Нацеленная доставка к раку: декорирование нанovesикул pHLIP для распознавания кислого микружения опухоли

Аннотация

Кислотность на поверхности раковых клеток — признак микружения опухоли, не зависящий от перфузии, поэтому может служить общим биомаркером для таргетирования. Мы использовали пептид вставки при низком pH (pHLIP) для декорирования липосом и ниосом. pHLIP чувствует pH на поверхности раковых клеток и вставляется в мембрану целевых клеток, доставляя наноматериал в близкую близость к клеточной мембране. Липосомы DMPC и ниосомы Tween 20 или Span 20 с и без pHLIP в оболочке полностью характеризованы для фундаментального понимания свойств наноносителей и рационального проектирования pH-чувствительных нановекторов. Продемонстрирована стабильность образцов во времени и в присутствии сыворотки. Исследованы размер, ζ-потенциал, морфология нановекторов, их способность инкапсулировать гидрофильный зонд и модулировать его высвобождение. pHLIP-декорированные везикулы могут быть полезны для получения пролонгированного (модифицированного) высвобождения биологически активных веществ для таргетирования опухолей и других кислых больных тканей.

Введение

Около века назад Пауль Эрлих предложил идею «волшебных пуль» для специфической и более эффективной доставки лекарств. «Волшебные пули» должны защищать лекарство от агрессивной среды, уменьшать побочные эффекты таргетированием в больную ткань, улучшать фармакокинетику и фармакодинамику, модулировать высвобождение.

В 1965 г. Бангам впервые наблюдал фосфолипидные везикулы, а в последующие годы Грегори Грегориадис заложил концепцию липосом как систем доставки лекарств. Они состоят из фосфолипидных закрытых двуслойов (ламелл), где гидрофобные липидные цепи заключены между двумя слоями гидрофильных головок. Замкнутый двуслой окружает водное ядро, позволяя локализовывать липофильные или гидрофильные лекарства соответственно.

Размер липосом критически влияет на судьбу носителя после введения: адсорбцию плазменных белков, распознавание ретикулоэндотелиальной системой (RES), полупериод циркуляции, клеточный трафик. Наномасштабные носители способствуют клетной интернализации и таргетированию опухолей, поэтому многие фокусируются на «нанонизации».

Для более универсальных и экономичных наноносителей применяли синтетические ПАВ для получения липосомоподобных систем. Неионогенные ПАВ широко используются, способны самоорганизовываться в униламеллярные или мультиламеллярные везикулы (ниосомы). Эфиры сорбитана (Spans®) — липофильные вещества для приготовления ниосом. Для продления времени циркуляции и получения «невидимых» наноносителей золотой стандарт — полиэтиленгликоль (PEG): через конъюгацию получают этиоксиэтилированные эфиры сорбитана (Tweens®). Span и Tween отличаются гидрофильно-липофильным балансом (HLB), выбор ПАВ позволяет получать ниосомы с нужными свойствами. Добавление холестерина усиливает стабильность двуслоя, вытягивая хвосты ПАВ, влияя на температуру перехода гель-жидкость и придавая жесткость липофильному двуслою. «Оптимизированный» наноноситель проектируется для улучшения формулировки и/или усиления таргетирования.

Ныне рак — одна из главных причин смертности. Текущие терапевтические подходы имеют ограничения: неэффективная доставка лекарств к опухолям и отсутствие таргетирования, связанное с нежелательными побочными эффектами, которые нанотехнологии могут помочь преодолеть.

В настоящее время развиваются различные таргетинговые подходы. Большинство основаны на таргетировании конкретных биомаркеров, сверхэкспрессируемых на раковых клетках. Однако из-за высокой гетерогенности человеческих опухолей более общие подходы к таргетированию будут гораздо более преимущественными. Кислотность на поверхности раковых клеток — признак микружения опухоли, не зависящий от перфузии, поэтому может служить общим биомаркером. Технология pHLIP (пептид вставки при низком pH) стремительно развивается для таргетированной визуализации и терапевтики малых молекул и наноматериалов к опухолям. pHLIP чувствует pH на поверхности раковых клеток и вставляется в мембрану целевых клеток. Механизм вставки запускается протонированием отрицательно заряженных остатков пептида при низком pH (pH < 7,0), что увеличивает гидрофобность пептида и смещает равновесие к распределению в билипیدный слой. Наноносители, декорированные pHLIP, биосовместимы, таргетируют опухоли и демонстрируют усиленную клеточную интернализацию раковыми клетками. Среди изученных pHLIP-покрытых наночастиц — липидные, полимерные и металлические.

