ДНК-тетраэдрические нанопереносчики усиливают доксорубицин-индуцированную апоптоз в клетках колиточного рака HT-29

Аннотация

Как наноразмерный переносчик лекарства с преимуществом модифицируемости и подходящей биосовместимостью, доставка ДНК-тетраэдра (ДНК-тетра) надеется усилить ингибиторную эффективность нетаргетированных антираковых препаратов. В этом исследовании доксорубицин (Dox) собирали с фолиевой кислотой-модифицированным ДНК-тетра через клик-химию для подготовки таргетированного антиопухолевого агента. Эффективность клеточного поглощения измеряли флуоресцентной визуализацией. Цитотоксичность, ингибиторная эффективность и соответствующий механизм на клетковой линии колиточного рака HT-29 оценивали MTT-тестом, кривой пролиферации клеток, вестерн-блотом и потоковой цитометрией. ДНК-тетра не индуцировала цитотоксичность, но соотношение клеточного поглощения очевидно увеличилось благодаря ДНК-тетра-фасилитированному проникновению через клеточную мембрану. Соответственно, фолиевая кислота-ДНК-тетра-Dox заметно повысила антиопухолевую эффективность с увеличенными уровнями апоптоза. В деталях, 100 мкМ была эффективной концентрацией и 6-часовой период инкубации необходим для индукции апоптоза. В заключение, наноразмерный ДНК-тетраэдр был безопасной и эффективной системой доставки для Dox и соответственно усилил антирактическую эффективность.

Введение

Доксорубицин (Dox) — один из наиболее широко используемых антинеопластических агентов, и многочисленные клинические исследования показали, что Dox может ярко препятствовать росту опухолевых клеток в различных циклах клеточного роста, ингибируя синтез РНК и ДНК [1, 2]. Предыдущие исследования предполагали, что пролиферация опухолевых клеток эффективно блокировалась в G1 фазе, а метастазирование также ингибировалось Dox при определенной концентрации [3]. Кроме того, эффективная ингибиция достигается при относительно меньшей дозе по сравнению с другими антираковыми препаратами [4]. Однако Dox обычно индуцирует побочные эффекты из-за отсутствия специфической таргетировки опухолевых клеток и неселективной ингибиции ДНК и РНК, что серьезно ограничивает клинические применения [5, 6]. В то же время, низкая клеточная способность поглощения снижает накопление Dox в опухолевых клетках [7]. Поэтому эффективная система доставки для Dox должна быть разработана, чтобы сделать Dox более специфическим и эффективным в таргетировании, более легко инкапсулируемым, и обладающим отличной способностью поглощения и биосовместимостью.

Наноразмерные переносчики лекарств, такие как липосомы и неорганические наночастицы, могут облегчить проникновение Dox через мембрану опухолевой клетки, улучшая эффективность таргетирования [8]. Тем не менее, липосомная доставка не может снизить побочные эффекты на нормальные клетки из-за относительно плохой таргетировки; в то же время неорганические переносчики, такие как мезопористые кремнеземные наночастицы, не могут полностью биодеградироваться in vivo, препятствуя дальнейшему поглощению лекарства и принося потенциальную биотоксичность. Для этих функциональных систем доставки сложность приготовления, неоднородность наночастичных структур и низкая инкапсуляционная эффективность препятствуют клиническому расширению [9,10,11]. Как наноразмерный переносчик лекарства с отличной производительностью по доставке лекарств, ДНК-базированные структуры, такие как ДНК-тетраэдр (ДНК-тетра), могут проникать через мембрану, избегая несовместимости между электронегативной ДНК и плазматической мембраной [12,13,14,15,16,17]. Лекарства и таргетирующие молекулы могут быть ковалентно присоединены к ДНК-тетраэдру. Кроме того, легкое поглощение и биодеградация ДНК-тетраэдрических последовательностей избегают длительного удержания. Гуанин-богатые аптамерные препараты, такие как AS1411, успешно доставлялись в опухолевые клетки A549 и выполнялись как таргетирующие агенты и ингибиторы [18]. Иммунорегуляторные факторы, такие как CpG и siRNA, также могут доставляться в опухолевые клетки через ДНК-тетра переносчик для регуляции иммунных ответов [19]. С преимуществами низкой токсичности, подходящей биосовместимости и настраиваемой таргетировки, ДНК-тетра показала биобезопасность и потенциал для доставки Dox.

