависимости от концентрации для изучения влияния АК на анизотропный рост Au NR. Когда использование AA составляет 35 мкл (0,1 M), соотношение сторон синтезированных AuNR составляет около 8,5 ± 0,6 (рис. 2a, около 50 отдельных AuNR были случайным образом выбраны для математической статистики соотношения сторон). При уменьшении дозировки АК с 35 до 15 мкл аспектное отношение AuNR увеличивается с 8,5 до 15,6 (рис. 2a – d). Обычно АК часто используют в качестве восстановителя для восстановления светло-желтого Au ³⁺ в Au ⁺ и не мог вызвать образование Au ⁰ наночастицы [26, 27]. Однако в нашем эксперименте соотношение сторон синтезированных AuNR варьируется в зависимости от концентрации АК. Предполагается, что AA не только действует как восстанавливающий агент, но также играет роль кэпирующего агента, помогая регулировать анизотропный рост AuNR в нашем эксперименте [28,29,30]. При снижении концентрации АК в реакционной системе Au ⁺ ионы должны ускорять их высвобождение и вызывать быстрый рост вдоль продольной оси наностержня Au (рис. 2e). На рис. 2е показаны спектры поглощения всех образцов в УФ и видимой областях. При увеличении соотношения сторон с 8,5 до 15,6, сильная продольная полоса поглощения ППР AuNR смещается в красную сторону от ~ 680 до 1100 нм, охватывая широкий диапазон БИК (рис. 2е), что указывает на их большой потенциал для биомедицинских приложений [31, 32 ].

Статистика морфологии и соотношения сторон AuNR с разными дозами АК: a – d SEM и гистограмма, a Rod1, b Rod2, c Rod3 и d Род4. е Линейная диаграмма дозировки АК, соответствующая соотношению сторон. е Спектры поглощения различных AuNR в УФ и видимой областях

Фотоакустические свойства AuNR in vitro представлены на рис. 3. Фотоакустические (PA) амплитуды AuNR, функционализированных HS-PEG, были определены при серии концентраций оптических компонентов от 0,25 до 1,0 нМ (рис. 3a), которые показал хорошие линейные отношения. AuTR обеспечивает значительное усиление сигнала PA, облучаемого лазером с длиной волны 800 нм и стержнем из Au1 с длиной волны 680 нм. При неадекватной настройке длины волны лазера (например, AuTR на 680 нм и Au rod1 на 800 нм) интенсивность PA-сигнала резко ослаблялась. На рис. 3b показаны PA-изображения стеклянных капилляров, заполненных свежей бычьей кровью или балансом крови, смешанным с 1 нМ AuTR и Au стержнем1. Результаты показывают, что b3 (AuTR на 800 нм) и b7 (Au стержень1 на 680 нм) имеют лучший эффект визуализации. По-видимому, соответствующий контрастный агент может обеспечить более сильное поглощение PAI, что приведет к более высокому разрешению изображений PA. На рис. 3c, d представлены количественные сравнения фотоакустических сигналов между чистой кровью и кровью, смешанной с AuTR и стержнем1. Результаты показывают, что амплитуда фотоакустического сигнала крови, смешанной с AuTR, в 2,3 раза выше, чем у чистой свежей бычьей крови при 800 нм, а для группы Au rod1 в 2,1 раза выше при 680 нм. Сильное усиление проявляется в положениях их продольных пиков поглощения. Другими словами, характеристики поглощения AuNR доминируют над их характеристиками PAI.

Фотоакустические свойства AuTR и AuNR in vitro: a Зависящая от концентрации интенсивность фотоакустического сигнала AuTR и Au стержня1, облученных лазером с длиной волны 800 и 680 нм, соответственно, b PAI стеклянного капилляра заполнен балансом крови, смешанным с 1 нМ AuTR или Au стержнем1, облученным лазером с длиной волны 800 и 680 нм, c , d сравнение амплитуды фотоакустического сигнала между чистой кровью и балансом крови, смешанным с 1 нМ AuTR или Au стержнем1, облученным лазером с длиной волны 800 и 680 нм, e1 - e6 сравнение спектров поглощения (сплошная линия) пяти видов синтезированных AuNR и свежей бычьей крови, полученных из амплитуды многоволновых фотоакустических сигналов (точки данных)

Фотоакустические и оптические спектры пяти видов AuNR и крови показаны на рис. 3e1 – e6. Спектры многоволновых фотоакустических сигналов были получены путем сбора амплитуд фотоакустических сигналов на разных длинах волн (от 680 до 900 нм) лазерами, с заполнением 1 нМ водного раствора в стеклянных капиллярных трубках. Видно, что графики показывают хорошее согласие спектров фотоакустического сигнала и оптических спектров AuNR. Эти результаты ясно указывают на возможность применения AuNR в PAI при подходящей длине волны лазеров и количественно дают фотоакустический эффект AuNR на различных длинах волн от 680 до 900 нм.

Для исследования биотоксичности AuNR при активном нацеливании клетки Hela инкубировали с AuTR в концентрациях 0,25–1,0 нМ. Стандартный анализ МТТ проводили для определения жизнеспособности клеток (рис. 4а). Результаты подтверждают, что комбинация AuTR-PEG вызывает наибольшую выживаемость клеток (95,3% при 1 нМ) по сравнению с другими группами в течение 24 часов. Это говорит о том, что AuNR-PEG обладает низкой цитотоксичностью клеток и хорошей биосовместимостью [33, 34] и, возможно, является многообещающим фотоакустическим контрастным агентом. Хотя чистый AuTR не обладал значительной токсичностью (жизнеспособность клеток может достигать 71,2% при 1 нМ), гибель клеток проявлялась при концентрациях 0,75 и 1,0 нМ (рис. 4b), что указывает на то, что низкая концентрация AuTR больше подходит для фотоакустических исследований. визуализации, в то время как высокая концентрация может вызвать гибель клеток [35, 36]. Следовательно, для рассмотрения как фотоакустической эффективности, так и биотоксичности AuNR, концентрация 1 нМ была выбрана в качестве подходящего условия для in vivo PAI.

