Двухцелевые парамагнитные липосомы для αvβ3 интегрина и NRP-1: мощный инструмент МРТ для раннего обнаружения опухолей

Аннотация

Магнитно-резонансная томография (МРТ) незаменима для ранней диагностики опухолей, однако её внутренняя неспецифичность ограничивает клиническое влияние. Используя ангиогенез как мишень для молекулярной визуализации, контрастные агенты могут доставляться непосредственно к неоваскулятуре через рецептор-специфические носители. Спроектированы двухцелевые парамагнитные липосомы, демонстрирующие два ангиогенических лиганда: мотив Arg-Gly-Asp (RGD), связывающий αvβ3-интегрин, и гептапептид ATWLPPR (A7R), связывающий невропилин-1 (NRP-1). Эти липосомы, диаметром ниже 100 нм, эффективно инкапсулировали хелат гадолиния Gd-DTPA. Их T1 релаксивитет совпал с свободным Gd-DTPA, в то время как клеточный улавливание показало 50 % прирост над нетаргетированными липосомами и 20 % выигрыш над однотаргетированными конструктами, эффект, устраняемый конкурентным пептидным блокадом. В мышах с ксеногрефтами A549 двухлигандные липосомы дали отношение усиливания сигнала (ОУС) в 3 раза выше свободного Gd-DTPA и в 1,5 раза выше однотаргетированных вариантов через 2 ч после инъекции, с падением ОУС лишь до 60 % пика через 6 ч. Эти результаты подчеркивают синергетическое таргетинговое преимущество и позиционируют αvβ3/NRP-1 двухлигандную липосому как мощную платформу для молекулярной МРТ опухолей.

Введение

МРТ остается модальностью выбора для раннего обнаружения солидных опухолей благодаря превосходному мягкотканевому контрасту и неионизирующей природе. Парамагнитные агенты вроде Gd-DTPA еще больше улучшают качество изображения, однако низкое отношение сигнал опухоль/фон затрудняет точную локализацию. Липосомы предлагают биосовместимый носитель, инкапсулирующий гидрофильные агенты, защищая их от плазменных взаимодействий и удлиняя системную полужизнь. Функционализация поверхностей липосом пептидами, антителами или аптамерами может перенаправлять эти носители к переэкспрессированным опухолевым антигенам, увеличивая накопление в злокачественных зонах.

Ангиогенические рецепторы, в частности αvβ3 интегрин и невропилин-1 (NRP-1), обильно экспрессируются на эндотелии опухолей и многих опухолевых клетках, делая их привлекательными мишенями для визуализации. Однако гетерогенность рецепторов часто ограничивает одно-лигандные стратегии. Двухцелевая доставка, при которой два разных лиганда представлены на одной наночастице, расширяет возможности связывания с клеточной поверхностью и может повысить авидность и специфичность. Опираясь на предшествующую работу с RGD-функционализированными липосомами, мы предположили, что ко-демонстрация αvβ3-интегрин и NRP-1 лигандов усилит таргетинг опухолей и МРТ-контраст.

Здесь сообщаем о синтезе, характеристике и доклинической оценке двухлигандной парамагнитной липосомы, ко-конъюгирующей RGD и ATWLPPR. Сравнительные анализы с нетаргетированными, одно-лигандными и смешанными одно-лигандными липосомами выполнены in vitro и in vivo для оценки клеточного улавливания, рецепторного связывания и МРТ-производительности.

Материалы и методы

Химикаты

Яйцевитиновый фосфатидилхолин (PC, ММ 775 Да) и mPEG2000-DSPE (ММ 2788 Да) получены от Avanti Polar Lipids; холестерин (ММ 386 Да) приобретен у Bio Basic. Gd-DPTA (Magnevist) поставлен Bayer Schering Pharma. Все пептиды и конъюгаты кастом-синтезированы Yishengyuan (Шанхай, Китай).

Пептиды и конъюгаты

Спроектированы три пептида: двухцелевой P1 (GARYC-RGD-CFD-ATWLPPR, ММ 2435 Да), однотаргетированный P2 (GARYC-RGD-CFDG, ММ 1670 Да) и однотаргетированный P3 (ATWLPPR, ММ 1191 Да). Каждый пептид связан с C6-пальмитиновым якорь (Pal) через FMOC твердофазный синтез. HPLC чистота превышала 90 % для всех продуктов.