В этом исследовании функциональные частицы ДНК-тетраэдра, собранные с Dox как антираковым препаратом и фолиевой кислотой как специфическими молекулами распознавания [20], проектировались, синтезировались и характеризовались. Антираковая эффективность оценивалась на клетках колиточного рака, учитывая значительную упрегуляцию фолатовых рецепторов на поверхности клеточной мембраны. Конкретно измерялись уровень клеточного поглощения, степень Dox-индуцированного апоптоза и ингибиция клеточной пролиферации на линий HT-29.

Методы

Реактивы и оборудование

Олигонуклеотидные цепи ДНК приобрели у TAKARA в Даляне, Китай. Модифицированное среду Дюльбекко (DMEM) и фетальную бычью сыворотку купили у Gibco в NY, США. Пенициллин и стрептомицин купили у Beyotime биотехнологии в Шанхае, Китай. Фолиевую кислоту, доксорубицин, 3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолий бромид (MTT) и агарозу купили у Sigma-Aldrich в MO, США. Все антитела купили у Abcam Company в Шанхае, Китай. Другие реактивы купили у Sinopharm Chemical Regent Co., Ltd., в Шанхае, Китай.

УФ-Вис спектрофотометр (Thermo Evolution 201) и термостатирующий инкубатор купили у Thermo Fisher в США; центрифуга (GT10-1) у Beijing Era Beili Centrifuge Co., Ltd.; флуоресценционный спектрофотометр (UV-1800) у Shimadzu Corporation. Конфокальная лазерная сканирующая микроскопия (Visitech) у Leica компаний; ПЦР прибор (PCR, T100), белковая и нуклеиновая электрофорез аппаратура у Bio-Rad Company; динамический световой анализатор размера частиц у Beckman Company; клеточные пластинки 96- или 24-колодчатые у Dow Corning Corporation. Высокоэффективная жидкостная хроматография (HPLC, Agilent 1200) с C18 колонкой у Agilent Technologies.

Человеческая клеточная линия колиточного рака HT-29 поддерживали в DMEM с 10% фетальной бычьей сывороткой, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина в увлажненной атмосфере с 95% воздуха и 5% углекислого газа при 37 °C.

Синтез и очистка ДНК-тетраэдра

В этом исследовании синтез следовал схематическим процедурам на рис. 1, а однцептные ДНК (ssDNA) последовательности ДНК-тетраэдра приведены на рис. 1. В деталях, каждая ssDNA растворяли в 0,5× TE буфере, и соответствующее оптическое плотность (OD) значение ДНК определяли УФ спектрофотометром при 260 нм. Дополнительный TE буфер добавляли для выравнивания четырех цепей к одной концентрации. Соотношение смешивания четырех ssDNA было 1:1:1:1 при 1 мкМ в 100 мкл. Реакция проводилась в ПЦР приборе с циклическими условиями: 95 °C, 10 мин, естественное охлаждение до 4 °C. Все однцептные ДНК очищали HPLC с 260 нм как характеристической абсорбционной пиковой. В HPLC спектре пиковое время ДНК-тетра было быстрее, чем у однцептной цепи, и продукт собирали в соответствующей временной точке.

