ДНК-базированный наногидрогель с мощной антиопухолевой иммуностимуляционной активностью

Аннотация

Неметилированные CpG олигодеоксинуклеотиды (CpG‑ODN) являются мощными активаторами врожденного и адаптивного иммунитета, однако их быстрая деградация в сыворотке ограничивает клиническую полезность. Мы спроектировали CpG‑MCA наногидрогели методом мульти-праймированной цепной амплификации (MCA), генерируя гидрогели, богатые тандемными CpG повторами. Полученные CpG‑MCA гели устойчивы к нуклеазной деградации, легко интериоризируются макрофагами RAW264.7 и запускают надежную секрецию фактора некроза опухоли-α (TNF-α) и интерлейкина-6 (IL-6). В ко-культуре с человеческими глиомными клетками U251 CpG‑MCA гели заметно подавляли пролиферацию опухолевых клеток, превосходя конвенциональные CpG‑ODN и CpG‑RCA гели. Эти находки демонстрируют, что CpG‑MCA наногидрогели — мощный, биосовместимый иммуностимулянт с сильной антиопухолевой активностью.

Введение

Бактериальная ДНК, содержащая неметилированные CpG мотивы, служит эффективным адъювантом и антираковым агентом за счет вовлечения Toll-подобного рецептора 9 (TLR9) на дендритных клетках, макрофагах и других иммунных клетках. Однако CpG‑ODN подвержен адсорбции белков и нуклеазному перевариванию, что подрывает его стабильность и потенцию in vivo. Инкапсуляция в транспортные средства или самоорганизация в высшие ДНК наноструктуры улучшила стабильность и клеточное всасывание, но вызовы такие как цитотоксичность и ограниченная загрузка остаются.

ДНК наноматериалы — тетраэдры, X-образные решетки и гидрогелевые сети — показали улучшенную клеточную интериоризацию и индукцию цитокинов по сравнению с линейными олигонуклеотидами. Катушка-амплификация (RCA) дает наноцветочные гидрогели, защищающие CpG мотивы и усиливающие иммунную сигнализацию. Строя на этой концепции, мы применили мульти-праймированную цепную амплификацию (MCA) для производства CpG‑MCA гидрогелей, содержащих тысячи CpG повторов и формирующих наноцветочные структуры. Мы предполагаем, что эти гидрогели обеспечат превосходную стабильность, всасывание и иммуностимуляцию, тем самым ингибируя рост твердых опухолей.

Материалы и методы

Материалы

Все олигонуклеотиды синтезировали (Sangon Biotech, Шанхай) и очистили HPLC. Реактивы для MCA и RCA, включая phi29 ДНК полимеразу, T4 ДНК лигазу, dNTPs и буферы, получили от Thermo Fisher и New England Biolabs. Клеточные линии RAW264.7 (мышиный макрофаг) и U251 (человеческая глиома) получены от Китайской академии наук. Наборы ELISA (R&D Systems) и CCK‑8 (Dojindo) использовали для квантификации цитокинов и тестов жизнеспособности.

Подготовка циркулярных ДНК матриц

Фосфорилированная односторонняя ДНК (SS‑DNA) содержащая CpG праймеры отжигали при 95 °C 5 мин и охлаждали до 4 °C. Лигаза добавляли overnight при 4 °C для формирования циркулярных матриц; ферменты инактивировали при 75 °C 10 мин.

Конструкция CpG‑MCA и CpG‑RCA гидрогелей

10 мкл аликвота циркулярной матрицы смешивали с 1× phi29 буфером, 4 мМ dNTPs и 5 Ед phi29 полимеразы до 50 мкл объема. Инкубация при 30 °C 12 ч производила RCA гель (R12). Для MCA, после 4 ч RCA, 500 пМ праймеров 2 и 3 добавляли и инкубировали оставшееся время (R4M4 и R4M8). Полимеры инактивировали теплом при 65 °C и очистили ультрафильтрацией.

