Синтез ДНК

<час />

Фон

Синтез дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) - это процесс, с помощью которого создаются копии цепей нуклеиновых кислот. В природе синтез ДНК происходит в клетках с помощью механизма, известного как репликация ДНК. Используя генную инженерию и химию ферментов, ученые разработали искусственные методы синтеза ДНК. Наиболее важным из них является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Впервые разработанная в начале 1980-х годов, PCR превратилась в отрасль с многомиллиардным оборотом, а оригинальный патент был продан за 300 миллионов долларов.

История

ДНК была открыта в 1951 году Фрэнсисом Криком, Джеймсом Уотсоном и Морисом Уилкинсом. Используя данные рентгеновской кристаллографии, полученные Розалинд Франклин, Уотсон и Крик определили, что структура ДНК представляет собой двойную спираль. За эту работу Уотсон, Крик и Уилкинс получили Нобелевскую премию по физиологии и медицине в 1962 году. На протяжении многих лет ученые работали с ДНК, пытаясь выяснить «код жизни». Они обнаружили, что ДНК служила кодом инструкций для белковых последовательностей. Они также обнаружили, что каждый организм имеет уникальную последовательность ДНК, и ее можно использовать для целей скрининга, диагностики и идентификации. Одна вещь, которая оказалась ограничивающей в этих исследованиях, - это количество ДНК, доступное из одного источника.

После того, как природа ДНК была определена, ученые смогли изучить состав клеточных генов. Ген - это определенная последовательность пар оснований ДНК, которая обеспечивает код для построения белка. Эти белки определяют особенности организма, такие как цвет глаз или группа крови. Когда определенный ген был выделен, стало желательно синтезировать копии этой молекулы. Одним из первых способов синтеза большого количества определенной ДНК была генная инженерия.

Генная инженерия начинается с объединения интересующего гена с бактериальной плазмидой. Плазмида - это небольшой участок ДНК, который содержится во многих бактериях. Полученная гибридная ДНК называется рекомбинантной ДНК. Затем эту новую плазмиду рекомбинантной ДНК вводят в бактериальные клетки. Затем клетки клонируют, давая им возможность расти и размножаться в культуре. По мере того, как клетки размножаются, копии вставленного гена тоже размножаются. Когда бактерии достаточно размножатся, можно выделить несколько копий встроенного гена. Этот метод синтеза ДНК может произвести миллиарды копий гена за пару недель.

В 1983 году время, необходимое для создания копий ДНК, было значительно сокращено, когда Кэри Маллис разработала процесс синтеза ДНК, называемый полимеразной цепной реакцией (ПЦР). Этот метод намного быстрее, чем предыдущие известные методы, позволяя получить миллиарды копий цепи ДНК всего за несколько часов. Он начинается с помещения небольшого участка двухцепочечной ДНК в раствор, содержащий ДНК-полимеразу, нуклеотиды и праймеры. Раствор нагревают для разделения цепей ДНК. При охлаждении полимераза создает копию каждой нити. Процесс повторяется каждые пять минут, пока не будет произведено желаемое количество ДНК. В 1993 году разработка Маллисом ПЦР принесла ему Нобелевскую премию по химии. Сегодня ПЦР произвела революцию в области медицинской диагностики, судебной медицины и микробиологии. Считается, что это одно из самых важных достижений в генетических исследованиях.

Фон

Ключом к пониманию синтеза ДНК является понимание его структуры. ДНК - это длинноцепочечный полимер, состоящий из химических единиц, называемых нуклеотидами. ДНК, также известная как генетический материал, представляет собой молекулу, несущую информацию, которая определяет синтез белка в большинстве живых организмов. Обычно ДНК существует в виде двух цепочек химически связанных нуклеотидов. Эти ссылки следуют определенным шаблонам, продиктованным правилами базового спаривания. Каждый нуклеотид состоит из молекулы сахара дезоксирибозы, фосфатной группы и одного из четырех азотсодержащих оснований. Основания включают пиримидины тимин (T) и цитозин (C), а также пурины аденин (A) и гуанин (G). В ДНК аденин обычно связывается с тимином, а гуанин - с цитозином. Молекула расположена в структуре, называемой двойной спиралью, которую можно представить, изобразив витую лестницу или винтовую лестницу. Основания составляют ступеньки лестницы, а части сахара и фосфата - боковины лестницы. Порядок, в котором связаны нуклеотиды, называемый последовательностью, определяется процессом, известным как секвенирование ДНК.

