Яйцескорлуповидные фосфат кальция микросферы с высокой удельной поверхностью из органических источников фосфора и кальция для усиленного адсорбции ГЭЛ

Аннотация

Яйцескорлуповидные (yolk-shell) структурированные микросферы фосфат кальция имеют большой потенциал для медицинских применений благодаря отличным физико-химическим свойствам и биосовместимости. Однако разработка яйцескорлуповидного фосфат кальция с высокой адсорбционной способностью остается проблемой. Здесь успешно синтезированы пористые яйцескорлуповидные микросферы фосфат кальция (ATP-CG) с высокой удельной поверхностью [S_BET = 143 м²/г, ~в 3 раза выше, чем у ATP-CL микросфер, синтезированных с заменой кальциевого источника на л-лактат кальция пентагидрат (CL)] с использованием аденозин-5'-трифосфата динатриевой соли (ATP) как фосфорного источника и глюконата кальция моногидрата (CG) как кальциевого источника через самошаблонный подход. Исследовано влияние мольного соотношения Ca/P, гидротермальной температуры и времени на морфологию ATP-CG микросфер. Установлено, что органические источники кальция и фосфора играют жизненно важную роль в формировании яйцескорлуповидной структуры. Проведена серия адсорбционных экспериментов для выяснения механизма адсорбции двух типов яйцескорлуповидных микросфер, синтезированных с разными кальциевыми источниками. Результаты показывают, что адсорбционная способность ATP-CG микросфер (332 ± 36 мг/г) примерно в 2 раза выше, чем ATP-CL (176 ± 33 мг/г). Более высокая удельная поверхность, обусловленная кальциевым источником, и уникальные поверхностные химические свойства ATP-CG микросфер играют важную роль в улучшении адсорбционной способности к генайи белку (HEL). Исследование указывает, что полученные яйцескорлуповидные микросферы перспективны для систем доставки лекарств и предоставляют эффективный подход к повышению адсорбционной способности носителей.

Введение

Фосфат кальция привлекает внимание последние годы благодаря отличной биосовместимости [1], высокой загрузочной способности и эффективности доставки. Биоматериалы на основе фосфат кальция широко используются в биомедицине: тканевой инженерии [2], регенерации кости [3], доставке лекарств [4]. Для расширения области применения и улучшения свойств сообщались различные морфологии и микроструктуры: карбонатированные гидрок시아патит (HAp) микросферы [5], HAp микротрубки [6], полые HAp микросферы [7], мезопористые яйцескорлуповидные наносферы аморфного фосфат кальция (ACP) [8].

Среди морфологий яйцескорлуповидные микросферы привлекают все больше внимания как передовая материаловедческая тема и благодаря уникальным морфологическим особенностям. В яйцескорлуповидных микросферах пустое пространство между ядром и оболочкой служит резервуаром для различных грузов, а пористая оболочка обеспечивает диффузионные пути для гостевых молекул, что делает их перспективными для катализа [9], литий-ионных батарей [10], фотокатализа [11] и биомедицины [12]. Традиционно жертвенные шаблонные методы — основные для приготовления яйцескорлуповидных микросфер [13, 14]. Эти стратегии успешно регулируют структуру и свойства, но имеют недостатки: трудоемкие этапы, ПАВ или структуронаправляющие реагенты, потенциально опасные для здоровья. В настоящее время самошаблонные методы широко используются для яйцескорлуповидных микросфер [15, 16]. В отличие от традиционных, шаблоны в самошаблонных методах не только формируют пустоты, но и являются предкурсорами яйцескорлуповидных микросфер. Таким образом, самошаблонные методы — удобные подходы. Однако внедрение самошаблонных подходов в синтез яйцескорлуповидных фосфат кальция микросфер остается интересной задачей.

Кроме того, фосфат кальция использовали для переноса различных грузов: белков [17], ДНК [18], siRNA [19]. Однако низкая адсорбционная способность к лекарственным молекулам требует срочного решения. Обычно подходы иммобилизации лекарств на поверхности носителя зависят от поверхностных свойств: поверхностного потенциала [20], гидрофобности/гидрофильности [21], водородных связей [22], удельной поверхности [23]. Улучшение поверхностных свойств и удельной поверхности — валидный подход к повышению адсорбционной способности носителя.