Синтез и характеристика фолиевой кислоты-ДНК-тетра-Dox

Свободные водородные группы Dox и фолиевой кислоты модифицировали азидной группой, затем соединяли с 3'-OH ssDNA через клик-химию реакцию [21]. При добавлении разного количества функциональной группы-маркированной ssDNA, соотношение функциональных групп могло быть стехиометрически контролировано через специфическую гибридизацию боковых цепей. Для синтеза фолиевой кислоты-ДНК-тетра, молярное соотношение фолиевой кислоты и ДНК-тетраэдра устанавливали как 1:1. Для синтеза ДНК-тетра-Dox, молярное соотношение Dox и ДНК-тетраэдра устанавливали как 4:1. Для синтеза фолиевой кислоты-ДНК-тетра-Dox, молярное соотношение фолиевой кислоты, ДНК-тетраэдра и Dox соответственно устанавливали как 1:1:3. Все синтезы проводили на микромолярном уровне при 37 °C и затем хранили при 4 °C [22].

В этом исследовании серия ДНК-тетра комплексов характеризовалась полиакриламидной гелелектрофорезой (PAGE) с 8% сепарирующим гелем (39% Acr-Bis) для проверки чистоты и относительных молекулярных размеров. Образцы состояли из разных ДНК-тетра структур и 6× загрузочного буфера с соотношением смешивания 2:1. Образцы окрашивали и анализировали после гелелектрофореза 90 мин при 110 В. Для выяснения различий в размерах частиц, ДНК-тетра образцы также сканировали динамическим световым рассеянием (DLS) приборами с динамическим светом.

ДНК-тетра-фасилитированное клеточное поглощение

Для различных соединительных структур, спроектированных в этом исследовании, скорости поглощения клетками HT-29 сравнивали для выяснения эффективности доставки лекарства. Эффективность клеточного поглощения оценивали и квантифицировали, используя характерный флуоресценционный спектр Dox, т.е. возбуждающий свет при 470 нм и эмиссионный свет при 590 нм. HT-29 клетки при 2 × 10⁵/мл посевали в 24-колодчатые пластинки и культивировали 24 ч. Клетки инкубировали с различными ДНК-тетра структурами при 10 мкМ еще 24 ч. Среду затем удаляли, и клетки промывали ПБС трижды. Для фиксации клеток 4% параформальдегид немедленно добавляли при комнатной температуре на 30-минутную ко-инкубацию, и клетки снова промывали ПБС трижды. В конце 24-колодчатые пластинки наблюдали лазерной конфокальной микроскопией для сравнения эффективности клеточного поглощения на основе интенсивности эмиссионного света.

Цитотоксичность и антираковая эффективность

Цитотоксичность и антираковая эффективность оценивали MTT-тестом, где оксидо-восстановительная реакция происходит между MTT в DMSO и внутриклеточной сукцинатдегидрогеназой. HT-29 клетки посевали в 96-колодчатые кулитурные пластинки и культивировали 24 ч.

Для цитотоксичности ДНК-тетра как переносчика лекарства, среда, содержащая ДНК-тетра структуры при концентрации 0–100 мкМ, добавляли для еще 24- или 48-часовой инкубации. Затем 100 мкл MTT раствора (5 мг/мл) добавляли в каждую колодку, и смесь инкубировали при 37 °C 4 ч. Жидкость затем удаляли, и клетки лизировали и растворяли 200 мкл DMSO. Абсорбция надстоянки измеряли при 570 нм микроридером. Необработанный HT-29 образец считался контрольной группой.

Для ДНК-тетраэдра, связанного с фолиевой кислотой или Dox, с одной стороны, исследование фокусировалось на стабильности, биобезопасности и ингибиторной эффективности; с другой стороны, имеет ли Dox ДНК-тетра-Dox сравнимые антиопухолевые свойства как раньше, также изучалось. Поэтому цитотоксичность и антиопухолевая эффективность ДНК-тетра комплексов оценивали. Комплексы соответственно при 100 мкМ инкубировали с HT-29 клетками. Клеточные образцы собирали каждые 6 ч и затем детектировали MTT-тестом для оценки эффекта периода инкубации. Особое внимание уделяли различию в антиопухолевой эффективности, результат вариаций структур. Кроме того, концентрационные эффекты на ингибицию HT-29 после обработки фолиевой кислотой-ДНК-тетра-Dox оценивали при 0–200 мкМ через MTT-тесты.

Вестерн-блот и потоковая цитометрия

Для характеристики клеточного апоптоза, индуцированного Dox, фасилитированного ДНК-тетра доставкой, белковые образцы из обработанных клеток нагревали и раскрывали пиролизной жидкостью, анализировали 12% SDS-PAGE под условием 100 В постоянного тока для разделения образцов, затем блоттировали на 0,22-мкм PVDF мембраны на 1 ч. Образцы блокировали обезжиренным молоком 1 ч. После трехкратного промывания PBST, образцы инкубировалиovernight с кроличьим анти-caspase-3. Затем образцы зондировали козьим-анти-кроличьим IgG вторичным антителом 1 ч и затем промывали PBST и обрабатывали через Bio-Rad белковую систему визуализации. Дальше, GAPDH выбирали как внутренний референсный белок из-за его стабильной экспрессии в клетках.

Потоковая цитометрия дополнительно использовалась для квантификации уровней апоптоза при выбранной концентрации и временной точке через MTT-тесты. HT-29 клетки инкубировали с ингибиторами на период времени и затем измеряли количественной потоковой цитометрией с использованием метода двойного окрашивания Annexin V-PI.

Квантификация клеточной пролиферации

Метод подсчета клеток использовали для квантификации клеточной пролиферации во времени. В деталях, после обработки фолиевой кислотой-ДНК-тетра-Dox на период времени при 100 мкМ, клетки давили 0,25% трипсином на 30 с, затем равный объем полной среды добавляли для терминации реакции. Надстоянку удаляли после центрифугирования 1000 об/мин 3 мин, и клетки ресуспендировали полной средой. Количество клеток в каждой точке детекции записывали под оптической микроскопией используя пластинки для подсчета клеток, чтобы нарисовать кривую клеточной пролиферации.

Статистический анализ

В этом исследовании значимость различий определяли с использованием Стьюдента t-теста (двуххвостовой; двухвыборочный равная дисперсия). P < 0,05 означает значимые различия между разными группами.

Результаты

Подготовка фолиевой кислоты-ДНК-тетра-Dox

В конкретном процессе синтеза Dox смешивали с ДНК-тетраэдром в разных пропорциях для завершения загрузки и сборки Dox (w_m = 543,52) и фолиевой кислоты (w_m = 441,4). Как показано на рис. 2a, из-за того, что Dox и фолиевая кислота — мономеры с относительно низкими и похожими молекулярными весами, ДНК в тетраэдре и конъюгаты с одной функциональной молекулой имели примерно эквивалентные молекулярные веса. Однако Dox или фолиевая кислота, собирающиеся со всеми четырьмя вершинами ДНК-тетраэдра, делали молекулярный размер ДНК-тетра очевидно увеличенным. Как показано на рис. 2b, большинство размеров ДНК-тетраэдрических мономеров было менее 15 нм. С увеличением связывающих групп симметричная структура ДНК-тетра разрушалась и среда размеров частиц комплексов значительно увеличивалась. В частности, расширение размера фолиевой кислоты-ДНК-тетра-Dox расширяло среду диаметра до 20 нм.

Эффективность доставки лекарства

После инкубации с разными ДНК-тетра структурами 24 ч, внутриклеточная эффективность Dox оценивали флуоресцентной визуализацией, где внутриклеточная красная флуоресценция — характеристическая флуоресценция Dox; следовательно, клетки, инкубированные с ДНК-тетра, не демонстрировали никакого флуоресцентного сигнала как показано на рис. 3a, а красные сигналы клеток, инкубированных с фолиевой кислотой-ДНК-тетра-Dox и ДНК-тетра-Dox комплексами, были очевидно выше, чем с Dox, означая существенно улучшенную эффективность клеточного поглощения Dox в результате ДНК-тетра-фасилитированного проникновения через мембрану, а также внутриклеточной стабильности конъюгатов между Dox и ДНК-тетра.