Цель работы — полная характеристика новых везикулярных наноносителей, декорированных pHLIP, для фундаментального понимания свойств наноносителей и облегчения рационального проектирования pH-чувствительных нановекторов.

Материалы и методы

Материалы

Полиоксиэтиленсорбитан монолаурат (Tween 20), сорбитан монолаурат (Span 20), холестерин (Chol), соль Гепес {N-(2-гидроксиэтил)пиперазин-N'-(2-этансульфоновой кислоты)}, человеческая сыворотка, Сефадекс G-75, кальцеин, дифенилгексатриен (DPH) — Sigma-Aldrich. 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC) и 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[4-(p-малеймидофенил)бутирамид] натриевая соль (DSPE-малеймид) — Avanti Polar Lipids, пирен — Fluka. Пептид pHLIP (ACEQNPIYWARYADWLFTTPLLLLDLALLVDADEGT) синтезирован и очищен CS Bio. Остальные реагенты аналитического grado.

Синтез DSPE-pHLIP

pHLIP конъюгировали с DSPE липидами в метаноле ковалентной конъюгацией DSPE-малеймида с единственным цистеиновым остатком на N-терминусе pHLIP, как описано ранее. Кратко: 5 мг пептида в 250 мкл метанола (обдуван аргоном) и DSPE-малеймид (из 9,9 мМ стокового раствора) в хлороформе смешали в молярном соотношении 1:1. Реакционную смесь держали при комнатной температуре 2–6 ч до завершения конъюгации. Ход реакции мониторили ОЖХХ на градиенте 25–80% ацетонитрила в воде с 0,05% TFA по уменьшению пика немаркированного pHLIP. Синтезированный конъюгат характеризовали SELDI-TOF масс-спектрометрией. Концентрацию DSPE-pHLIP определяли абсорбцией по молярному коэффициенту погашения pHLIP: ε₂₈₀ = 13 940 М⁻¹см⁻¹.

Подготовка и очистка везикул

Метод тонкослойной эвапоррации использовали для приготовления везикул из неионогенных ПАВ (Tween 20 или Span 20) и фосфолипидов (DMPC), с и без pHLIP. В каждой формуляции холестерин добавляли в разных молярных соотношениях (Таблица 1).

Состав образцов оптимизирован на основе ранее хорошо охарактеризованных структур, в которые добавляли одинаковое количество pHLIP.

Липофильные компоненты сначала растворяли в смеси CHCl₃:CH₃OH (3:1); органический растворитель удаляли в вакууме при разных температурах в зависимости от образца. Полученную пленку гидрировали 5 мл буфером Гепес (0,01 М, pH 7,4) или раствором натриевого кальцеина 10⁻² М. Суспензию вихревали ~5 мин, затем ультразвуком (см. Доп. файл 1: Таблица S1) на микрозонде 20 кГц (VibraCell-VCX 400-Sonics). Соникацию LipoDMPC проводили в инертной атмосфере для предотвращения окисления.

Суспензию везикул очищали гель-проницающей хроматографией на Сефадексе G-75 (стеклянная колонка 50×1,2 см) с буфером Гепес в качестве элюента. Затем очищенную суспензию фильтровали целлюлозными фильтрами с соответствующим диаметром пор. Тот же метод использовали для pHLIP-покрытых ниосом и липосом.

Измерения динамического рассеяния света

Средний размер и распределение везикул измеряли при T = 25 °C динамическим рассеянием света (DLS), используя Malvern NanoZetaSizer ZS90 с 5 мВт HeNe лазером (λ = 632,8 нм) и цифровым коррелятором. Нормированные автокорреляционные функции рассеянной интенсивности под углом 90° анализировали алгоритмом Contin для получения распределения коэффициента диффузии D, а значит гидродинамического радиуса R_H через стоokes-Эйнштейн: R_H = k_B T / 6πηD. Ширина распределения размеров ниосом/липосом мала, но не пренебрежима. Значения в Таблице 2 — интенсивностно-взвешенные средние гидродинамические диаметры.