Здесь приготовлены пористые яйцескорлуповидные микросферы фосфат кальция с использованием аденозин-5'-трифосфата динатриевой соли (ATP) как фосфорного источника и глюконата кальция моногидрата (CG) как кальциевого источника через самошаблонный подход. Без добавления шаблонизирующих агентов асинтезированные микросферы демонстрируют особо высокую удельную поверхность. Кроме того, адсорбционное поведение генайи белка (HEL) ATP-CG микросфер изучали в сравнении с ATP-CL микросферами, приготовленными заменой кальциевого источника на л-лактат кальция пентагидрат (CL). Результаты раскрывают, что разница в удельной поверхности, обусловленная кальциевым источником, и поверхностные химические свойства играют ключевую роль в улучшении адсорбционной способности к HEL.

Методы

Материалы

Аденозин-5'-трифосфат динатриевая соль (ATP) — Macklin Biochemical Co., Ltd (Шанхай, Китай). Глюконат кальция моногидрат (CG) и кальция (l)-лактат пентагидрат (CL) — Sangon Biotech Co., Ltd (Шанхай, Китай). Генайи белок (HEL, ~70000 Ед/мг) — Sigma-Aldrich (Тауфкирхен, Германия).

Синтез и характеристика ATP-CG и ATP-CL яйцескорлуповидных микросфер

ATP-CG яйцескорлуповидные фосфат кальция микросферы готовили так: 0,9 г CG растворили в 20 мл ультрачистой воды при 60 °C (раствор C). 0,11 г ATP растворили в 5 мл ультрачистой воды (раствор P). Раствор C остудили до комнатной температуры, смешали с раствором P при интенсивном перемешивании, pH скорректировали 2 М NaOH до 5. Конечный объем 30 мл добавлением ультрачистой воды, мольное соотношение Ca/P = 3,3. Раствор перенесли в микроволновую систему гидротермального реакции, обработали при 120 °C 15 мин. Осадок отцентрифугировали (4500 об/мин, 10 мин), промыли ультрачистой водой, лиофилизировали 48 ч. ATP-CL микросферы готовили по литературе [24].

Кристаллическая фаза — рентгеновская дифракция (XRD, Cu Kα, λ=0,154 нм). Морфология — РЭМ, ТЭМ, ВРТЭМ (HRTEM). Состав — Фурье-преобразование ИК-спектрофотометрия (FTIR). Удельная поверхность — метод Брunaуэра-Эмметта-Теллера (BET). Термогравиметрический анализ (TGA) — скорость нагрева 10 °C/мин в азоте.

HEL адсорбция и характеристика

Адсорбционные эксперименты HEL двух типов микросфер: определенные количества яйцескорлуповидных микросфер (ATP-CG, Ca/P=3,3, 120 °C, 15 мин; ATP-CL, Ca/P=2,5, 120 °C, 30 мин) диспергировали в воде с постоянным ультразвуком 10 мин для 1,5 мг/мл суспензии. Затем 0,5 мл водных растворов с разными концентрациями HEL добавили к 1 мл суспензии, конечные концентрации лекарства 1–7,5 мг/мл. Каждый раствор взбалтывали (200 об/мин) при 37 °C 6 ч. Затем центрифугировали, количество HEL в супернатанте измеряли УФ-виз спектрофотометром при 280 нм. дзета-потенциалы и состав микросфер до и после загрузки лекарства характеризовали дзета-анализатором, FTIR спектрометром и термогравиметрическим анализатором (TGA, 10 °C/мин, азот).

