Функционализированные литохолиновой кислотой золотые наночастицы индуцируют селективную апоптоз в клетках рака печени

Аннотация

Золотые наночастицы (AuNP) славятся своей биосовместимостью, оптическими свойствами и потенциалом для доставки лекарств. В этом исследовании мы спроектировали AuNP со спикером из полиэтиленгликоля (PEG) и лигандом литохолиновой кислоты (LCA) посредством карбоксилатного сопряжения, получив AuNP@MPA-PEG-LCA. Тесты на цитотоксичность показали, что AuNP@MPA-PEG-LCA проявляют выраженную селективность: они значительно подавляют рост нескольких линий гепатоцеллюлярной карциномы (HepG2, SMMC-7721), не нанося вреда нормальным гепатоцитам (QSG-7701) и клеткам рака груди (MCF-7). Индукция апоптоза подтверждена конденсацией ядер (Hoechst 33342), связыванием аннексина V-FITC, потерей митохондриального мембранного потенциала (JC-1) и окрашиванием акридиновым оранжевым/бромидом этидия (AO/EB). Наночастицы вызывают накопление реактивных форм кислорода (РФК), что ведет к митохондриальной дисфункции и программируемой гибели клеток. Эти результаты демонстрируют, что AuNP@MPA-PEG-LCA — перспективная целевая нанотерапия для лечения рака печени.

Введение

Золотые наночастицы обладают уникальным оптическим резонансом, химической стабильностью и большой площадью поверхности, что делает их привлекательными для биомедицинских применений, включая доставку лекарств, визуализацию и фотогермическую терапию. Их сферическая геометрия обеспечивает эффективное клеточное поглощение и минимизирует офф-таргетные эффекты. Функционализация AuNP таргетирующими лигандами или полимерами дополнительно повышает их терапевтический индекс, особенно в онкологии.

Литохолиновая кислота (LCA), вторичная желчная кислота, проявляет мощную антиопухолевую активность против рака печени через индукцию апоптоза. Как природное соединение, LCA может служить лигандом для адресации AuNP в печеночные ткани, улучшения растворимости и модуляции внутриклеточных сигнальных путей.

Сочетание биосовместимости AuNP с противоопухолевыми свойствами LCA может дать селективный антиракозный агент, использующий РОС-опосредованные митохондриальные пути для запуска апоптоза в гепатоцеллюлярной карциноме.

Материалы и методы

Реактивы

Все реактивы приобретены в Sigma-Aldrich, если не указано иное. Реактивы для клеточной культуры (RPMI-1640, ФСС) получены от Invitrogen. Линии гепатоцеллюлярной карциномы человека (HepG2, SMMC-7721), нормальные гепатоциты (QSG-7701) и клетки рака груди (MCF-7) получены из Шанхайского института биологических наук.

Синтез AuNP@MPA

Цитрат-стабилизированные AuNP (средний диаметр 4,0 ± 0,5 нм) получены методом Туркевича с использованием HAuCl₄ и NaBH₄. Полученные наночастицы далее модифицировали 3-меркаптопропионовой кислотой (MPA) при pH 11 для введения карбоксилатных групп с целью последующего сопряжения.

Сопряжение с PEG

AuNP@MPA (0,0875 ммоль) активировали NHS (0,0875 ммоль) и EDC (0,035 ммоль) в 50 мМ буфере MES, затем добавили NH₂-PEG₁₀₀₀-NH₂ (0,045 ммоль). После 24-часовой инкубации при 25 °C PEGилированные наночастицы (AuNP@MPA-PEG) выделили центрифугированием.

Нанесение литохолиновой кислоты

AuNP@MPA-PEG смешали с LCA (0,045 ммоль) в безводном DMF и взбалтывали 24 часа при 25 °C. Конечный продукт AuNP@MPA-PEG-LCA очистили повторной центрифугацией.

Проницающая электронная микроскопия (ПЭМ)

Морфологию и размер частиц изучали на ПЭМ JEOL JEM-200CX при 200 кВ. Взвеси наночастиц наносили на медные сетки 300 ячеек.

Цитотоксичность (MTT)

Жизнеспособность клеток после 48-часового воздействия AuNP (0,2–1,0 мг/мл) измеряли MTT-тестом. Абсорбция на 570 нм регистрировали на плашкетном ридере Tecan Infinite M200.

Морфология апоптоза (Hoechst 33342)

Клетки HepG2 инкубировали с 0,5 мг/мл AuNP@MPA-PEG-LCA в течение 24 и 48 часов, затем окрасили 10 мкг/мл Hoechst 33342 на 30 минут. Ядерную морфологию визуализировали на конфокальном микроскопе Leica-SP8.

Ранняя апоптоза (Annexin V-FITC)

После 6-часового лечения 0,5 мг/мл AuNP@MPA-PEG-LCA клетки HepG2 окрасили аннексином V-FITC и анализировали на цитофлюорметре FACSCalibur (BD). Также получали конфокальные снимки.

Митохондриальный мембранный потенциал (MMP)

Для оценки изменений MMP использовали краситель JC-1 (10 мкг/мл) в клетках HepG2, обработанных AuNP@MPA-PEG-LCA (6 часов). Применяли как цитофлюорометрию, так и конфокальную микроскопию.

Реактивные формы кислорода (РФК)

Внутриклеточные РФК количественно определили с помощью H₂DCF-DA (10 мкМ) после 6-часового воздействия 0,5 мг/мл AuNP@MPA-PEG-LCA. Флуоресценцию измеряли цитофлюорометрией и конфокальной микроскопией.

