Колориметрический сенсор на золотих наночастицах для низкомолекулярных AGEs в гликированном гемоглобине A0

Аннотация

Белковая гликизация в диабетической плазме генерирует конечные продукты гликизации (AGEs), движущие прогрессированием болезни. Мы гликировали гемоглобин A0 (HbA0) in vitro фруктозой, затем использовали полученный гликированный белок как матрицу для синтеза золотых наночастиц (ЗНЧ). Поверхностно-плазмонный резонанс (SPR) ЗНЧ сильно коррелировал со степенью гликизации. Гель-фильтрационная фракционировка выявила две популяции продуктов: высокомолекулярные белково-переклеенные фрагменты и низкомолекулярные небелковые AGEs. Только вторые индуцировали формирование ЗНЧ, валидируя предложенный анализ. Поскольку AGEs служат надежными биомаркерами диабета и его осложнений, этот колориметрический сенсор на ЗНЧ предлагает быстрый, недорогой диагностический инструмент с потенциальным клиническим влиянием.

Введение

Сахарный диабет 2 типа (СД2) характеризуется хроническим гипергликемией, запускающей реакцию Майяра — неферментативную гликизацию белков и сахаров. Исходная база Шиффа быстро превращается в амадори-продукт, который претерпевает дальнейшие превращения в AGEs. AGEs переклеивают белки, активируют рецептор RAGE, индуцируют окислительный стресс и воспаление, способствуя сердечно-сосудистым заболеваниям, нефропатии, ретинопатии и нейродегенерации. Другие пути — окисление глюкозы, перекисное окисление липидов, полиольный путь — тоже генерируют AGEs, а пищевое поступление добавляет к системным уровням. Несмотря на гетерогенность, AGEs делят ковалентное переклеивание и бронирующий эффект, делая их привлекательными биомаркерами диабета, старения и связанных расстройств.

Текущее обнаружение AGEs опирается на дорогую хроматографию-масс-спектрометрию или ЭЛИСА, ограничивая точечную диагностику. Простые, быстрые, дешевые колориметрические сенсоры очень желательны. Золотые наночастицы (ЗНЧ) предлагают настраиваемый SPR и успешно применялись как колориметрические репортеры для сахаров, белков, белковых агрегатов. Мы ранее показывали, что гликированные белки могут засеять синтез ЗНЧ, с отражением степени гликизации в оптическом отклике. Развивая это, мы исследовали, могут ли низкомолекулярные AGEs запускать формирование ЗНЧ и служить основой для качественного сенсора.

Методы

Материалы

Гемоглобин A0 и Сефадекс G25 (Sigma Aldrich) использованы как получены. Хлораурат золота(III) тригидрат (HAuCl₄·3H₂O, Loba Chemie) — источник Au⁺. Фруктоза, фосфатные буферы, аналитические реагенты — стандартные поставщики. Вода MilliQ (>18 МОм) использовалась везде.

Методы

Гликизация HbA0

HbA0 (1 мг·мл⁻¹) инкубировали с фруктозой (0,1 М) в 0,1 М фосфатном буфере, pH 7,4, при 37 °C 1–10 дней. Образцы аликвотировали на день 0 (контроль) и день 10 (полностью гликированный) и хранили в стерильных условиях.

Анализ восстанавливающего свойства

Восстанавливающая активность количественно определили феррицианидным восстановлением. После инкубации с калиевым феррицианидом реакционную смесь закисляли и измеряли абсорбцию при 700 нм; более высокая абсорбция — более сильная восстанавливающая способность.

Гель-фильтрационная хроматография

Образцы Fruc-Hb дня 0 и дня 10 фракционировали на колонке Сефадекс G25 (15 см × 1 см) со скоростью 7,5 мл/ч. Собрали 30 фракций, анализировали УФ-абсорбцию (280 нм) и Бредфорд-тестом на белок.

Синтез золотых наночастиц

Золотую соль (1% м/в HAuCl₄) смешивали с водой и перемешивали до бледно-желтого цвета. Добавляли Fruc-Hb (12,5 нг·мкл⁻¹) или отдельные фракции (1 нг·мкл⁻¹), затем оставляли без движения для роста ЗНЧ. Конечные цвета от розового до фиолетового указывали на успешное формирование наночастиц.

Бредфорд-тест

Белковое содержание в фракциях количественно определили абсорбцией при 595 и 450 нм; отношение (OD₅₉₅/OD₄₅₀) отражало обогащение белком.

Спектроскопия

УФ-Vis спектроскопия

Спектры записывали на Perkin Elmer Lambda 25 в диапазоне 200–800 нм при длине куветы 1 см.