Измерения ζ-потенциала

Электрофоретная подвижность измеряли лазерным допплеровским электрофорезом на Malvern NanoZetaSizer ZS90. Подвижность u конвертировали в ζ-потенциал по Смолуховскому: ζ = uη/ε, где η и ε — вязкость и диэлектрическая проницаемость растворителя.

Малоугловое рентгеновское рассеяние

МРР эксперименты проводили на Европейском синхротронном источнике (ESRF, Гренобль, Франция). Использование высокосветлой линейки ID02 позволило измерения в разбавленных растворах в области импульсного переноса 0,1 нм⁻¹ ≤ q ≤ 6 нм⁻¹, q = (4π/λ)sin(θ/2), где θ — угол рассеяния, λ = 0,1 нм — длина волны рентгена. Исследуемая длина волны 1–60 нм, подходит для внутренней структуры ниосом/липосом. Все эксперименты при T = 25 °C с коротким облучением 0,1 с для предотвращения радиационного повреждения. Для каждого образца рассеянная интенсивность на разных углах фиксировалась 2D детектором, затем угловая перегруппировка, вычитание фона и растворителя, анализ для получения информации о форме и внутренней структуре везикул в растворе.

Для униламеллярных везикул замкнутый двуслой моделировали тремя концентрическими оболочками: внешние головки, гидрофобные цепи, внутренние головки. Предполагали распределение Шульца для размера везикул.

Крио-ТЭМ

Раствор везикул (5 мкл капли) наносили на сетку Lacey formar/углерод и сохраняли в витрифицированном гидратированном состоянии быстрой заморозкой в жидком этане. Витрификация на FEI Vitrobot: один блот 3 с, смещение 1, дренаж и ожидание 1 с. ТЭМ (JEOL 2100) с ускоряющим напряжением 200 кВ при увеличении ×10 000 – ×150 000 образовали везикулы.

Исследования стабильности

Физическая стабильность ниосом и липосом, с и без pHLIP, изучали при двух температурах хранения (25 °C и 4 °C). Цель — оценить значимые изменения размера и ζ-потенциала за 90 дней. Образцы из каждой партии отбирали через интервалы (1, 30, 60, 90 дней) и определяли размер и ζ-потенциал как описано.

Также стабильность исследовали в присутствии биологических жидкостей, человеческой сыворотки. Суспензии контактировали с 45% сыворотки при 37 °C. В интервалах (0, 30 мин, 1 ч, 2 ч, 3 ч) вариации размера и ζ-потенциала определяли как описано.

Характеризация двуслоя

Текучесть и микровязкость-полярность ниосом/липосомных двуслоев оценивали флуоресцентными измерениями двух зондов: дифенилгексатриена (DPH) и пирена, расположенных в гидрофобной области мембраны. DPH (2 мМ) и пирен (4 мМ), 220 мкл и 2,5 мг соответственно, добавляли в смесь ПАВ или фосфолипид/холестерин перед приготовлением везикул. После очистки пирен-содержащих везикул, DPH-содержащие фильтровали через поры от 5,0 до 0,22 мкм.

Флуоресцентная анизотропия измеряли при комнатной температуре на LS55 спектрофлюорометре (PerkinElmer) при λ_exc = 400 нм, λ_em = 425 нм по уравнению:

где I_vv и I_vh — интенсивности параллельно и перпендикулярно вертикально поляризованному возбуждению. Корректирующий фактор G = I_hv/I_hh — отношение вертикальной и горизонтальной компонент при горизонтальном возбуждении. Значения анизотропии обратно пропорциональны текучести мембраны. Высокая анизотропия соответствует высокому структурному порядку и/или низкой текучести.

Для оценки микровязкости и микрополярности двуслоя проводили флуоресцентные эксперименты с пиреном на Perkin-Elmer LS55 при λ_exc = 330 нм, регистрируя эмиссию 350 < λ_em < 550 нм. Тонкая структура флуоресценции пирена имеет пять пиков. Отношение интенсивностей первого (372 нм) и третьего (382 нм) вибрационных полос, I₁/I₃, связано с полярностью среды пирена. Низкие I₁/I₃ соответствуют неполярной среде. Пирен в двуслое может формировать внутримолекулярные экцимеры, процесс чувствителен к вязкости микружения. Отношение экцимер/мономер I_E/I_M связано с микровязкостью.

