Оптимизация транспортировки ДНК в твердотельных нанопорах для повышения точности секвенирования

Аннотация

По сравнению с био-нанопорами, твердотельные нанопоры все еще сталкиваются с рядом вызовов перед коммерческим применением в секвенировании ДНК. Низкое пространственное и временное разрешение — две главные проблемы. Из-за ограничений длины нанопора и свойств поверхности твердотельных нанопор существует потенциал для улучшения пространственного разрешения. В то же время ДНК проходит через нанопор слишком быстро под действием электрического поля, что приводит к получению малого числа достоверных точек данных. Временное разрешение твердотельных нанопор может быть повышено при эффективном контроле скорости транспортировки ДНК. В данном обзоре кратко описаны методы улучшения пространственного разрешения и подробно рассматриваются управляемые подходы к повышению разрешения детектирования нанопорами. Также представлены перспективы развития секвенирования ДНК с помощью нанопор.

Введение

За последние десятилетия достижен значительный прогресс в применении секвенирования ДНК для чтения последовательностей оснований в геноме [1, 2]. Для разработки персонализированных лекарств ученые ищут более быстрые и дешевые методы секвенирования ДНК, позволяющие применять целевые препараты и лечение индивидуально [3, 4]. С момента использования нанопорной технологии для детектирования ДНК [5] она считается перспективным методом секвенирования нового поколения [6, 7]. Нанопорная технология — перспективная платформа для создания высокочувствительных детекторов одиночных молекул ДНК [5] или РНК [8]. В базовой схеме детектирования электрохимическая камера разделяется тонкой мембраной с нанопором [9] на два резервуара (цис- и транс-компартаменты), что обеспечивает связь проводящего раствора и аналита в электрохимической камере. При приложении напряжения через мембрану ионы электролита проходят через твердотельный нанопор, образуя поровый ток, который измеряется с помощью патч-климп установки с ультрачувствительной электроникой. Когда молекула или молекулярный комплекс проходит через нанопор, аналит исключает некоторые ионы из объема, определяемого нанопором, что детектируется путем мониторинга кратковременных изменений тока. По времени пребывания (dwell time) в нанопоре и амплитудной сигнатуре тока можно получить информацию о молекулах. Пространственное разрешение нанопорного секвенирования определяется размерами нанопора, что позволяет использовать его как одиночный сенсор для малых молекулярных объектов с детектируемой токовой сигнатурой. Кроме того, нанопорные сенсоры легко интегрируются в переносимые лабораторно-на-чипе устройства и миниатюризируются [10].

Достигнут значительный прогресс в секвенировании ДНК нанопорами, такими как твердотельные нанопоры [2, 11] и белковые нанопоры [2, 7]. Секвенирование ДНК белковыми нанопорами уже реализовано [7]. Однако системы белковых нанопор имеют ограничения для изучения биологических молекул. Твердотельные нанопоры имеют меньше ограничений по сравнению с биологическими/белковыми нанопорами. Эти трудности могут быть преодолены твердотельными нанопорами. По сравнению с белковыми нанопорами, они функциональны в более широких диапазонах температур, напряжений и растворителей, и их диаметр можно настраивать с субнанометровой точностью. Они перспективны для применения в технологиях секвенирования ДНК нового поколения.

Создано множество твердотельных нанопор из различных материалов и структур для сенсоров ДНК. Однако секвенирование ДНК твердотельными нанопорами еще не достигнуто. Для сенсоров на твердотельных нанопорах необходимо преодолеть два главных препятствия — пространственное и временное разрешение — перед коммерческим применением. Проблема пространственного разрешения заключается в способности твердотельного нанопора различать крошечное расстояние между двумя соседними нуклеотидами для достижения одноосновного разрешения. Проблема временного разрешения — слишком быстрая транспортировка ДНК под действием электрического поля, что приводит к получению очень малого числа достоверных точек данных существующими патч-климпами или другими системами регистрации сигналов. В данном обзоре представлен обзор различных методов улучшения пространственного и временного разрешения детектирования ДНК твердотельными нанопорами, с основным акцентом на методах замедления транспортировки ДНК.