Результаты и обсуждение

Характеризация наночастиц

AuNP@MPA-PEG-LCA сохранили сферическую форму со средним диаметром 16,0 ± 1,2 нм, что подтверждено ПЭМ. Слои PEG и LCA увеличили гидродинамический размер по сравнению с ядром AuNP@MPA (4,0 нм). Эти размеры идеальны для эффекта усиленного проникновения и удержания (EPR) в опухолевых тканях.

Схема синтеза AuNP@MPA-PEG-LCA

ПЭМ-изображения: a — AuNP@MPA, b — AuNP@MPA-PEG, c — AuNP@MPA-PEG-LCA

Селективная цитотоксичность

MTT-тесты показали пренебрежимую цитотоксичность AuNP@MPA по всем линиям. В то же время AuNP@MPA-PEG-LCA дозазависимо снижали жизнеспособность HepG2 и SMMC-7721 (IC₅₀ < 0,6 мг/мл), тогда как QSG-7701 и MCF-7 практически не пострадали. Этот профиль подчеркивает таргетирующую способность, придаваемую LCA.

Жизнеспособность клеток HepG2, SMMC-7721, QSG-7701 и MCF-7 после 48-часовой инкубации с AuNP@MPA и AuNP@MPA-PEG-LCA

Апоптотическая морфология

Окрашивание Hoechst выявило прогрессирующую конденсацию, фрагментацию и маргинацию хроматина в ядрах HepG2 при обработке AuNP@MPA-PEG-LCA в течение 48 часов — признаки поздней апоптоза. Контрольные клетки и клетки, обработанные AuNP@MPA, сохраняли равномерную ядерную морфологию.

Морфология ядер HepG2, окрашенных Hoechst 33342: a — 0 ч, b — 24 ч, c — 48 ч с AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 мг/мл); d — 48 ч с AuNP@MPA (0,5 мг/мл). Апоптотические клетки демонстрируют конденсированные и фрагментированные ядра, уменьшение объема клетки; масштаб 20 мкм

Подтверждение аннексином V-FITC

Окрашивание аннексином V (рис. 4) показало явную транслокацию фосфатидилсерина во внешний слой плазматической мембраны в клетках, обработанных AuNP@MPA-PEG-LCA. Цитофлюорометрия зафиксировала 38,45 % апоптотических клеток против 8,16 % в контроле, подтверждая индукцию ранней апоптоза.

Результаты апоптоза: a — конфокальные снимки, b — данные цитофлюорометрии HepG2 после обработки AuNP@MPA-PEG-LCA (0,5 мг/мл). Клетки окрашены аннексином V-FITC (экск. 488 нм, эмисс. 500–560 нм); масштаб 20 мкм

Деполяризация митохондрий

Анализ JC-1 (рис. 5) выявил потерю красной флуоресценции агрегатов и рост зеленого сигнала мономеров, указывающий на коллапс MMP в обработанных клетках. Цитофлюорометрия подтвердила значительное снижение красного/зеленого соотношения, подтверждая митохондриальную дисфункцию как нисходящее событие апоптоза.

a — флуоресцентные снимки JC-1 на конфокальном микроскопе; b — влияние AuNP@MPA-PEG-LCA на MMP по данным цитофлюорометрии

Генерация РОС

Окрашивание H₂DCF-DA (рис. 6) показало яркое увеличение зеленой флуоресценции в клетках HepG2, обработанных AuNP@MPA-PEG-LCA, отражающее повышенное образование РОС. Цитофлюорометрическая квантификация подтвердила эту тенденцию, указывая на то, что окислительный стресс предшествует митохондриальной деполяризации и апоптозу.

Анализ продукции РОС в клетках HepG2 после 6-часового воздействия AuNP@MPA-PEG-LCA: a — конфокальная микроскопия (экск. 488 нм, эмисс. 530 нм), b — цитофлюорометрия (экск. 488 нм, эмисс. 525 нм)

Заключение

Мы успешно создали наночастицы AuNP@MPA-PEG-LCA (~16 нм), селективно подавляющие рост гепатоцеллюлярной карциномы через индукцию апоптоза. Комплекс тестов — ядерная морфология, связывание аннексина V, потеря MMP по JC-1 и повышение РОС — подтверждает, что терапевтическое действие опосредовано РОС-индуцированной митохондриальной дисфункцией. Эти результаты позиционируют AuNP@MPA-PEG-LCA как перспективную целевую наномеду для лечения рака печени.

Аббревиатуры

AuNP

Золотые наночастицы

DMF

Диметилформамид

EDC

1-(3-Диметиламино-пропил)-3-этилкарбодимид гидрохлорид

ФСС

Фетальная говяжья сыворотка

H₂DCF-DA

2′,7′-Дихлорфлуореcein диацетат

HepG2

Клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека

JC-1

5,5′,6,6′-Тетрахлор-1,1′,3,3′-тетраэтилбензимидазолилкарбоцианиновый йодид

LCA

Литохолиновая кислота

MCF-7

Клетки рака груди человека

MES

4-Морфолинэтансульфоновая кислота

MMP

Митохондриальный мембранный потенциал

MPA

3-Меркаптопропионовая кислота

MTT

3-(4,5-Диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенилтетразолиевый бромид

NHS

N-Гидроксисукцинимid

PEG

Полиэтиленгликоль

PS

Фосфатидилсерин

QSG-7701

Клетки нормальных гепатоцитов человека

РОС

Реактивные формы кислорода

SMMC-7721

Клетки гепатоцеллюлярной карциномы человека

ПЭМ

Проницающая электронная микроскопия