Адсорбционная изотерма

Для изучения адсорбционного поведения использовали модель Дюбинина-Радушкевича (D-R), основанную на теории заполнения микропор, описывающую неидеальную сорбцию на гетерогенной поверхности и отличающую механизм сорбции (физическая или химическая). Уравнение модели: Q_eq = Q_m exp(-K_DR ε²), где Q_eq — равновесная адсорбционная способность (мг/г), C_eq — равновесная концентрация адсорбата в водной фазе (мл/л), Q_m — максимальная адсорбционная способность, R — газовая постоянная 8,314 Дж/(моль·К), T — абсолютная температура, E — средняя свободная энергия для оценки типа адсорбции. Если E < 8 кДж/моль — физическая адсорбция, 8–16 кДж/моль — ионный обмен, >16 кДж/моль — химическая адсорбция.

Статистический анализ адсорбции лекарства

Данные — среднее ± SD. Значимые различия (p < 0,05) рассчитывали односторонним ANOVA. Все эксперименты в триplicates, анализ ПО DPS.

Результаты и обсуждение

Морфология и химическая характеристика микросфер

ATP-CG яйцескорлуповидные микросферы

РЭМ на рис. 1 показывает морфологии пробок под разными условиями. При t = 5 мин или 15 мин все продукты — равномерные микросферы. При увеличении гидротермального времени до 30 мин формируются нанолисточки, самособравшиеся в микросферы (рис. 1 f, i, l). Эффект Ca/P на морфологию также наблюдается при t = 30 мин: с ростом Ca/P нанолисточки самособираются в микросферы (рис. 1 f, i, l). Формирование нанолисточек объясняется: под микроволновым гидротермальным процессом ATP гидролизуется до аденозин-дифосфата (ADP), аденозин-монофосфата (AMP) и аденозина, выделяя фосфат-ионы (PO₄³⁻). CG гидролизуется до глюконата и ионов кальция (Ca²⁺). Фосфат-ионы реагируют с ионами кальция, образуя первичные ядра ACP [25]. Начальные ядра ACP растут и собираются в ACP микросферы. При удлинении гидротермального времени ATP и CG дальше гидролизуются, высвобождая больше PO₄³⁻ и Ca²⁺, повышая перенасыщенность и скорость нуклеации, что приводит к нанолисточкообразным микросферам. Повышение Ca/P также повышает локальную концентрацию Ca²⁺, ускоряя трансформацию морфологии тем же путем. Гидротермальное время и Ca/P важно влияют на морфологию продуктов.

FTIR спектры микросфер при разных Ca/P при 120 °C 15 мин на рис. 2. Пики 1620 см⁻¹, 1383 см⁻¹, 912 см⁻¹ — характерные для C=O, C–O CG и P–O групп ATP [26], указывают на адсорбированные на поверхности микросфер негидролизованные CG и ATP или их производные. Слабый пик PO₄³⁻ из HAp при 1035 см⁻¹ [27], пики 1122 см⁻¹ и 567 см⁻¹ — PO₄³⁻ ионов ACP [28]. Продукты состоят из ACP и HAp. FTIR подтверждает успешный синтез фосфат кальция с ATP как фосфорным источником и CG как кальциевым.

РЭМ и ТЭМ пробок при разных Ca/P при 120 °C 15 мин на рис. 3. При Ca/P 0,8 или 1,67 — пористые микросферы (рис. 3b, d). При Ca/P 2,5 морфология начинает трансформироваться в яйцескорлуповидные (рис. 3f). При Ca/P 3,3 продукты полностью состоят из яйцескорлуповидных микросфер (рис. 3h). Дальше наблюдаются разбитые сферы и экспонированные ядра (вставка на рис. 3g) после механического разрушения — доказательство полой структуры между ядром и оболочкой. Предлагаемый механизм формирования яйцескорлуповидных микросфер при разных Ca/P: при низком Ca/P образуются пористые ACP микросферы из-за ингибирующего эффекта адсорбированных ATP и CG или производных на поверхности. При дальнейшем повышении Ca/P метастабильный ACP дальше растет под действием высокой перенасыщенности. Наконец, кристаллические HAp формируются на внешней поверхности, подтверждается ВРТЭМ (рис. 3i) — межплоскостное расстояние 0,308 нм индексируется как (210) HAp. В результате полые структуры между ядром и оболочкой генерируются из-за разницы объема/плотности между HAp и ACP [24]. EDS маппинг показывает равномерное распределение Ca, P, O. EDS спектры (рис. 3k) и XPS (рис. 3l) подтверждают основные элементы Ca, P, O — согласуется с FTIR (рис. 2).

