Эффективная генная терапия колоректального рака с помощью катионных DOTAP-PEG-PCL мицелл для доставки siRNA

Аннотация

siRNA-базированная генная терапия предлагает перспективный путь для лечения колоректального рака, однако безопасная и эффективная доставка остается узким местом. Мы спроектировали катионную мицеллу (DMP), интегрируя биосовместимый полимер mPEG-PCL с катионным липидом DOTAP, получив стабильный положительно заряженный носитель. DMP/siRNA комплексы, таргетирующие Bcl-xl и Mcl-1, демонстрировали высокую трансфекционную эффективность (>85%) в клетках колоректального рака C26, минимальную цитотоксичность (IC₅₀ = 3.7 мкг/мл в 293T клетках) и надежное генно-глушение. В субкутанной ксенограммной модели C26 внутриопухолевые инъекции DMP/siBcl-xl и DMP/siMcl-1 снизили объемы опухолей на 65% и 55% соответственно, без наблюдаемой органной токсичности. Эти находки устанавливают DMP мицеллы как безопасную, эффективную платформу доставки siRNA для генной терапии колоректального рака.

Введение

Колоректальный рак остается ведущей причиной онкологической смертности во всем мире, требуя инновационных терапевтических стратегий. Генная терапия, особенно через siRNA-опосредованный нокаут онкогенов, может селективно запускать а폽тоз в опухолевых клетках. Однако клиническая трансляция опирается на невирусные векторы, сочетающие высокую трансфекционную эффективность, низкую иммуногенность и биосовместимость. Амфифильный полимер mPEG-PCL предлагает биодеградируемость и стелс-свойства, в то время как катионный липид DOTAP обеспечивает надежное связывание нуклеиновых кислот. Предыдущая работа показывала, что DMP мицеллы безопасно доставляют плазмидную ДНК; здесь мы оцениваем их способность транспортировать siRNA, таргетирующий анти-апоптотические белки Bcl-xl и Mcl-1, ключевые драйверы выживания колоректального рака.

Материалы и методы (кратко)

• Подготовка DMP: mPEG-PCL (M_n ≈ 4 кДа) и DOTAP (5–20 мг) ко-растворяли в дихлорметане, испаряли в тонкую пленку и регидратировали водой. Полученные мицеллы имели средний диаметр 145 нм и дзета-потенциал +46 мВ.
• Комплексация siRNA: siRNA (50 нМ) смешивали с DMP при массовом соотношении 30:1 (DMP:siRNA) для формирования стабильных комплексов, подтвержденных ретардацией в агарозном геле.
• In vitro анализы: Трансфекционная эффективность измеряли потоковой цитометрией с FAM-маркированным siRNA; цитотоксичность — MTT; а폽тоз — Annexin V/PI окраской; генно-глушение — qPCR.
• In vivo исследование: Мыши BALB/c с субкутанными C26 опухолями получали внутриопухолевые инъекции DMP/siRNA (10 мкг на дозу) через день на 5 циклов. Объем и вес опухолей фиксировали; гистология (H&E) и TUNEL-ассией оценивали безопасность и а폽тоз.

Результаты

Характеристика мицелл

DMP мицеллы демонстрировали узкое распределение размеров (PDI = 0.32), положительный заряд поверхности (+46 мВ) и оставались стабильными >96 ч в водном растворе. Гель-ретардация показала полную инкапсуляцию siRNA при соотношениях DMP/siRNA ≥30:1.

Низкая цитотоксичность и высокая трансфекция

IC₅₀ значения: 3.7 мкг/мл (293T) и 0.50 мг/мл (C26), заметно ниже PEI25K (IC₅₀ < 0.1 мкг/мл). Трансфекционная эффективность превышала 85% в безсывороточных и 71–81% в 30% ФБС условиях, сопоставимо с PEI.

siRNA-опосредованное генно-глушение

qPCR показал >70% снижение транскриптов Bcl-xl и Mcl-1 при 50–100 нМ DMP/siRNA. Клонообразовательные и MTT-ассие подтвердили значительное подавление пролиферации C26 (жизнеспособность 56–70%). Апоптотический уровень вырос до 33–38% в обработанных клетках.

In vivo противоопухолевая эффективность

Внутриопухолевые инъекции DMP/siBcl-xl и DMP/siMcl-1 снизили объемы опухолей на 65% и 55% соответственно, веса опухолей упали до 0.34–0.42 г от 0.85 г в контроле. Гистопатологических аномалий в сердце, печени, селезенке, легких или почках не наблюдалось.

Обсуждение

Частичное экранирование положительных зарядов DOTAP мPEG-PCL снижает интерференцию сывороточных белков и цитотоксичность, сохраняя связывание и эффективность доставки siRNA. Этот дизайн решает ключевые ограничения конвенциональных катионных липидов и демонстрирует реализуемость DMP мицелл как универсального, низкотоксичного siRNA носителя для солидных опухолей.

Заключение

DMP мицеллы эффективно доставляют siRNA против Bcl-xl и Mcl-1, индуцируя а폽тоз и ингибируя рост опухолей in vitro и in vivo с минимальной токсичностью. Они представляют перспективную невирусную платформу для генной терапии колоректального рака.