Дальнейший количественный анализ интенсивности флуоресценции (Рис. 3b) подтвердил визуальные находки, и не было значимой разницы между фолиевой кислотой-ДНК-тетра-Dox и ДНК-тетра-Dox комплексами (P < 0,05). Методология ко-инкубации лекарств и клеток препятствует полной экспозиции таргетирующей способности фолиевой кислоты. Относительно высокая концентрация подтвердила специфическое распознавание фолатовых рецепторов, которое теоретически более очевидно в in vivo применениях с комплексной циркуляторной системой. Кратко, ДНК-тетра доставка гарантировала антирактическую эффективность Dox.

Цитотоксичность и антираковая эффективность

Сначала живучесть HT-29 клеток ко-инкубированных с разными концентрациями ДНК-тетра изучали MTT-тестом. Не было очевидной цитотоксичности ДНК-тетра обработки в HT-29 клетках при 0–100 мкМ на 24 и 48 ч (Рис. 4a). Следовательно, наноразмерный ДНК-тетраэдр предоставлял биобезопасную платформу переносчика лекарства.

Во-вторых, в результате различия в эффективности доставки Dox, фолиевая кислота-ДНК-тетра-Dox и ДНК-тетра-Dox демонстрировали более значительную ингибиторную эффективность в течение 48 ч (Рис. 4b). Из-за отсутствия эффективных антиопухолевых компонентов, ДНК-тетра-фолиевая кислота приводила к незначительному снижению (< 10%) живучести в течение 48-часовой ко-инкубации. Из-за того, что Dox не может объективно проникнуть через мембрану, Dox-индуцированное снижение клеточной живучести было меньше других групп. Особенно, фолиевая кислота-ДНК-тетра-Dox показала более раннее и значительное снижение через 6 ч после инкубации, доказывая, что фолиевая кислота таргетирование помогает препаратам локализоваться на мембране и заставляет Dox действовать более своевременно. В отличие, ДНК-тетра-Dox начала действовать очевидно через 12 ч после инкубации, демонстрируя важность таргетирующих групп.

Кроме того, HT-29 клетки обрабатывали фолиевой кислотой-ДНК-тетра-Dox при 0–200 мкМ для детекции эффективной концентрации (Рис. 4c). Клеточная живучесть HT-29 падала быстро с увеличением концентрации (0–100 мкМ) комплекса, но не было значимых различий между концентрациями 100 и 200 мкМ, указывая на дозозависимый способ фолиевой кислоты-ДНК-тетра-Dox, где 100 мкМ может считаться эффективной концентрацией для антиопухолевого эффекта. Кроме того, клеточная живучесть значительно менялась с 24 до 48 ч для групп 10, 20 и 50 мкМ, указывая на то, что период инкубации также был фактором, влияющим на фолиевую кислоту-ДНК-тетра-Dox базированную антиопухолевую эффективность.

Апоптоз, индуцированный фолиевой кислотой-ДНК-тетра-Dox

Соответственно, основанный на вестерн-блот анализах (Рис. 5a), было значительное увеличение экспрессии caspase-3, индуцированное фолиевой кислотой-ДНК-тетра-Dox и ДНК-тетра-Dox, доказывая, что апоптоз был основным путем Dox-индуцированной клеточной смерти.

Потоковая цитометрия (Рис. 5b–e) дополнительно доказала, что 6-часовая инкубация с фолиевой кислотой-ДНК-тетра-Dox при 100 мкМ индуцировала 68,7% апоптоз. В то время как уровни апоптоза, индуцированные Dox и ДНК-тетра-Dox, составляли только 32,8 и 60,5% при тех же условиях инкубации.