Флуоресцентная спектроскопия

Внутренняя белковая флуоресценция (возбуждение 280 нм) и флуоресценция AGEs (возбуждение 350 нм) измеряли на Agilent Cary Eclipse.

Циркулярная дихроизм спектроскопия

Дальнее УФ КД (190–260 нм) оценивало изменения вторичной структуры на спектрометре Chirascan.

Передаточная электронная микроскопия

ЗНЧ образовали на JEOL 2100F ТЭМ после центрифугирования и сушки на углеродных сетках.

Цветовой интенсивностной профиль ЗНЧ

Цвет количественно оценивали расчетом (R–B)/G из цифровых изображений.

SDS-PAGE

Гликированные и контрольные образцы HbA0 разделяли на 12% разделяющем геле, визуализировали белым светом.

Результаты

Синтез ЗНЧ из фруктозы, HbA0 и гликированного HbA0

Флуоресценция при 450 нм (возбуждение 350 нм) выросла >10 раз после 10 дней инкубации с фруктозой, подтверждая формирование AGEs (рис. 1). Тесты восстанавливающей способности показали: день 10 Fruc-Hb > день 0 Fruc-Hb > фруктоза > HbA0 (рис. 2а). Только день 10 Fruc-Hb дал стабильные ЗНЧ за 4 дня (рис. 2б), с SPR пиком при 530 нм (рис. 2в) и сферическими частицами 22 ± 2,4 нм (рис. 2г). Данные подтверждают, что AGEs, а не просто изменения белка, движут синтез ЗНЧ.

Фракционирование Fruc-Hb разделяет два класса продуктов гликизации

Гель-фильтрация дала две популяции в дне 10 Fruc-Hb: высокомолекулярные белковые фрагменты (фракции 5–12, 15+) и низкомолекулярные небелковые AGEs (популяция II). День 0 Fruc-Hb дал только белковую фракцию (популяция I) (рис. 3). УФ-абсорбция 280 нм и Бредфорд подтвердили белковую природу популяции I, тогда как популяция II показывала УФ-абсорбцию, но пренебрежимое белковое содержание.

Флуоресценция белковых и небелковых продуктов гликизации

Только фракции дня 10 показывали флуоресценцию AGEs при 450 нм. Фракции популяции I имели более высокую интенсивность, указывая на белково-связанные AGEs, тогда как фракции популяции II излучали слабее, но сохраняли УФ-абсорбцию, подтверждая их небелковую низкомолекулярную природу (рис. 4).

ЗНЧ, засеянные на фракциях Fruc-Hb, дифференцируют продукты гликизации

При синтезе ЗНЧ с отдельными фракциями только популяция II (небелковые AGEs) дала стабильные окрашенные ЗНЧ, а популяция I — нет (рис. 5). Это демонстрирует, что низкомолекулярные AGEs отвечают за формирование наночастиц и могут служить селективным сенсором. Увеличение концентраций Fruc-Hb и золота ускоряло реакцию до 1 дня, подчеркивая пригодность для точечной диагностики (рис. S5). Линейная зависимость цветовой интенсивности от концентрации Fruc-Hb 8–40 нг·мкл⁻¹ подтвердила количественный потенциал (рис. 6).

Обсуждение

Наше исследование устанавливает, что низкомолекулярные AGEs — активные виды, движущие синтез ЗНЧ. Фракционирование показало, что только небелковые AGEs запускают формирование наночастиц, давая четкую механистическую основу сенсора. ЗНЧ обеспечивают высокую чувствительность и детектируют AGEs на нанограммовом уровне, с пределом обнаружения 1 нг·мкл⁻¹. Метод прост, дешевен, совместим с малыми объемами образца, идеален для быстрого точечного мониторинга диабета. Будущая работа может расширить подход для различия конкретных видов AGEs и обнаружения продвинутых продуктов перекисного окисления липидов, расширяя клиническую пользу.

Заключение

Мы представили надежный колориметрический анализ, детектирующий низкомолекулярные AGEs в гликированном гемоглобине с нанограммовой чувствительностью. Используя восстанавливающую способность AGEs для засевания формирования ЗНЧ, сенсор дискриминирует гликированные и негликированные образцы, и белково-связанные и свободные AGEs. По сравнению с ЖХ-МС/МС, этот анализ предлагает быструю, недорогую альтернативу для мониторинга прогрессирования диабета и связанных осложнений. Специфичность к AGEs в сочетании с простотой позиционирует его как перспективный инструмент для клинической диагностики и персонализированного гликемического управления.