Пространственное разрешение

В 2001 году Ли и соавт. впервые сообщили о твердотельных нанопорах из нитрида кремния [12]. Различные твердотельные нанопоры демонстрировались для детектирования молекул ДНК, такие как оксид кремния [13], кремний [14], Al₂O₃ [15] и HfO₂ [16]. Хотя твердотельные нанопоры в конечном счете могут быть устойчивы к химическим и механическим условиям, у них есть ограничения, такие как низкое пространственное разрешение. Из-за толщины материалов десятки оснований могут одновременно проходить через твердотельные нанопоры. На данный момент самый тонкий нанопор из нитрида кремния имеет толщину 3 нм, что все равно не позволяет различать четыре вида оснований [17].

Интересно, что толщина однослойного двумерного (2D) материала составляет примерно 3,0–11,0 Å, что сравнимо с расстоянием между двумя соседними нуклеотидами вдоль однократной ДНК (3,2–5,2 Å) [18]. Двумерные мембраны, такие как графен (3,4 Å [19]), MoS₂ (6,5 Å [18]), WS₂ (7 Å [20]) и h-BN (11 Å [21]), демонстрировали детектирование транспортировки ДНК [21,22,23] благодаря высокому соотношению сигнал/шум и пространственному разрешению. Ясно, что эти материалы могут использоваться для детектирования ДНК. Кроме того, воспроизводимые методы выращивания и крупномасштабные процедуры переноса позволяют создавать субнанометровые поры в 2D мембранах в промышленных масштабах.

Графен — атомно тонкий слой атомов углерода, расположенных в двумерную сотовую решетку [24]. Исследователи продемонстрировали, что одиночные молекулы ДНК в растворе могут быть детектированы и охарактеризованы с помощью графеновых нанопор [22, 25]. Однако существуют сильные гидрофобные взаимодействия между нуклеотидами ДНК и графеном, из-за чего ДНК сильно засоряет и прилипает к графеновым нанопорам, что существенно влияет на скорость транспортировки [26]. Модификация гидрофильными группами [26] или покрытие гидрофильным материалом [25] на графене может улучшить гидрофильность и избежать прилипания ДНК. К сожалению, либо модификация гидрофильными группами, либо покрытие гидрофильными материалами увеличивает толщину подвесного слоя, что приводит к увеличению толщины нанопор и снижению пространственного разрешения графена.

Слоистые дихалкогениды переходных металлов — другой 2D материал, включающий MoS₂ [18, 27] и WS₂ [20]. При транспортировке ДНК через мембрану нанопора MoS₂ детектировалось высокое соотношение сигнал/шум (SNR > 10) и пятикратное усиление ионного тока [18]. При этом MoS₂ гидрофилен, поэтому специальная обработка поверхности для избежания гидрофобного взаимодействия с ДНК не требуется. Материал WS₂ имеет прямую запрещенную зону 2,1 эВ [28], и его фотолюминесценция (PL) сильнее, чем у хорошо изученного MoS₂ [29]. Данда и соавт. [20] изготовили нанопор WS₂ и продемонстрировали достижение атомно контролируемого размера нанопора с помощью коротких световых импульсов, что может положительно повлиять на твердотельные нанопоры для детектирования ДНК.

Кроме того, Лю и соавт. [21] сообщили о первом эксперименте транспортировки ДНК через нанопоры h-BN. Аналогично графену, h-BN обладает низкой гидрофильностью, что вызывает засорение нанопор ДНК. Позже Чжоу и соавт. [23] успешно улучшили гидрофильность нанопор h-BN с помощью УФ-озонной обработки, используя антиоксидационные свойства и целостность материала h-BN. Диэлектрическая природа h-BN может проявлять более устойчивые и изолирующие свойства в растворах с высокой ионной силой, чем графен. Это конкурентный кандидат для достижения одноосновного разрешения на сверхтонких нанопорных структурах.

Использование двумерных материалов потенциально может повысить пространственное разрешение устройства для достижения однонуклеотидного разрешения. Хотя сообщались эксперименты по детектированию ДНК для нескольких двумерных материалов, никто не докладывал об достижении секвенирования ДНК твердотельными нанопорами. Временное разрешение нанопорного секвенирования также остается проблемой.

Временное разрешение

Скорость транспортировки ДНК через твердотельный нанопор очень высока — до 0,01–1 мкс/основа [30], что приводит к получению очень малого объема эффективных данных коммерческими патч-климпами. Поэтому невозможно различить каждый основной элемент на основе сигнала блокадного тока. Скорости транспортировки ДНК твердотельными нанопорами из 2D материалов, таких как графен, MoS₂, WS₂ и h-BN, показаны на рис. 1. Идеально скорость транспортировки ДНК в нанопоре должна составлять 1–100 пар оснований/мс для удовлетворительной регистрации сигнала от каждого нуклеотида [32].

На этом фоне замедление скорости транспортировки ДНК — важная цель многих исследователей. Разработаны различные методы замедления транспортировки ДНК для улучшения временного разрешения детектирования твердотельными нанопорами. Обычный метод — изменение влияния экспериментальных факторов: температуры [33], вязкости электролита [27], управляющего напряжения [34], ионной концентрации [35] и плотности поверхностного заряда нанопора [36] на транспортировку ДНК. Ванун и соавт. [33] сосредоточились на замедлении транспортировки ДДНК через твердотельные нанопоры путем изменения температуры, напряжения и длины ДНК. Фен и соавт. [27] показали, что система с градиентом вязкости на основе комнатнотемпературных ионных жидкостей может использоваться для контроля динамики транспортировки ДНК через нанопоры MoS₂, и продемонстрировали, что высокая вязкость комнатнотемпературных ионных жидкостей обеспечивает оптимальную скорость транспортировки одиночных нуклеотидов 373 пары оснований/мс.

Хотя многие подходы могут снизить скорость транспортировки ДНК и облегчить детектирование ионного тока, они все равно не соответствуют требованиям секвенирования ДНК. Поэтому необходимо развивать более радикальные методы контроля прохождения ДНК через нанопоры. Здесь мы обсуждаем методы контроля структуры нанопора и количественного движения ДНК для улучшения временного разрешения.

Система двух нанопор

Исследователи использовали системы двух нанопор для манипулирования транспортировкой молекул ДНК, что позволяет контролируемо детектировать одну и ту же молекулу многократно. Два накопленных нанопора, разделенных микрометровой полостью [37] (рис. 2а), могут удерживать молекулы ДНК определенное время и контролируемо их выпускать. Динамику молекул ДНК можно вывести из сигналов двух пор корреляционным анализом, что дает прямое электрическое доказательство транспортировки. Кроме того, благодаря энтропийным барьерам двухслойной системы нанопор, броуновское движение молекул ДНК может быть ограничено, что повышает точность секвенирования ДНК нанопорами. В отличие от техник одиночного молекулярного сенсирования, молекулы ДНК могут измеряться многократно в двухслойных системах нанопор путем последовательной установки множественных пор вместо прохождения туда-обратно через один пор [39].

Двойные нанопорные системы предоставляют другой метод контроля молекулярного транспорта и эффективного мостикования молекул между двумя порами; это беспримечечный механистический подход к манипулированию ДНК [40]. В двойной нанопорной системе есть два независимо адресуемых и смежных нанопора в одной твердотельной мембране. Во время электрофоретически управляемого прохождения молекулы ДНК через один из нанопор, одиночная молекула ДНК может быть захвачена в оба пора, приводя к «перетягиванию каната» между двумя нанопорами [38] (рис. 2б). Таким образом, силы приложены к разным концам молекулы ДНК, что замедляет и даже полностью останавливает ее движение. Двойная нанопорная система открывает новый путь к механическому удерживанию ДНК в твердотельных нанопорах и является перспективной техникой для измерения широкого спектра биомолекул с преимуществами: беспримечечная, высокое соотношение сигнал/шум и низкая стоимость. Она может эффективно ограничивать и удерживать молекулы ДНК для замедления транспортировки и также использоваться для изучения физики этого наномасштабного перетягивания ДНК [41].

Оптический ловушковый нанопор

Оптические ловушковые нанопоры позволяют оптическим пинцетам удерживать частицы размером менее десятков нанометров. Это делает возможным оптическое удерживание белков [42], фрагментов ДНК [43] и других биомолекул [44], а также малых вирусов [45]. Базовая теория оптических ловушковых нанопор — самоиндуцированная обратная оптическая ловушка [46]. Лазерный луч, сфокусированный на области массива нанопор, создает локальное световое поле высокой плотности мощности на краю металлического слоя в отверстии. Когда частица движется между локальным световым полем, это вызывает большое изменение локальной оптической пропускной способности, что в свою очередь порождает большую оптическую и диэлектрическую силу на частице. Структура двойного наноотверстия используется для преодоления размерного ограничения захватываемых частиц. Мухаммад и соавт. [47] продемонстрировали потенциальное использование оптических ловушковых нанопор с 20-нм кремнеземными и Au наночастицами. Форма гантели двойного наноотверстия выфрезерована в Au пленке, и 25-нм нанопор просверлен через подвешенную Si_xN_y мембрану в середине двойного наноотверстия, как показано на рис. 3а. Электрофоретическая сила, движущая наночастицы через нанопор, при прохождении через край отверстия, самоиндуцированная обратная плазмонная сила, существующая между кончиками двойного наноотверстия, противодействует электрофоретической силе, снижая скорость наночастиц. Результаты показали, что оптическое удерживание удлинило время электрофоретической транспортировки на четыре порядка величины. Ким и соавт. [43] реализовали оптический захват плазмидной ДНК и лямбда-ДНК с помощью наноплазмонных структур одиночных нанопор. Технология имеет потенциальные применения для детектирования ДНК, и множественные локальные световые поля могут быть созданы для реализации параллельного детектирования. Однако высокочастотные осцилляции ионного тока могут влиять на результаты детектирования тока ДНК. Это может быть связано с конкуренцией между электрофоретической и самоиндуцированной обратной силами, заставляющими наночастицы плавать вверх-вниз через устье нанопора.

Оптические пинцеты

Оптические пинцеты могут использоваться для контроля молекулярной транспортировки через нанопоры и широко применяются в последние годы. В 2006 году Кейзер и соавт. [48] впервые продемонстрировали молекулярное перетягивание каната между электрофоретической и механической силами, применяя оптические пинцеты для контроля транспортировки ДНК через нанопоры SiN_x. Эта система действует как простая пружина Гука, и сила натяжения на шаре можно рассчитать по закону Гука: F_ot= −k_trapZ, где F_ot — оптическая сила, k_trap — жесткость ловушки вдоль направления смещения, Z — линейная деформация шара [48]. Метод оптических пинцет, удерживающий ДНК-сшитый полистироловый шар в пересечении сфокусированного лазерного луча, может манипулировать ДНК-сшитым полистироловым шаром в трех измерениях и имеет пиконьютоновую чувствительность к силе, как показано на рис. 4а. Для удержания транспортируемой ДНК внутри нанопора сила натяжения настраивалась для балансировки силы электрического поля (F_el) на ДНК. Следовательно, натяжение может использоваться как для снижения скорости транспортировки ДНК, так и для вытягивания молекулы ДНК из нанопора [52]. Эта система позволяет одновременно проводить пространственную выборку и высокоточные измерения сил нуклеиновых кислот и белков, что обеспечило значительный прогресс в секвенировании ДНК. Однако техника оптических пинцет страдает от нескольких фундаментальных трудностей. Во-первых, трудно масштабировать до большого числа нанопор. Во-вторых, нагрев, вызванный лазером в оптических пинцетах, сильно влияет на ионный ток через нанопор и уровень шума, требуя, чтобы оптически удерживаемый шар находился в нескольких микрометрах от нанопора [53].

Магнитные пинцеты

Магнитные пинцеты предоставляют другой способ контроля транспортировки ДНК силой натяжения, и продемонстрировано, что техника магнитных пинцет эффективна для замедления транспортировки ДНК [49]. В этой системе, как показано на рис. 4б, молекулы ДНК могут быть прикреплены к микрометровому магнитному шару с помощью сильного золото-тиол [54] или стрептавидин-биотин [49] взаимодействия. Затем свободный конец ДНК может быть захвачен в нанопор приложенным электрическим полем. Далее, два магнита с малым зазором могут использоваться для создания градиента магнитного поля. Эта техника может балансировать электрическую силу на захваченной ДНК для снижения скоростей транспортировки и даже обращения электрофореза. По сравнению с оптическими пинцетами, магнитные пинцеты являются перспективным кандидатом для массово-параллельной силовых спектроскопий. В этой системе сотни шаров и, следовательно, молекул ДНК могут одновременно контролироваться в сотнях нанопор, что легко масштабируется до множества адресуемых нанопор. Это может ускорить аналитический процесс на порядки. Однако по сравнению с оптическими пинцетами, один очевидный недостаток подхода магнитных пинцет — отсутствие трехмерного контроля молекул [55].

Силовой зонд

Хотя значительный прогресс достигнут в контроле скорости транспортировки ДНК оптическими и магнитными пинцетами, методы удержания шара имеют проблему броуновского движения, затрудняющую контроль движения шара с разрешением менее 10 нм [51]. Для преодоления этого АСМ использовался для контроля скорости транспортировки ДНК [50], и он также может одновременно измерять силу и блокадный ток. В исследовании с этой системой, как показано на рис. 4в, ДНК была привязана к кончику АСМ зонда, а затем закреплена в держателе зонда. Контролируя движение зонда, транспортировку ДНК можно было контролировать для снижения ее скорости и даже обращения электрофореза. Кроме того, отводя наконечник на высоту над поверхностью, соответствующую длине молекулы, измерения можно повторять. С помощью АСМ детектирование ДНК продвинулось на практике и теории, так как разрешение детектирования может быть значительно улучшено комбинированными сигналами блокадного тока и измерений силы АСМ [56]. Однако все еще существует препятствие в применении нанопорных техник в детектировании ДНК — периодическое возникновение регулярных флуктуаций силы (и тока) каждые 0,35–0,72 нм, когда молекула ДНК скользит относительно безтрение через нанопор. Эти флуктуации атрибутируются отдельным нуклеотидам, транслирующимся через нанопор в режиме турникетного движения [50].

Исследования продемонстрировали, что настройка вилки, используемая как датчик силы, может контролировать прохождение ДНК через нанопор с субнанометровой скоростью [51, 57]. В исследовании с этой интегрированной установкой, как показано на рис. 4г, молекула ДНК была прикреплена к кончику зонда, склеенному к одной вилке настройки. Нанопозиционирующая система, обладающая субнанометровой точностью, удерживала настройку вилки [51]. Позиция кончика зонда может быть 감지ена обратной связью на основе настройки вилки и контролирована манипулированием нанопозиционирующей системой. Эта скорость движения в 10 раз медленнее, чем ДНК, манипулируемая оптическими пинцетами, и в 1000 раз медленнее, чем ДНК, свободно проходящая через твердотельные нанопоры [57]. По сравнению с обычным АСМ, настройка вилки может обеспечивать более быстрое сканирующее движение и обладать высокой чувствительностью к силе при погружении в жидкость. Интегрируя TFFS с нанопором, ионный ток через нанопор, позиция кончика и амплитуда вибрации кончика могут одновременно измеряться во время прохождения молекулы ДНК через нанопор.