Относительная жизнеспособность клеток Hela после инкубации с различными концентрациями AuTR с модифицированным ПЭГ и без него в течение 24 часов: a гистограмма относительной жизнеспособности клеток и b изображения клеток Hela с оптической микроскопии

Фотоакустическая визуализация - это неинвазивный метод визуализации, предлагающий увеличенную глубину визуализации in vivo и пространственное разрешение по сравнению с другими традиционными методами оптической визуализации [37,38,39,40]. Мы обнаружили, что AuNR-PEG с высоким поглощением в ближнем ИК-диапазоне может использоваться в качестве отличного контрастирующего агента при фотоакустической визуализации (рис. 5). На рис. 5а показана фотография кровеносных сосудов головного мозга мыши, выбранной в качестве образца PAI in vivo. На рис. 5b1 – b6 представлены фотоакустические изображения кровеносных сосудов головного мозга мышей для образца с добавками AuNR-PEG и без них для лазеров с длиной волны 800 и 680 нм соответственно. Результаты показывают, что до инъекции AuNR-PEG на изображениях PA контрольной группы (рис. 5b1, b4) видны только приблизительные формы главного кровеносного сосуда головного мозга (рис. 5b1, b4), а некоторые ответвленные сосуды смешаны на заднем плане и их трудно различить. , независимо от того, какая длина волны лазера используется. Когда вводили контрастный агент (AuTR-PEG и Au rod1-PEG), качество изображений PA значительно улучшилось, и некоторые исчезнувшие мелкие ответвленные сосуды головного мозга (в контрольной группе) стали отчетливо появляться, особенно изображения AuTR-PEG, захваченного при 800 нм, и Au rod1-PEG при 680 нм.

Фотография и PA-изображения кровеносных сосудов головного мозга мыши: a фотография цереброваскулярной системы мыши, b Схема PA-изображений кровеносных сосудов головного мозга мыши до и после внутривенной инъекции AuTR или Au стержня1, облученных лазером с длиной волны 800 и 680 нм

Фотоакустические изображения на рис. 5b1 – b6 также были количественно проанализированы (таблица 1) с точки зрения контраста и отношения сигнал-шум (SNR). Средний контраст всего изображения, соответствующего каждому пикселю, был рассчитан по десяти точкам, которые были случайным образом выбраны на одном и том же месте кровеносных сосудов головного мозга мыши. Средний контраст изображений контрольной группы составляет 1,113 на рис. 5b1 и 1,076 на рис. 5b4. После введения AuNR-PEG качество всех изображений улучшается в разной степени. В группе AuTR / 800 нм аорта хорошо видна (рис. 5b2), а средний контраст может достигать 3,451, что в 3,1 раза больше, чем в контрольной группе. При параллельном сравнении с группой Au стержень1 / 800 нм (рис. 5b3) средний контраст составляет всего 1,514, что в 1,36 раза больше по сравнению с контрольной группой. Однако, когда длина волны лазера изменилась на 680 нм, контраст AuTR составил всего 1,925, что намного ниже, чем у Au стержня1 (3,692, 3,6 раза по сравнению с контрольной группой). Отношение сигнал / шум изображений в группе AuTR было оптимизировано в 5,6 раза при 800 нм по сравнению с контрольной группой, а группа Au rod1 также была увеличена в 5,7 раза при 680 нм. Эти результаты в основном согласуются с результатами in vitro, то есть значительное улучшение качества изображения можно приписать их соответствующим большим пикам продольного поглощения.

Выводы

С помощью аскорбиновой кислоты были синтезированы золотые наностержни с регулируемым соотношением сторон от 8,5 до 15,6 с помощью модифицированного метода синтеза, опосредованного затравками. Эти золотые наностержни могут обеспечивать настраиваемые пики поглощения от 680 до 1100 нм, перекрывая первое биологическое окно NIR. При модификации SH-PEG синтезированные AuNR демонстрируют превосходную биосовместимость и стабильность, что свидетельствует о большом потенциале их применения в ближней инфракрасной области в качестве фотоакустического контрастного агента. Оба эксперимента in vitro и in vivo подтверждают, что синтезированные AuNR с настраиваемым аспектным соотношением могут обеспечивать более высокий контраст и более высокие значения SNR в PAI при подходящей длине волны лазеров. Эта работа предоставляет возможный способ контролируемого синтеза контрастного вещества при любой длине волны в первом окне ближнего инфракрасного диапазона и используется для визуализации таких заболеваний, как внутримозговое кровоизлияние и тромб.

Сокращения

1D:

Одномерный

AA:

l (+) - аскорбиновая кислота

AuNR:

Наностержень Au

AuTR:

Типичные наностержни Au

CTAB:

Бромид цетилтриметиламмония

ДНК:

Дезоксирибонуклеиновая кислота

MTT:

Метилтиазолилтетразолий

NIR:

Ближний инфракрасный порт

NR:

Наностержни

OPO:

Оптический параметрический генератор

PA:

Фотоакустика

PAI:

Фотоакустическая визуализация

SAED:

Электронная дифракция в выбранной области

SEM:

Сканирующая электронная микроскопия

SH-PEG:

Тиол-полиэтиленгликоль

SNR:

Соотношение сигнал-шум

SPR:

Поверхностный плазмонный резонанс

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия