Эффект апоптоза наночастиц золота, модифицированных литохолевой кислотой, на раковые клетки печени

Фон

Золотые наночастицы (AuNP) в качестве наноматериалов широко применяются во многих областях благодаря своим уникальным оптическим свойствам, хорошей химической стабильности и биосовместимости [1,2,3,4,5]. Таким образом, он имеет широкие перспективы применения в наноэлектронике, нанофотонике, катализе, сенсорах, биомаркерах и многих других областях [6,7,8]. Поскольку AuNP имеют большую площадь поверхности и сферическую форму, они могут использоваться в качестве носителя противоопухолевых препаратов [9,10,11,12]. Более того, многие комплексы AuNP в основном используются для нового типа противоопухолевых препаратов для лечения рака [13, 14]. В качестве носителя противоопухолевого лекарственного средства комплекс AuNP может контролировать функцию клетки, регулировать экспрессию генов и обнаруживать аналиты в клетке [15, 16]. Таким образом, улучшение функционализированных AuNP становится одним из важных направлений в исследованиях лечения рака [17,18,19].

Литохолевая кислота (LCA) широко присутствует во вторичной желчной кислоте высших позвоночных в желчи. О разнообразии видов желчных кислот сообщалось при применении различных видов желчных кислот и их производных в медицине и некоторых других областях [20,21,22], например, при лечении дефицита желчных кислот, желчных камней и заболевание печени [23,24,25]. А некоторые желчные кислоты и их производные могут использоваться в качестве носителей лекарственных средств для лечения заболеваний печени, усиливать абсорбцию и понижать уровень холестерина. [26,27,28]. Предыдущие сообщения показали, что LCA оказывает очень сильное противоопухолевое действие на клетки рака печени, а механизм гибели клеток - апоптоз [29, 30]. Апоптоз - это биологический процесс активной гибели клеток, и это важный механизм, с помощью которого организм многоклеточного организма регулирует развитие тела, контролирует старение клеток и поддерживает стабильность внутренней среды [31, 32]. В частности, подавление пролиферации, дифференцировки, снижение степени злокачественности и стимулирование апоптоза опухолевых клеток являются целями лечения опухолей [33,34,35,36,37].

В этом исследовании мы синтезировали AuNPs с биологическими свойствами нацеливания путем объединения NPs золота с производными LCA. Мы изучали их цитотоксичность методом МТТ с клетками HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 и MCF-7 в течение 48 часов. Наши результаты цитотоксичности показали, что AuNP @ MPA-PEG-LCA может подавлять рост нескольких раковых клеток печени более эффективно, чем другие раковые клетки и нормальные клетки. Апоптоз играет роль в ингибировании пролиферации клеток, что было подтверждено окрашиванием Hoechst 33342, окрашиванием аннексином V-FITC, анализом потенциала митохондриальной мембраны (MMP) и экспериментами по окрашиванию AO / EB. Уровень АФК увеличился в раковых клетках печени, что свидетельствует о том, что AuNP @ MPA-PEG-LCA может вызывать апоптоз через митохондриальную дисфункцию, опосредованную генерацией АФК.

Методы

Материалы

Если не указано иное, химические вещества были закуплены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури) и использовались без дополнительной очистки. Среда RPMI-1640 и фетальная бычья сыворотка (FBS) были от Invitrogen Corporation. HepG2 (клетки гепатоцеллюлярной карциномы печени человека), SMMC-7721 (клетки гепатоцеллюлярной карциномы печени человека), QSG-7701 (нормальные клетки гепатоцитов человека) и MCF-7 (клетки рака груди человека) были приобретены в Шанхайском институте биологических наук ( Шанхай, Китай)

Синтез AuNP @ MPA

Цитратные наночастицы золота (AuNP @ MPA) со средним размером 4,0 нм были приготовлены в соответствии с методом, впервые предложенным J. Turkevich et al. [38]. Вкратце, 773 мкл 38,8 мМ раствора цитрата натрия и 2 мл 15 мМ HAuCl ₄ раствор растворяли в 30 мл Milli-Q H ₂ O, и раствор перемешивали при 25 ° C. Затем 3 мл 0,1 М NaBH ₄ (свежеприготовленный) был добавлен. После прохождения реакции в течение 2 ч при 25 ° C раствор изменился с бесцветного на светло-оранжевый. Затем добавляли 3 мл 0,01 М 3-меркаптопропионовой кислоты (MPA) в безводном этаноле при pH 11 и продолжали реакцию в течение 2 ч при 25 ° C. Реакционную смесь центрифугировали, чтобы получить соединение AuNP @ MPA.