В эукариотической клетке синтез ДНК происходит непосредственно перед делением клетки посредством процесса, называемого репликацией. Когда начинается репликация, две цепи ДНК разделяются различными ферментами. Открытая таким образом каждая прядь служит шаблоном для создания новых прядей. Весь этот процесс катализируется ферментом ДНК-полимеразой. Эта молекула приводит соответствующие или комплементарные нуклеотиды в соответствие с каждой из цепей ДНК. Затем нуклеотиды химически связываются с образованием новых цепей ДНК, которые являются точными копиями исходной цепи. Эти копии, называемые дочерними цепями, содержат половину родительской молекулы ДНК и половину совершенно новой молекулы. Репликация этим методом называется полуконсервативной репликацией. Процесс репликации важен, потому что он дает возможность клеткам передавать точную копию своего генетического материала от одного поколения клеток к другому.

Сырье

Первичные исходные материалы, используемые для синтеза ДНК, включают исходные материалы ДНК, ДНК-полимеразу taq, праймеры, нуклеотиды и буферный раствор. Каждый из них играет важную роль в производстве миллионов молекул ДНК.

Контролируемый синтез ДНК начинается с определения небольшого сегмента ДНК, который нужно скопировать. Обычно это определенная последовательность ДНК, которая содержит код желаемого белка. Этот материал, называемый матричной ДНК, необходим в концентрациях около 0,1–1 мкг. Он должен быть высокоочищенным, потому что даже следовые количества соединений, используемых при очистке ДНК, могут ингибировать процесс ПЦР. Один из методов очистки цепи ДНК - обработка ее 70% этанолом.

Хотя процесс репликации ДНК был известен до 1980 года, ПЦР была невозможна, поскольку не существовало известных термостабильных ДНК-полимераз. ДНК-полимераза - это фермент, который катализирует реакции, участвующие в синтезе ДНК. В начале 1980-х годов ученые обнаружили бактерии, обитающие вокруг естественных паровых отверстий. Оказалось, что эти организмы, получившие название thermus aquaticus, ДНК-полимераза была стабильной и работала при очень высоких температурах. Это taq ДНК-полимераза стала краеугольным камнем современных методов синтеза ДНК. Во время типичного процесса ПЦР 2-3 мкг taq Нужна ДНК-полимераза. Однако, если использовать слишком много, могут возникнуть нежелательные неспецифические последовательности ДНК.

Полимераза строит нити ДНК, комбинируя соответствующие нуклеотиды на каждой нити ДНК. С химической точки зрения нуклеотиды состоят из трех типов молекулярных групп, включая сахарную структуру, фосфатную группу и циклическое основание. Сахарная часть обеспечивает первичную структуру всех нуклеотидов. Обычно сахара состоят из пяти атомов углерода с рядом присоединенных гидрокси (-ОН) групп. Для ДНК сахар - это 2-дезокси-D-рибоза. Определяющей частью нуклеотида является гетероциклическое основание, ковалентно связанное с сахаром. Эти основания представляют собой пиримидиновые или пуриновые группы, и они составляют основу кода нуклеиновой кислоты. Обнаружены два типа пуриновых оснований, включая аденин и гуанин. В ДНК присутствуют два типа пиримидиновых оснований:тимин и цитозин. Фосфатная группа составляет последнюю часть нуклеотида. Эта группа образована фосфорной кислотой и ковалентно связана со структурой сахара на пятом атоме углерода.