Подготовка липосом

Липосомы собирали методом гидратации тонкой пленки с молярным соотношением PC/холестерин/mPEG2000-DSPE 1,85:1:0,15. После испарения растворителя и формирования пленки пептиды растворяли в DMSO (финальный 1 % DMSO) и вводили в липидную пленку при пептид-липид соотношениях 4,5, 3 и 2,5 мкг моль⁻¹ для P1, P2 и P3 соответственно. Гидратированная пленка экструдировали последовательно через мембраны 0,4 мкм, 0,2 мкм и 0,1 мкм для получения однородных наночастиц. Gd-DTPA инкапсулировали при гидратации; неинкапсулированный агент удалили ультрафильтрацией (100 кДа MWCO). Финальные препараты (Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, P3-Gd-LP и P2/P3-Gd-LP) хранили при 4 °C под азотом.

Характеристика липосом

Динамическое рассеяние света измеряло размер частиц и дзета-потенциал; ТЭМ подтверждал морфологию. Загрузка гадолиния kvantифицировалась ИСП-ОЭС.

Измерение T1 релаксивитета

T1-взвешенные изображения получали на 3,0 Т системе (Philips/GE). Образцы 1×10⁻³ – 1×10 мМ Gd/л готовили в ФСБ. Инверсионно-восстановительная спин-эхо последовательность (STIR) (TI = 200–9000 мс, TR = 10000 мс, TE = 7,6 мс, FOV = 2×2 см², матрица = 320×320, срез = 5 мм) использовалась для определения R1. Релаксивитет (r₁) рассчитывали из (R₁obs – R₁m)/C.

Клеточные линии и культура

A549 (человечная аденокарцинома) и HUVECs (человечные пуповинные эндотелиальные клетки) получены от Института онкологии Тунцзянского университета. Клетки культивировали в DMEM с 10 % фетового сывороточного сироватки, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина при 37 °C, 5 % CO₂ до 80–90 % конфлюэнтности.

Клеточное улавливание и конкурентное связывание

Клетки инкубировали с Gd-липосомами (10 мМ Gd) 4 ч при 37 °C. После промывки клетки давили в азотной кислоте и Gd измеряли ИСП-ОЭС. В конкурентных анализах свободные пептиды (P1, P2 или P3) ко-инкубировали с липосомами для блокады рецепторного связывания.

МРТ способность детекции In Vivo

Самки BalB/c голые мыши (4 недели) получали подкожные инокуляции A549 (1×10⁴ клеток). Когда опухоли достигали 50–100 мм³, мыши рандомизировали (n = 5 на группу) и анестезировали уретаном. Базовые T2-взвешенные сканы идентифицировали опухоли, затем T1-взвешенные аквизиции до и в 0,5, 1, 2, 4 и 6 ч пост-контраст. ОУС рассчитывали из средних интенсивностей сигнала в ROI опухоли и задней конечности мышцы.

Статистический анализ

Данные представлены как mean ± SD. Одномерный ANOVA с пост-хок тестированием (SPSS 22.0) определял значимость; p < 0,05 считалось значимым.

Результаты

Характеристика липосом

Все формуляции показывали сферическую, однородную морфологию под ТЭМ, диаметры ниже 100 нм и дзета-потенциалы от –15 до –60 мВ. Средние размеры: Gd-LP 87,8 ± 0,9 нм, P1-Gd-LP 103,5 ± 1,2 нм, P2-Gd-LP 89,9 ± 1,5 нм, P3-Gd-LP 89,9 ± 1,2 нм.

T1 релаксивитет двухцелевой липосомы

Gd-DTPA показал наивысшие r₁ значения среди всех групп, однако статистически значимых различий (p > 0,05) относительно липосомных формуляций не наблюдалось (Рис. 1). Это указывает, что липидная инкапсуляция сохраняет интринсический релаксивитет Gd-DTPA.

T1 релаксивитет (с⁻¹ мМ⁻¹) чистого Gd-DTPA, Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP и P3-Gd-LP при разных концентрациях Gd (мМ). Данные mean ± SD (n = 3), p > 0,05.

Клеточное улавливание и конкурентное связывание

Двухцелевые липосомы доставляли на 50 % больше Gd в A549 и HUVECs, чем нетаргетированные, и на 20 % больше, чем одно-лигандные варианты (Рис. 2a). Смешанные одно-лигандные липосомы (P2/P3-Gd-LP) показывали значительно меньшее улавливание, чем двухцелевая конструкция. Конкурентное связывание свободными P1, P2 или P3 снижало Gd накопление почти до уровня нетаргетированных, подтверждая рецептор-мединированное улавливание (Рис. 2b–d).

a Клеточное улавливание Gd-LP, P1-Gd-LP, P2-Gd-LP, P3-Gd-LP и P2/P3-Gd-LP в A549 и HUVECs. b–d Конкурентная ингибиция P1-, P2- и P3-конъюгированных липосом соответствующими свободными пептидами. *p < 0,05 против других групп.