Синтез AuNP @ MPA-PEG

10,5 мг (0,0875 ммоль) 1-гидроксипирролидин-2,5-диона (NHS) и 7 мг (0,035 ммоль) 1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимида гидрохлорида (EDC) добавляли к 50 мМ раствору AuNP @ MPA в 4-морфолинэтансульфоновую кислоту (MES) и раствор перемешивали в течение 30 минут при 25 ° C. Затем 0,045 ммоль NH ₂ -PEG1000-NH ₂ добавляли, и смесь перемешивали в течение 24 часов при 25 ° C. По завершении реакции смесь центрифугировали, чтобы получить соединение AuNP @ MPA-PEG.

Синтез AuNP @ MPA-PEG-LCA

Соединение AuNP @ MPA-PEG в сверхчистой воде добавляли к 200 мкл раствора безводного диметилформамида (ДМФ), содержащего 17 мг (0,045 ммоль) LCA, и реакционный раствор перемешивали в течение 24 часов при 25 ° C. По завершении реакции реакционную смесь центрифугировали, чтобы получить соединение AuNP @ MPA-PEG-LCA.

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ)

Морфология и размер AuNP были обнаружены на ПЭМ JEOL JEM-200CX, работающем при напряжении до 200 кВ. Раствор AuNP капали на медную сетку (300 меш).

Анализы противоопухолевых свойств AuNP

Мы использовали четыре типа клеток (HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 и MCF-7) для исследования противоопухолевой способности AuNP модифицированным 3- (4,5-диметил-2-тиазолил) -2,5 -дифенилтетразолийбромид (МТТ) метод. В анализе использовали 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 и 1,0 мг / мл AuNP и исходных наночастиц золота (AuNP @ MPA). OD570 в каждой лунке измеряли на многомодовом планшет-ридере Tecan Infinite M200.

Определение морфологии окрашиванием Hoechst

Через 24 и 48 часов с AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 мг / мл) клетки HepG2 окрашивали 10 мкг / мл Hoechst 33342 в течение 30 минут в инкубаторе для клеток. Морфология ядер клеток определялась конфокальной микроскопией Leica-SP8.

Апоптоз профазы клеток:окрашивание аннексином V-FITC

Через 6 часов с AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 мг / мл) клетки HepG2 окрашивали аннексином V-FITC в течение 10 минут в инкубаторе для клеток, а затем наблюдали с помощью конфокального микроскопа Leica-SP8.

Для обнаружения AuNP в проточном цитометре после 6 часов обработки AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 мг / мл) клетки HepG2 окрашивали аннексином V-FITC в течение 10 минут в инкубаторе для клеток и определяли с помощью проточного цитометра FACSCalibur. (Becton Dickinson &Co., Франклин Лейкс, Нью-Джерси).

Анализ потенциала митохондриальной мембраны (MMP)

Клетки HepG2, обработанные AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 мг / мл) в течение 6 ч при 37 ° C, инкубировали с 10 мкг / мл JC-1 (5,5 ', 6,6'-тетрахлор-1,1 ', 3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин йодид; молекулярные зонды) в течение 10 мин при 37 ° C. Впоследствии клетки были обнаружены с помощью проточного цитометра FACSCalibur.

Для наблюдения с помощью флуоресцентной микроскопии клетки HepG2 обрабатывали AuNP @ MPA-PEG-LCA в течение 10 минут с 10 мкг / мл JC-1 и наблюдали с помощью конфокальной микроскопии Leica-SP8.

Измерение активных форм кислорода (АФК)

Накопление внутриклеточных АФК оценивали с использованием диацетата 2 ', 7'-дихлорфлуоресцеина (H ₂ DCF-DA). Обработку клеток HepG2 образцами AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 мг / мл) в течение 6 ч инкубировали с 10 мкМ H ₂ DCF-DA в течение 30 мин при 37 ° C. Интенсивность флуоресценции клеток наблюдали с помощью проточного цитометра FACSCalibur и конфокального микроскопа.

Результаты и обсуждение

Подготовка и характеристика AuNP

Сначала был приготовлен водорастворимый AuNP @ MPA (схема 1). На рисунке 1а показаны результаты ПЭМ AuNP @ MPA. Указывается, что форма и размер AuNP @ MPA очень похож на сферическую форму с компактным размером 4,0 ± 0,5 нм. Затем получали AuNP @ MPA-PEG-LCA (Схема 1). И морфология частиц также была проанализирована с помощью ПЭМ (рис. 1c). Изображения ПЭМ показали, что морфология AuNP @ MPA-PEG-LCA аналогична морфологии AuNP @ MPA. А диаметры AuNP @ MPA-PEG-LCA составили ~ 16 нм согласно статистическому анализу.