Исследования проводили на везикулах с и без pHLIP, результаты сравнивали.

Исследования высвобождения кальцеина

Неионогенные ПАВ или фосфолипидные везикулы загружали кальцеином 10⁻² М. При этой концентрации флуоресценция кальцеина самопогашена. Депогашение использовали для определения высвобождения кальцеина из водного ядра. Флуоресцентный зонд загружали при гидратации пленки 5 мл водным раствором кальцеина. Суспензии очищали хроматографией, контактировали с 45% человеческой сыворотки или Гепес, загружали в диализный мешок целлюлозной мембраны (cut-off 8000 Да, Spectra/Por). Высвобождение изучали при 37 °C под магнитным перемешиванием в буфере Гепес (10 мМ, pH 7,4) как внешней среде. Аликвоты внешней среды отбирали в разное время за 0–24 ч. Отборные аликвоты периодически возвращали в систему.

Высвобождение кальцеина мониторили флуоресценцией среды на Perkin-Elmer LS50B при λ_ex = 492, λ_em = 520 нм. Референсное значение F_∞ (произвольные единицы), коррелирующее с общим количеством кальцеина в везикулах, определяли после разрушения везикул изопропиловым спиртом (1:1 v/v). Проценты высвобождения (F%) в каждую точку времени:

где F_t — флуоресценция в момент t.

Статистический анализ

Использовали односторонний ANOVA. Апостериорный t-тест Бонферрони оценивал значимость ANOVA. p < 0,05 считался статистически значимым. Результаты — среднее трех экспериментов ± стандартное отклонение.

Результаты и обсуждение

Везикулы Tween20-, Span20-, DMPC-, с и без DSPE-pHLIP, характеризованы по размеру и ζ-потенциалу (Таблица 2).

По результатам Таблицы 2, анализируемые образцы не показывают значительных вариаций ни в размере, ни в ζ-потенциале, независимо от наличия pHLIP.

Указанные диапазоны размеров подтвердились альтернативным методом — крио-ТЭМ (рис. 1).

Внутренняя структура ниосом/везикул с и без DSPE-pHLIP определена МРР. Спектры интенсивности МРР на рис. 2 различаются, указывая на уникальные особенности каждой системы.

Tween20-ниосомы униламеллярны, DMPC везикулы показывают определенную мультиламеллярность (как липосомы), видный пик при q ≅ 1 нм⁻¹, соответствующий межламеллярному расстоянию 6 нм (~5 нм липидный двуслой и 1 нм вода). Span20-везикулы определенно мультиламеллярны, пик при q = 1,6 нм⁻¹, межламеллярное расстояние 3,8 нм, соответствующее удвоенной длине молекулы Span20. Результаты указывают, что многослойная оболочка Span20 состоит из смежных двуслоев почти без межламеллярной воды.

Наличие DSPE-pHLIP (менее 1% молярная доля) не драматически влияет на системы. Рассеянная интенсивность во всем q-диапазоне довольно похожа, указывая на сравнимую долю структурированного материала и общий размер частиц.

DMPC-везикулы показывают незначительное увеличение числа двуслоев в липосоме, следуя из роста интенсивности Брагг-пика при q = 1 нм⁻¹. Вставка малой доли DSPE C18-цепей, связанных с каждой молекулой пептида, не меняет толщину липидного двуслоя, в основном диктуемую большой долей холестерина относительно DMPC (~40–50%). При этой концентрации холестерина липидные цепи организованы в жидко-упорядоченную (Lo) фазу, характеризующуюся разрывом слабого бокового позиционного порядка цепей при высоком ориентационном порядке вдоль цепей и способной принимать несколько C18-цепей без структурных изменений. Span20-мультиламеллярные везикулы также не показывают изменений внутренней структуры.