Первая фаза полимеразной цепной реакции (ПЦР) включает денатурацию ДНК. Это «открытие» молекулы ДНК обеспечивает матрицу для следующей молекулы ДНК, из которой она будет произведена. Когда ДНК расщепляется на отдельные цепи, температура понижается - стадия отжига праймера. На следующем этапе ДНК-полимераза взаимодействует с цепями и добавляет комплементарные нуклеотиды по всей длине. Время, необходимое на этой фазе, составляет около одной минуты на каждую 1000 пар оснований.

Чтобы инициировать синтез ДНК, необходимо использовать короткие участки праймера ДНК. Эти участки праймера, называемые олигофрагментами, имеют длину около 18-25 нуклеотидов и соответствуют участку на матричной ДНК. Обычно они имеют концентрацию нуклеотидов C и G около 60% с равномерным распределением. Это обеспечивает максимальную эффективность процесса синтеза.

Буферный раствор обеспечивает среду, в которой может происходить синтез ДНК. Это водный раствор, содержащий MgCl2, HCl, EDTA и KCl. Концентрация MgCl2 важна, потому что ионы Mg2 + взаимодействуют с ДНК и праймерами, создавая важные комплексы для синтеза ДНК. Рекомендуемая концентрация составляет от одного до четырех микромолей. Уровень pH этой системы имеет решающее значение, поэтому она также может быть забуферена сульфатом аммония. Чтобы активизировать реакцию, добавляются молекулы различной энергии, такие как АТФ, ГТФ и NTP. Это те же соединения, которые живые организмы используют для ускорения метаболических реакций.

Другие материалы, которые можно использовать в процессе, включают минеральное масло или парафин. После завершения синтеза ДНК ее обычно выделяют и очищают. Некоторые общие реагенты, используемые в этом процессе, включают фенол, ЭДТА и протеиназу К.

Производственный процесс

Синтез ДНК обычно проводится в небольших лабораториях. Он включает три различных процесса, включая подготовку образца, цикл реакции синтеза ДНК и выделение ДНК. Эти производственные операции обычно выполняются на отдельных участках, чтобы избежать загрязнения. Следуя этим процедурам, ученые могут преобразовать несколько нитей ДНК в миллионы и миллионы точных копий.

Подготовка образцов

• 1 Чтобы начать синтез ДНК, готовятся различные растворы. Обычно это делается в шкафу с ламинарным потоком, оборудованном УФ-лампой, чтобы минимизировать загрязнение. Ученые используют свежие перчатки на каждом этапе производства по тем же причинам. Обычно все исходные растворы, за исключением праймеров, полимераз и дНТФ, помещают в автоклав, чтобы убить любой контаминант. Сделаны два отдельных решения. Один содержит буфер, праймеры и полимеразу. Другой содержит MgCl2 и матричную ДНК. Все эти растворы помещают в маленькие пробирки, чтобы начать реакцию.

Кэри Бэнкс Муилис.

Кэри Бэнкс Муилис родилась в Ленуаре, Северная Каролина, в 1944 году. После окончания Технологического института Джорджии в 1966 году со степенью бакалавра наук. В области химии Муилис поступил в докторантуру по биохимии Калифорнийского университета в Беркли. Получение докторской степени. В 1973 году он принял должность преподавателя в Медицинской школе Канзасского университета в Канзас-Сити. В 1977 году он получил докторскую степень в Калифорнийском университете в Сан-Франциско.

Муилис стал исследователем в 1979 году в растущей биотехнологической фирме Cetus Corporation в Эмеривилле, Калифорния, которая синтезировала химические вещества, используемые другими учеными для генетического клонирования. Находясь там, он разработал полимеразную цепную реакцию (ПЦР), быстрый и эффективный метод воспроизведения определенных генов или фрагментов ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты), которые могут создавать миллиарды копий за несколько часов. Самый эффективный способ воспроизвести ДНК - клонирование, но это было проблематично. Потребовалось время, чтобы убедить коллег Муллиса в важности этого открытия, но вскоре ПЦР стала центром интенсивных исследований. Ученые из Cetus разработали коммерческую версию процесса и машину под названием Thermal Cycler (с добавлением химических строительных блоков ДНК [нуклеотидов] и биохимического катализатора [полимеразы], машина будет автоматически выполнять процесс на целевом элементе. ДНК).