Схематическое изображение синтеза AuNP @ MPA-PEG-LCA

TEM-изображения a AuNP @ MPA, b AuNP @ MPA-PEG и c AuNP @ MPA-PEG-LCA

Результаты цитотоксичности

Для исследования цитотоксичности AuNP были отобраны клетки HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 и MCF-7, которые обрабатывали AuNP и AuNP @ MPA в течение 48 часов. И анализ МТТ был использован для определения клеточной токсичности образцов. Жизнеспособность AuNP и AuNP @ MPA на разных клетках показана на рис. 2. Результаты показали, что цитотоксичность AuNP @ MPA очень низкая во всех клетках. Однако AuNP @ MPA-PEG-LCA может более эффективно ингибировать рост множественных раковых клеток печени с увеличением концентрации наночастиц, но меньше повреждает нормальные клетки и другие раковые клетки. А именно, антипролиферативная активность AuNP @ MPA-PEG-LCA по отношению к клеткам HepG2 и SMMC-7721 была очень высокой по сравнению с клетками QSG-7701 и MCF-7.

Жизнеспособность клеток AuNP @ MPA и AuNP @ MPA-PEG-LCA (AuNP), инкубированных с клетками HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 и MCF-7 в течение 48 ч

Индукция апоптоза

Апоптозные ядра - частый показатель апоптоза. После обработки AuNP @ MPA-PEG-LCA в течение указанного времени клетки инкубировали с Hoechst 33342. Затем морфологические характеристики ядра клетки просматривали с помощью конфокальной микроскопии. Как показано на фиг. 3, контрольные клетки и клетки, инкубированные с AuNP @ MPA, демонстрируют интактное и гомогенное окрашивание ядра клетки; однако количество апоптотических клеток в клетках HepG2, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA, постепенно увеличивается с увеличением времени инкубации, а ядро ​​клетки демонстрирует типичные характеристики апоптоза, такие как фрагментированные ядра, конденсированный хроматин и уменьшение клеточного объема. / P>

Морфологические характеристики ядра клеток HepG2, окрашенных Hoechst 33342. Клетки HepG2 инкубировали с AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 мг / мл) в течение a 0 ч, б 24 часа и c 48 ч. И д AuNP @ MPA (0,5 мг / мл) инкубировали в течение 48 ч. Апоптозные клетки отображали конденсированные и фрагментированные ядра и уменьшение клеточного объема; масштабная линейка 20 мкм

Как мы все знаем, окрашивание аннексином V позволяет отличить ранние стадии апоптоза от некротических клеток. На ранней стадии апоптоза аннексин V может связываться с мембранным фосфолипидом фосфатидилсерином (PS), который выводится с внутренней на внешнюю поверхность плазматической мембраны [39]. Поэтому мы исследовали потенциал индукции апоптоза AuNP @ MPA-PEG-LCA с помощью тестов окрашивания аннексином V-FITC. Как показано на фиг. 4a, в контроле нет явной зеленой флуоресценции в клеточной мембране, но есть очевидная зеленая флуоресценция в клеточной мембране клеток HepG2, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA. Это явление является сильным признаком апоптоза на ранней стадии. Как мы все знаем, изображения конфокальной микроскопии только подтвердили наличие апоптоза; однако проточная цитометрия может быстро и точно измерить возникновение апоптоза и точно определить скорость апоптоза. Поэтому мы дополнительно исследовали стадии апоптоза с помощью проточной цитометрии. На рис. 4b показаны результаты измерения скорости апоптоза с помощью проточной цитометрии. Процент апоптоза составлял около 38,45% клеток HepG2, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA, но только процент апоптоза составлял около 8,16% в контрольных клетках. Значительный процент апоптоза предполагает, что клетка, инкубированная с AuNP @ MPA-PEG-LCA, поддерживала апоптоз.

Результаты апоптоза а конфокальные изображения и b данные проточной цитометрии клеток HepG2, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA (0,5 мг / мл). Клетки окрашивали аннексином V-FITC (возбуждение при 488 нм и испускание при 500–560 нм); масштабная линейка 20 мкм

Снижение MMP

Митохондрии играют важную роль в апоптозе, потому что они могут высвобождать проапоптотические факторы, такие как цитохром С и фактор, индуцирующий апоптоз [40,41,42]. Итак, мы исследовали изменение ММП с помощью конфокальной микроскопии и проточной цитометрии. На рис. 5а показаны флуоресцентные изображения меченных JC-1 клеток HepG2, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA, с помощью конфокальной микроскопии. Мы можем наблюдать очевидную красную флуоресценцию JC-1 и здоровые митохондрии в контрольных клетках HepG2, что указывает на наличие агрегации JC-1. Однако в клетках HepG2, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA, наблюдается больше зеленой флуоресценции, что указывает на то, что произошел коллапс мембраны. Нарушение митохондрий в апоптотических клетках указывает на то, что JC-1 не накапливается внутри митохондрий, а распределяется по клетке. А что касается мономерной формы, то рассеянный JC-1, который существует, флуоресцирует зеленым. Для дальнейшей количественной оценки изменения MMP мы оценили клетки HepG2, окрашенные JC-1, методом проточной цитометрии. Типичные сигналы отношения красного / зеленого цвета JC-1, зарегистрированные в клетках HepG2, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA, и контрольных клетках с помощью проточной цитометрии показаны на фиг. 5b. Мы можем наблюдать, что соотношение красный / зеленый показало значительное снижение в клетках, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA, из количественного анализа клеток, окрашенных JC-1, в то время как это имело значительное увеличение в контрольных клетках, что предполагает, что AuNP @ MPA-PEG-LCA может вызывать апоптоз в клетках HepG2.