Анализ МР изображений

In vivo МРТ показал, что двухцелевые липосомы давали наивысший ОУС во все временные точки (Рис. 4). В 2 ч пост-инъекции ОУС достиг 3× выше свободного Gd-DTPA и 1,5× выше одно-лигандных липосом. ОУС плато между 2 и 6 ч, падая лишь до 60 % пика через 6 ч, указывая на продолжительное удержание в опухоли.

МР изображения мышей с опухолями до и после инъекции разных контрастных агентов в разные временные точки. a чистый Gd-DTPA. b Gd-LP. c P1-Gd-LP. d P2-Gd-LP. e P3-Gd-LP.

Значения ОУС в 0,5, 1, 2, 4 и 6 ч пост-инъекции для каждой формуляции (n = 3). *p < 0,05 для P1-Gd-LP против других групп.

Обсуждение

Суб-100 нм липосомы используют эффект усиленной проницаемости и удержания (EPR), удлиняя системное циркулирование и облегчая накопление в опухоли. Наши двухлигандные липосомы сохранили физико-химическую целостность Gd-DTPA, как подтверждает неизменный T1 релаксивитет и минимальное влияние на размер частицы или заряд поверхности.

Ангиогенез — клеймо прогрессии опухоли, с αvβ3 интегрином и NRP-1 играющими ключевые роли в неоваскуляризации. Хотя мономерный ATWLPPR показывает умеренную аффинность к NRP-1, его комбинация с высокоаффинной RGD последовательностью создает гетеродимерный лиганд, таргетирующий оба рецептора одновременно. Это двойное зацепление увеличивает авидность связывания, особенно в гетерогенных микросредах опухолей, где экспрессия рецепторов варьируется среди субпопуляций клеток.

Наши in vitro конкурентные исследования подтверждают, что клеточное улавливание двухцелевых липосом рецептор-специфично: блокада либо αvβ3, либо NRP-1 драматически снижает Gd накопление. Превосходные in vivo профили ОУС подразумевают, что двухлигандный дизайн не только усиливает первичный таргетинг, но и поддерживает удержание внутри сосудистой и интерстициальной опухолевой сред.

Сравнительная работа Wu et al. показала, что ПЭТ-тракер с RGD-ATWLPPR достигал более высокого опухолевого улавливания, чем одно-лигандные аналоги. В отличие от радионуклидных проб, наши парамагнитные липосомы могут нести высокие полезные нагрузки Gd-DTPA, предлагая усиленный контраст без ионизирующего излучения.

Эти находки поддерживают потенциал αvβ3/NRP-1 двухцелевых липосом для ранней, неинвазивной МРТ разнообразных солидных опухолей, предоставляя платформу, адаптируемую для терапевтических полезных нагрузок или мультимодальной визуализации.

Заключение

Успешно спроектирована двухлигандная парамагнитная липосома, ко-демонстрирующая RGD и ATWLPPR, инкапсулирующая Gd-DTPA без компромисса его релаксивитета. Двухцелевая система продемонстрировала усиленное клеточное улавливание, рецептор-специфическое связывание и выраженно улучшенный МРТ-контраст в ксеногрефтовой модели опухоли. Эти результаты подчеркивают перспективность αvβ3/NRP-1 двухцелевых липосом как универсального инструмента для раннего обнаружения опухолей и потенциальной терапевтической доставки.

Аббревиатуры

ATWLPPR

Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg

BBN

Бомбезин

C6

6-Аминогексановая кислота

CT

Компьютерная томография

DMEM

Модифицированное среднее Дюльбекко

DMSO

Диметилсульфоксид

FMOC

Флуоренилметоксикарбонил

FOV

Поле зрения

Gd-DTPA

Гадолиний-диэтилентриаминпентауксусная кислота

HPLC

Высокоэффективная жидкостная хроматография

HUVEC

Человечная пуповинная эндотелиальная клетка

ICP-OES

Индуктивно связанная плазма оптическая эмиссионная спектрометрия

mPEG2000-DSPE

N-(карбонил-метоксиполиэтиленгликоль-2000)-1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин

MRI

Магнитно-резонансная томография

NRP1

Невропилин-1

Pal

Пальмитиновая кислота

PBS

Фосфатно-буферный салиновый раствор

PC

Фосфатидилхолин

PET

Позитронно-эмиссионная томография

RGD

Arg-Gly-Asp

ROIs

Области интереса

S/N

Отношение сигнал/шум

SER

Отношение усиливания сигнала

SI

Интенсивность сигнала

STIR

Инверсионно-восстановительная спин-эхо

TE

Время эхо

TEM

Трансмиссионная электронная микроскопия

TR

Время повторения

VEGF-R

Рецептор сосудистого эндотелиального фактора роста