Характеризация

Агарозная гель электрофорез подтвердила формирование гидрогелей. ТЭМ и SEM раскрыли наноцветочные морфологии от 100 нм до нескольких микрометров. Цитотоксичность оценивали CCK‑8; всасывание визуализировали Cy5-маркировкой и конфокальной микроскопией; секреция цитокинов измеряли ELISA; геновую экспрессию квантовали qRT-PCR.

Тест стабильности

Гидрогели инкубировали в 10 % FBS-DMEM или PBS при 37 °C; остаточная ДНК квантовали NanoDrop, и паттерны деградации мониторили агарозной гель электрофорезом.

Ко-культура с U251 клетками

RAW264.7 клетки сеяли в верхнюю камеру Transwell; U251 клетки помещали в нижнюю камеру. После 24 ч лечения CpG‑ODN, CpG‑RCA или CpG‑MCA гелями, пролиферацию U251 оценивали клоногенным тестом.

Результаты и обсуждение

Формирование циркулярных матриц и успешная амплификация подтвердились агарозной гелью: продукт MCA (R4M4/R4M8) и продукт RCA (R12) демонстрировали высокомолекулярное удержание и наноцветочный внешний вид на ТЭМ/SEM.

Конфокальная визуализация продемонстрировала, что CpG‑MCA гели эффективно интериоризировались RAW264.7 клетками, со средней флуоресцентной интенсивностью >10× по сравнению с линейным CpG‑ODN (p < 0,0001), указывая на превосходное всасывание благодаря наноцветочной архитектуре.

Исследования стабильности показали, что CpG‑MCA гели удерживали ~85 % своего ДНК содержимого после 24 ч в 10 % FBS-DMEM, тогда как линейный CpG‑ODN деградировал >90 % в течение 12 ч, подчеркивая защитный эффект гидрогелевой матрицы.

In vitro иммуностимуляционные тесты раскрыли, что CpG‑MCA гели индуцировали секрецию TNF-α и IL-6 на уровнях 3–27× выше CpG‑ODN (p < 0,0001). Особенно R4M8 произвела самый сильный цитокиновый отклик, коррелируя с ее более высоким числом копий CpG.

Анализ геновой экспрессии показал значительную углечение TLR9, TNF-α и IL-6 транскриптов в CpG‑MCA-обработанных клетках, вместе с увеличением CD86 и снижением CD206 поверхностных маркеров, указывая на смещение к про-воспалительному M1 фенотипу.

Миграционные тесты (Transwell и царапина раны) выявили, что CpG‑MCA гели стимулировали миграцию RAW264.7 больше CpG‑ODN, улучшая потенциал иммунной клетки инфильтрации в опухоли.

Ко-культура с U251 глиомными клетками продемонстрировала выраженное снижение клонообразования: R4M8 достигла 12 % клонообразования относительно контроля CpG‑ODN (p < 0,001), подтверждая мощную антиопухолевую активность, медированную CpG‑MCA-индуцированным цитокиновым высвобождением.

Заключение

Мы успешно спроектировали CpG‑MCA наногидрогели, включающие тысячи CpG мотивов, придающие нуклеазную устойчивость, эффективное макрофагное всасывание и надежную индукцию Th1-тип цитокинов. Эти гидрогели эффективно подавляют пролиферацию глиомных клеток in vitro, подчеркивая их обещание как биосовместимого иммуностимулянта для раковой терапии.

Доступность данных и материалов

Наборы данных, поддерживающие это исследование, доступны у соответствующего автора по обоснованному запросу.

Аббревиатуры

CpG‑MCA gels

ДНК гидрогель, сгенерированный мульти-праймированной цепной амплификацией

CpG‑RCA gel

ДНК гидрогель, сгенерированный катушкой амплификацией

MCA

Мульти-праймированная цепная амплификация

R12

RCA-производный CpG гель

R4M4, R4M8

CpG‑MCA гидрогели с 4 или 8 праймерными расширениями

R12‑C, R4M4‑C, R4M8‑C

Гидрогели без CpG мотивов