а Флуоресцентные изображения клеток, меченных JC-1, полученные с помощью конфокальной микроскопии и b влияние AuNP @ MPA-PEG-LCA на ММП проанализировано с помощью проточной цитометрии

Влияние AuNP @ MPA-PEG-LCA на ROS

Как мы все знаем, апоптоз может быть вызван повышенными внутриклеточными уровнями АФК, которые также являются убедительным доказательством участия в индукции апоптоза [43]. Чтобы дополнительно выяснить, связана ли дисфункция митохондрий с генерацией АФК, мы определили уровень АФК в клетках HepG2, окрашенных H ₂ DCF-DA с помощью конфокальной микроскопии и проточной цитометрии. Как показано на рис. 6а, интенсивность зеленой флуоресценции H ₂ DCF-DA показывает значительное увеличение клеток HepG2, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA, по сравнению с контрольными клетками. То есть содержание ROS в клетках HepG2, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA, было значительно увеличено. Затем количественный анализ содержания АФК в клетках исследовали методом проточной цитометрии. Как показано на фиг. 6b, более высокая интенсивность флуоресценции была обнаружена в клетках, инкубированных с AuNP @ MPA-PEG-LCA, по сравнению с контрольными клетками, что указывает на то, что содержание ROS выше в клетках, обработанных AuNP @ MPA-PEG-LCA. . Данные предполагают, что дисфункция митохондрий, возможно, связана с генерацией АФК. Эти результаты предварительно указывают на то, что образование ROS играет важную роль в индукции апоптоза AuNP @ MPA-PEG-LCA.

Анализ продукции ROS после обработки клеток HepG2 AuNP @ MPA-PEG-LCA в течение 6 часов. Содержание ROS в клетках HepG2 было исследовано a конфокальная микроскопия (возбуждение на 488 нм и эмиссия на 530 нм) и b проточная цитометрия (возбуждение при 488 нм и испускание при 525 нм)

Выводы

Таким образом, мы синтезировали AuNP @ MPA-PEG-LCA со средним диаметром 16,0 нм, который может подавлять рост нескольких клеток рака печени. AuNP @ MPA-PEG-LCA эффективно ингибировал пролиферацию клеток из-за апоптоза, что было доказано ядерным окрашиванием, окрашиванием JC-1, анализом MMP и экспериментами с окрашиванием аннексином V-FITC. В исследовании проточной цитометрии остановка AuNP @ MPA-PEG-LCA в раковых клетках печени дополнительно доказывает их поведение в отношении апоптоза. Следовательно, AuNP могут эффективно индуцировать апоптоз через митохондриальную дисфункцию, опосредованную ROS, и они более эффективны в обеспечении запрограммированной гибели клеток рака печени в предварительном механистическом исследовании.

Сокращения

AuNP:

Наночастицы золота

DMF:

Диметилформамид

EDC:

1- (3-диметиламинопропил) -3-этилкарбодиимид гидрохлорид

FBS:

Фетальная бычья сыворотка

H ₂ DCF-DA:

2 ', 7'-Дихлорфлуоресцеиндиацетат

HepG2:

Клетки гепатоцеллюлярной карциномы печени человека

JC-1:

5,5 ', 6,6'-Тетрахлор-1,1', 3,3'-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианин иодид

LCA:

Литохолевая кислота

MCF-7:

Клетки рака груди человека

MES:

4-морфолинэтансульфоновая кислота

MMP:

Потенциал митохондриальной мембраны

MPA:

3-меркаптопропионовая кислота

MTT:

3- (4,5-Диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенилтетразолий бромид

NHS:

1-гидроксипирролидин-2,5-дион

PEG:

Полиэтиленгликоль

PS:

Фосфатидилсерин

QSG-7701:

Клетки нормальных гепатоцитов человека

ROS:

Активные формы кислорода

SMMC-7721:

Клетки гепатоцеллюлярной карциномы печени человека

ТЕМ:

Просвечивающая электронная микроскопия