В системе Tween20 + pHLIP присутствует небольшое количество кристаллитов холестерина, видный острый пик при q = 1,84 нм⁻¹ (характерное расстояние 3,41 нм), структура везикул не меняется. Наличие микрокристаллитов часто ассоциировано с Tween-ниосомами в количестве, зависящем от состава, процедуры и очистки. На рис. 2 показаны два экспериментальных спектра Tween20 и Tween20 + pHLIP вместе с кривыми аппроксимации, моделирующими сферически замкнутый двуслой тремя концентрическими оболочками: внешние головки, цепи, внутренние головки. Аппроксимационный средний размер везикул ~168 нм в обеих системах, в согласии с DLS. Структурные параметры одинаковы для двух замкнутых двуслоев (см. Доп. файл 1: Рис. S1 и Таблица S2) за исключением внешней оболочки: при наличии DSPE-pHLIP наблюдается незначительное снижение (5%) электронной плотности головок (с 0,42 до 0,40 э/ų) и увеличение шероховатости слоя. Это указывает, что добавление DSPE-pHLIP преимущественно влияет на внешнюю оболочку везикул. Согласуется с картиной, где DSPE C18-цепи вставляются в двуслой и закрепляют пептид на поверхности везикулы, среди растянутых и разветвленных полиэтиленгликоль-головок. Заметим, что способность самого pHLIP пептида (не связанного с липидами) взаимодействовать с внешней поверхностью везикул при высоком pH и вставляться в двуслой при низком pH недавно наблюдалась МРР для ненасыщенных фосфолипидных двуслоев. В настоящем исследовании молярная доля пептида значительно ниже и пептид связан с липидами, цель — спроектировать pHLIP-покрытые pH-чувствительные нановекторы. Ассоциация pHLIP движима гидрофобным взаимодействием конъюгированных DSPE C18-цепей, вставляющихся в гидрофобную область нановектора. pHLIP пептид заякорен и лежит в области внешних головок, склонен взаимодействовать с целевыми мембранами при кислом pH и/или высвобождать содержимое нановектора после перестройки двуслоя в кислой среде.

Для исследования влияния pHLIP на микрореологические свойства двуслоя (текучесть, микровязкость, полярность) провели характеристику липофильной оболочки. Использовали флуоресцентный зонд пирен, добавленный в образцы в начале приготовления. Благодаря липофильной природе он вставляется в двуслой везикул, давая информацию о полярности и микровязкости мембранной среды.

Как показано в Таблице 3, во всех трех наборах образцов значения полярности лишь незначительно снижаются при наличии pHLIP по сравнению с контрольноными везикулами, в то время как значения микровязкости показывают трехкратное увеличение для всех везикул.

Двуслой дополнительно характеризовали измерениями флуоресцентной анизотропии другого липофильного зонда DPH, включенного в липиды. Эти измерения отражают движение зонда и его ориентацию в двуслое, давая информацию о текучести, влияющей на способность везикул высвобождать содержимое. Значения анизотропии обратно пропорциональны текучести. Следовательно, высокая анизотропия соответствует высокому структурному порядку и/или низкой текучести, как в жидко-упорядоченной фазе.

Значения анизотропии для каждого образца в Таблице 3. Данные указывают, что наличие DSPE-pHLIP в везикулах увеличивает текучесть мембраны, так как флуоресцентная анизотропия снизилась. Известно, что текучесть двуслоя влияет не только порядок и боковая организация аполярных цепей, но и полярные головки. МРР результаты на трех системах показывают, что DSPE-pHLIP молекулы влияют преимущественно на область головок, в конечном счете вызывая другую упаковку полярных головок. Структурные результаты согласуются с микрореологическими свойствами двуслоев при ассоциированном DSPE-pHLIP, раскрытыми вставкой двух разных зондов. Результаты показывают увеличенную микровязкость по пирену, зонду, вставляющемуся близко к внешней области (log P пирена 4,88). С другой стороны, DPH предположительно встроен в ядро двуслоев, ориентирован параллельно осям ациловых цепей или ограничен в центре двуслоя, параллельно поверхности. Он в значительной степени чувствителен к угловой реориентации ациловых цепей амфифилов. Повышенная текучесть, открытая DPH, может быть связана и с эффектом вставки DSPE цепей среди других ациловых цепей, и с эффектом разделения pHLIP в области полярных головок, меняющей упаковочные свойства ПАВ (Рис. 3).