Ингибиция клеточной пролиферации

Основанный на MTT-тестах, 100 мкМ была эффективной концентрацией для индукции апоптоза и была выбрана в эксперименте клеточной пролиферации. Как показано кривой клеточной пролиферации (Рис. 6), из-за затратного по времени процесса клеточного поглощения, ингибиция на клеточной пролиферации не была полностью показана на ранней стадии ко-инкубации. Значительный ингибиторный эффект представлен после инкубации с фолиевой кислотой-ДНК-тетра-Dox более 6 ч, доказывая существование ДНК-тетра-усиленного эндоцитоза. В то же время, 6 ч — сравнимый период времени с эффективным периодом, детектированным на Рис. 4b.

Обсуждение

Как обычное средство ДНК модификации, клик-химическая реакция имела преимущества высокой реакционной эффективности, хорошего контроля и легкой операции [21]. Электрофереограмма, показанная с одной полосой (Рис. 2a), указывала на то, что продукты с высокой чистотой получены ковалентным связыванием через клик-химическую реакцию. Флуоресцентное свойство Dox делает его отслеживаемым in vitro и in vivo; в то же время флуоресценция внутри опухолевых клеток косвенно доказала стабильность фолиевой кислоты-ДНК-тетра-Dox в процессе проникновения через клеточную мембрану. Следовательно, фолиевая кислота-ДНК-тетра-Dox была способной и стабильной для биомедицинских применений.

ДНК-тетра имеет способность доставлять лекарства в клетки. Все ДНК последовательности, использованные в этом исследовании, не кодировали никакой генетической информации. Таким образом, никаких побочных эффектов на экспрессию генов и клеточный метаболизм не сообщалось во всех исследованиях. В то же время, из-за высокой экспрессии фолатового рецептора на поверхности опухолевых клеток, фолиевая кислота выбрана как специфические таргетирующие молекулы системы доставки лекарств для усиления эффективности поглощения ДНК-тетра комплексов. Однако при обстоятельствах ДНК-тетра при относительно высокой концентрации, преимущество фолатового рецепторного таргетирования не было полностью отражено in vitro. Соответственно, для in vivo применения фолиевая кислота была потенциальна для усиления таргетирующей эффективности в комплексной циркуляторной системе.

В настоящее время антираковые препараты обычно приносят неожиданные побочные эффекты, поэтому исследование усиления таргетирующей способности опухолевых клеток и эффективности доставки было горячей темой [23,24,25]. Предыдущие исследования показывали, что способность ДНК-тетраэдра переносить лекарства базировалась на его хорошей совместимости. ДНК-тетраэдр — искусственный контейнер благоприятной модифицируемости и подходящей биосовместимости. В этом исследовании успешное связывание Dox и фолиевой кислоты с ДНК-тетраэдром достигло удовлетворительного ингибиторного эффекта и привело к очевидному апоптозу клеток HT-29. Благодаря тому, что ДНК-тетра может быть модифицирован и связан с лекарствами и таргетирующими молекулами, реализовалось обогащение локальной концентрации лекарства в опухолевой клетке. Вышеприведенные результаты доказали хорошее распознавание опухолевых клеток и соответствующий усиленный ингибиторный эффект через ДНК-тетра доставку, и эта наноразмерная система доставки лекарств может использоваться более широко.

Заключение

Как новая разработанная стратегия доставки лекарств, наноразмерные ДНК структуры обладают низкой стоимостью, высокой стабильностью и реализуемостью синтеза; в то же время они биобезопасны из-за отсутствия экзогенной иммунной активности. Стратегия связывания ДНК-тетраэдра облегчает таргетированную доставку Dox, усиливает антирактическую эффективность Dox на клетках колиточного рака и предоставляет перспективное вдохновение и идею для дизайна препаратов.