Влияние микроволнового гидротермального времени и температуры на морфологию при Ca/P=3.3 изучено дальше. Рис. 4a-b: при t=5 мин — пористые микросферы. При t=15 мин — яйцескорлуповидные (рис. 4c-d). При t=60 мин или T=160 °C — листочки или пучки стержней (рис. 4e-l). Трансформация пористые → яйцескорлуповидные → листочки/стержни обусловлена дальнейшим ростом ACP при непрерывной гидролизе ATP и CG в растворе. Гидролиз адсорбированных на поверхности ACP микросфер ATP и CG или производных также ускоряет рост ACP. Интересное явление при 60 мин или 160 °C: эти листочки/стержни также развиваются из ACP наночастиц (красные прямоугольники), подтверждается DTA анализом (рис. S1). Экзотермический пик при 650 °C на DTA кривых [29, 30] — кристаллизация ACP. Пик ослабевает с ростом времени/температуры, указывая на трансформацию ACP в кристаллический фосфат кальция.

Химическая конституция и структура пробок при Ca/P=3.3 под разными временем/температурой изучены FTIR и XRD. Рис. 5a: характерные пики PO₄³⁻ ионов HAp при 1037 см⁻¹ и 603 см⁻¹ [27]. Пик 1122 см⁻¹ — PO₄³⁻ ACP. Пики 1620 см⁻¹ и 1383 см⁻¹ — C=O и C–O групп CG. Пик 912 см⁻¹ — асимметричное растяжение P–O ATP. С ростом гидротермального времени/температуры интенсивность пиков CG и ATP постепенно снижается — адсорбированные молекулы дальше гидролизуются. Одновременно интенсивность пика PO₄³⁻ HAp растет при снижении ACP пика — трансформация кристаллической фазы к HAp.

Рис. 5b — XRD паттерны. Характерistic гул аморфной фазы около 2θ=30° у микросфер при 5 или 15 мин. При t=60 мин или T=160 °C кристаллическая фаза полностью трансформируется в HAp, индексируется как стандарт (JDCPS 09-0432). Рост относительной интенсивности решеточных плоскостей (211), (300), (002) объясняет увеличение кристалличности. XRD и FTIR подтверждают трансформацию кристаллической фазы с ростом гидротермальной температуры/времени.

ATP-CL яйцескорлуповидные микросферы

Для сравнения адсорбционного поведения приготовили другие яйцескорлуповидные микросферы с CL как органическим кальциевым источником микроволновым гидротермальным методом [24]. По морфологии образцы все еще состоят из яйцескорлуповидных микросфер, подтверждается разбитыми сферами (вставка рис. 6a) и ТЭМ (рис. 6b, c). Результат показывает, что смена кальциевого источника не существенно влияет на морфологию. Выбранно-областная электронная дифракция (SAED) показывает дискретные SAED рефлексы (рис. 6d) — получены хорошо кристаллизованные микросферы. EDS-маппинг демонстрирует равномерное распределение Ca, P, O (рис. 6e). EDS спектры также подтверждают наличие Ca, P, O (рис. 6f) — асинтезированные микросферы — фосфат кальция.

HEL адсорбция и механизм адсорбции микросфер

Рис. 7: адсорбционная способность обоих типов микросфер растет с увеличением начальной концентрации HEL. При 6,5 мг/мл начальной концентрации HEL адсорбция ATP-CG достигает плато, максимум ~332 ± 36 мг/г (рис. 7a), ~в 2 раза выше ATP-CL (176 ± 33 мг/г при 6 мг/мл, рис. 7b).