Cetus наградил Муйлиса 10 000 долларов на разработку патента ПЦР, а затем продал его за 300 миллионов долларов. Покинув Cetus в 1986 году, Муйлис стал частным консультантом по биохимическим исследованиям и был удостоен Нобелевской премии в 1993 году.

Цикл синтеза ДНК

• 2 После приготовления реагирующих растворов запускается цикл ПЦР. Первая фаза включает денатурацию ДНК. Одним из наиболее важных начальных шагов является полная денатурация ДНК-матрицы. Денатурация ДНК по существу означает разрыв цепи с двойной связью. Это «открытие» молекулы ДНК обеспечивает матрицу для следующей молекулы ДНК, из которой она будет произведена. Неполная денатурация приведет к неэффективной копии в первом цикле, что негативно повлияет на каждый последующий цикл. Первоначальная денатурация осуществляется путем нагревания раствора матрицы ДНК до 203 ° F (95 ° C) в течение одной-трех минут. Общее время зависит от состава шаблона. В повторяющихся циклах этап денатурации длится около двух минут и включает нагревание раствора до 201PF (94 ° C). К раствору могут быть добавлены дополнительные материалы для облегчения денатурации ДНК, такие как глицерин, ДМСО или формамид.
• 3 После разделения ДНК на отдельные цепи температура понижается до 122–149 ° F (50–65 ° C). Это называется этапом отжига праймера и длится около двух минут. На этом этапе левый и правый праймеры совпадают и химически связываются со своими комплементарными основаниями на матричной ДНК.
• 4 Следующий этап включает этап расширения. В этой части реакции копируется большая часть цепи ДНК. Температура системы повышается примерно до 162 ° F (72 ° C) и поддерживается на этом уровне в зависимости от длины копируемой ДНК. На этом этапе ДНК-полимераза взаимодействует с цепями и добавляет комплементарные нуклеотиды по всей длине. Время, необходимое на этой фазе, составляет около одной минуты на каждую 1000 пар оснований.
• 5 После этого первого цикла цикл синтеза ДНК повторяется. Количество циклов зависит от количества исходной ДНК и желаемого количества ДНК. Если доступно менее 10 копий матричной ДНК, необходимо 40 циклов. При большем количестве исходной ДНК достаточно 25-30 циклов.
• 6 Во время последнего цикла образец выдерживают при 162 ° F (72 ° C) примерно 15 минут. Это позволяет заполнить (нуклеотидами) любые выступающие концы новой цепи ДНК. На этом этапе полимераза добавляет дополнительные нуклеотиды A на одном конце цепи ДНК.

Выделение ДНК

• 7 По завершении реакций ДНК выделяют из материалов, реагирующих на ПЦР, таких как ДНК-полимераза, MgCl2 и праймеры. Это делается путем добавления таких соединений, как фенол, ЭДТА и протеиназа К. Центрифугирование также полезно в этом отношении.

Будущее

Хотя ученые регулярно используют ПЦР для синтеза ДНК, многое еще не известно о репликации ДНК. В будущем исследования должны пролить свет на детали нескольких важных этапов процесса, такие как компоненты и промежуточные соединения. Кроме того, могут быть разработаны улучшенные полимеразы, позволяющие создавать больше ДНК из меньших исходных образцов. Есть надежда, что однажды синтез ДНК поможет раскрыть некоторые ключевые аспекты живых организмов и приведет к разработке лекарств, которые будут лечить различные виды рака, вирусные и бактериальные инфекции.