Дальнейшие характеристики проведены на изученных препаратах. Все образцы, с и без pHLIP, хранили 90 дней при 4 °C для оценки стабильности во времени, измеряя вариации размера и ζ-потенциала (Доп. файл 1: Рис. S2). Значимых вариаций не наблюдалось; все препараты стабильны при хранении 4 °C.

Кроме того, стабильность изучали в присутствии 90% (v/v) человеческой сыворотки при 37 °C на 3 ч (Доп. файл 1: Рис. S3).

В контакте с сывороткой Tween20 везикулы показывали увеличение размера, хотя оставались ниже 300 нм. Размер и PDI оставались постоянными в течение 3-часового эксперимента, указывая на сохранность везикул в суспензии.

Оба образца Span20 в контакте с сывороткой показывали увеличение размера, особенно с pHLIP, тогда как PDI указывал на однородное распределение размеров (данные не показаны). Это может быть из-за адсорбции плазменных белков на ниосомальную поверхность в результате электростатических взаимодействий, но без разрушения везикул. Гипотеза подтверждается снижением ζ-потенциала после контакта с сывороткой. Явление происходит, когда ζ-потенциал достигает слегка отрицательных значений, около области нейтральности, делая систему нестабильной, и везикулы начинают агрегироваться.

Как и Tween20, DMPC везикулы показывали увеличение размера по сравнению с до-контактным образцом. Однако вариация оказалась незначительной, размеры оставались ниже 280 нм (DMPC) или 240 нм (DMPC + pHLIP).

Способность к высвобождению оценивали для образцов с и без pHLIP по количеству высвобожденного кальцеина (гидрофильный зонд) со временем.

Исследования проводили при 37 °C на 24 ч, экспонируя очищенные образцы с буфером HEPES или сывороткой. Как на рис. 4, профили высвобождения кальцеина очень похожи для Tween20 и Tween20-pHLIP в HEPES или сыворотке.

Высвобожденное количество кальцеина 30–50%, различий между образцами с и без pHLIP нет.

Те же результаты для Span и DMPC образцов (данные не показаны).

Сравнимые профили высвобождения сообщались для стимуло-реактивных наноносителей, таких как термочувствительные кубосомы или полимерные самоорганизующиеся наноносители (SANs).

В заключение, физико-химические различия в микровязкости и текучести для образцов с и без pHLIP (Таблица 3) не влияют на их способность к высвобождению (Рис. 4), согласно тому, что вставка DSPE-pHLIP влияет преимущественно на область головок. Данные согласуются с ранее сообщенными результатами, показывающими, что при нейтральном и высоком pH pHLIP связан с поверхностью липосом из 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (POPC) и не индуцирует слияние или утечку мембраны.

Заключение

Это исследование подтверждает возможность приготовления pHLIP-декорированных везикул. Образцы стабильны при хранении 4 °C минимум 3 месяца и в присутствии сыворотки. Предложенные нановекторы способны инкапсулировать гидрофильный зонд и модулировать его высвобождение.

pHLIP-везикулы полностью охарактеризованы для фундаментального понимания свойств наноносителей и облегчения рационального проектирования pH-чувствительных нановекторов.

Ассоциация pHLIP движима гидрофобным взаимодействием конъюгированных DSPE C18-цепей, вставляющихся в гидрофобную область нановектора. pHLIP пептид заякорен и лежит в области внешних головок, склонен взаимодействовать с целевыми мембранами при кислом pH и/или высвобождать содержимое нановектора после перестройки двуслоя в кислой среде.

Согласно этим выводам, предложенные pHLIP-декорированные везикулы могут быть полезны для получения пролонгированного (модифицированного) высвобождения биологически активных веществ для таргетирования опухолей и других кислых больных тканей.

Аббревиатуры

Chol:

Холестерин

Cryo-TEM:

Крио-проходная электронная микроскопия

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMPC:

1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин

DPH:

Дифенилгексатриен

pHLIP:

Пептид вставки при низком pH

SAXS:

Малоугловое рентгеновское рассеяние

Span20:

Сорбитан монолаурат

Tween20:

Полиоксиэтиленсорбитан монолаурат