Результат адсорбции HEL подтверждается FTIR и ТГ. Рис. 8a, b: пики 1134 см⁻¹ (1139 см⁻¹) и 563 см⁻¹ (568 см⁻¹) — PO₄³⁻ ACP, 1039 см⁻¹ (1040 см⁻¹) — PO₄³⁻ HAp наблюдаются в HEL-адсорбированных микросферах — введение HEL не вызывает значимых структурных изменений. Пики 1542 см⁻¹ и 1545 см⁻¹ — амидные группы HEL — подтверждают успешную адсорбцию HEL. Полосы 2966, 2962, 2935, 2927 см⁻¹ — –CH₃ и –CH₂ групп HEL — дополнительно верифицируют наличие HEL. ТГ кривые: потеря массы ATP-CG до и после адсорбции HEL — 11,3% и 36,7% (рис. 8c) => адсорбционная способность ~340 мг/г. ATP-CL: потеря 21,1% до адсорбции, 37% после (рис. 8d) => способность 189 мг/г. ТГ результаты близки к рис. 7.

Для выяснения причины разницы адсорбции равновесные данные проанализированы по D-R изотерме. Аппроксимационные кривые на рис. 9, параметры в табл. 1. Коэффициент корреляции ATP-CG выше ATP-CL — D-R модель подходит для описания адсорбции ATP-CG. E < 8 кДж/моль — адсорбция HEL на ATP-CG физическая сорбция. Максимальная способность Q_m ATP-CG для HEL достигает ~381 мг/г, близко к рис. 7a.

Так как адсорбция HEL на ATP-CG — физическая сорбция, изучен поверхностный потенциал микросфер. Рис. 10a: дзета-потенциал ATP-CG, ATP-CL и HEL в ультрачистой воде — –17 мВ, –22 мВ, +20 мВ. После адсорбции HEL дзета-потенциал ATP-CG и ATP-CL меняется на +2,7 мВ и +1,5 мВ — адсорбция HEL происходит за счет притягательных электростатических сил. Однако электростатическое притяжение не главная причина разницы адсорбции, так как дзета-потенциалы микросфер незначительно отличаются (–17 мВ и –22 мВ).

Для дальнейшего выяснения причины разницы адсорбции изучена удельная поверхность микросфер. Рис. 11a: BET удельная поверхность (S_BET) ATP-CG = 143 м²/г, ~в 3 раза выше ATP-CL (55 м²/г, табл. 2). Удельная поверхность способствует разнице адсорбции. Такая высокая S_BET ATP-CG основана на низкой кристалличности [31]. Рис. 11b: ATP-CG демонстрируют более низкую кристалличность, чем ATP-CL. Разница кристалличности преимущественно обусловлена разными условиями синтеза. Обычно кристалличность продукта растет с степенью гидролиза реагентов при заданном давлении и температуре. Кислотность глюконовой кислоты (pKa=3,39) выше л-молочной (pKa=3,86), что вызывает более медленный гидролиз и в конечном счете более низкую кристалличность. В результате ATP-CG микросферы с более высокой удельной поверхностью получены сменой кальциевого источника.

Заключение

ATP-CG яйцескорлуповидные микросферы спроектированы с использованием ATP как органического фосфорного источника и CG как органического кальциевого источника микроволновым гидротермальным методом. Микросферы демонстрируют высокую удельную поверхность и высокую адсорбционную способность. Исследовано влияние Ca/P, гидротермальной температуры и времени на морфологию и структуру. Установлено, что органические фосфорный и кальциевый источники существенно влияют на формирование яйцескорлуповидной структуры. Кроме того, гидротермальные условия (Ca/P, температура, время) отвечают за формирование яйцескорлуповидных микросфер. Выявлено, что удельная поверхность и поверхностные химические свойства (поверхностный потенциал) — два ключевых фактора, влияющих на адсорбционную способность микросфер, путем сравнения HEL адсорбции двух типов микросфер с разными кальциевыми источниками.

Доступность данных и материалов

Все данные, подтверждающие выводы, включены в статью.

Аббревиатуры

BET:

Измерения Брunaуэра-Эмметта-Теллера

FTIR:

ИК-спектроскопия с Фурье-преобразованием

TEM:

Передаточная электронная микроскопия

XRD:

Рентгеновская дифракция

TGA:

Термогравиметрический анализ

HRTEM:

Высокое разрешение ТЭМ

SAED:

Выбранно-областная электронная дифракция