Si зонд

Все вышеперечисленные методы — магнитные пинцеты, оптические пинцеты, АСМ и TFFS — требуют сканирования позиции нанопора. Они должны локализовать нанопор в пределах эффективной длины ДНК, чтобы обеспечить прохождение ДНК через нанопор. Адресация нанопор — важная часть этих методов, но она сложна [32]. Исследователи соединили ДНК с большой поверхностью кремниевого зонда (рис. 5), превышающей площадь чипа, что позволяло легко вставлять иммобилизованную ДНК в нанопор без сканирования местоположения нанопора в мембране. Показана реализуемость использования ДНК-иммобилизованного Si зонда и контроллера позиции для контроля движения ДНК в и из нанопор. Сложность этого метода в том, что Si зонд погружен в раствор и соединен с ДНК пептидной связью. Плотность ДНК на поверхности зонда трудно контролировать, поэтому вероятно одновременное прохождение нескольких молекул ДНК через нанопор, что влияет на детектируемый ток.

Оптические пинцеты, магнитные пинцеты, атомно-силовая микроскопия (АСМ) и чувствительство силы на основе настройки вилки (TFFS) могут детектировать реальные силы и позицию молекулы в нанопоре, что перспективно для контроля прохождения ДНК через нанопоры с подходящей скоростью. Сложность адресации нанопор избегается использованием Si зонда. Кроме того, использование двухнанопорной системы — реализуемый метод контроля и замедления прохождения ДНК через нанопоры. Также оптический ловушковый нанопор имеет потенциал для детектирования ДНК в будущем. Здесь мы суммировали скорость транспортировки ДНК твердотельного нанопора, интегрированного с некоторыми методами контроля ДНК, такими как двухнанопорная система, оптический ловушковый нанопор, оптические пинцеты, магнитные пинцеты, АСМ, TFFS и Si зонд (таблица 1).

Заключение

Монослойные 2D материалы, такие как графен, MoS₂, WS₂ и h-BN, возможно, являются самыми тонкими достижимыми материалами, так как их толщина сравнима с расстоянием между нуклеотидами. По сравнению с традиционными мембранами твердотельных нанопор, монослойные 2D мембраны идеальны для нанопорных устройств, так как они демонстрируют высокое соотношение сигнал/шум ионического тока и относительно большие области сенсирования. Они потенциально пригодны для реализации секвенирования ДНК в комбинации с оптическими пинцетами, магнитными пинцетами, АСМ, TFFS, Si зондом, двухнанопорной системой или оптическим ловушковым нанопором. Однако с этими техниками возникли несколько проблем, которые нужно решить перед коммерциализацией нанопорного секвенирования ДНК. Первая возникает, когда шарики или кончики зондов находятся близко к нанопору, когда труднее дискриминировать нуклеотиды ДНК ионными токовыми сигналами. Молекулярные ручки или другие более длинные молекулы должны использоваться для увеличения длины цепи ДНК, которая может компенсировать влияние на токовый сигнал, вызванное шариками или кончиками. Вторая — массивы нанопор должны использоваться для реализации высокопроизводительного и параллельного детектирования, но технология параллельного детектирования пока недостаточно зрела. Третья — согласно современным методамfabrikации, трудно изготовить двухнанопорную систему и систему оптического ловушкового нанопора с высокой точностью и воспроизводимостью, что очень существенно для нанопорного детектирования ДНК. Гелий-ионный пучок может стать ключевой технологией для решения этой проблемы [11, 58]. Таким образом, ожидаем, что нанопорное секвенирование ДНК продолжит быть фокусом исследований и может быть интегрировано с новыми идеями и инновационными подходами для реализации низких ошибок, быстрой и высокопараллельной регистрации и длинных чтений до 100 килобаз.