Простое получение микросфер rGO@Fe₃O₄ для магнитно-направленной химио-фототермической терапии рака, реагирующей на ближний ИК-диапазон

Аннотация

Показано, что графен, реагирующий на излучение ближнего инфракрасного (БИК) диапазона, демонстрирует перспективный эффект в фототермической аблиации рака. В данной работе сообщается о получении полых микросфер графена, декорированных Fe₃O₄ (rGO@Fe₃O₄), простым методом распыления и ко précipитации для магнитно-направленной и БИК-реагирующей комбинированной химио-фототермической терапии. Микросферы обладают очень высокой удельной поверхностью (~120,7 м²/г) и большим пористым объемом (~1,012 см³/г), что обеспечивает высокую загрузочную способность доксорубицина (DOX) (~18,43%). БИК-индуцированный фототермический эффект микросфер rGO@Fe₃O₄ реагирует в режиме «вкл-выкл» и обеспечивает высокий коэффициент фототермического преобразования. Кроме того, Fe₃O₄ на микросферах проявляет отличную способность к таргетированию опухолевых клеток. Комбинированная химио-фототермическая терапия на основе rGO@Fe₃O₄/DOX демонстрирует превосходную цитотоксичность по отношению к клеткам HeLa in vitro. Исследования показывают, что микрокапсулы rGO@Fe₃O₄/DOX обладают большим потенциалом для комбинированной химио-фототермической терапии рака.

Введение

Рак является одним из самых злокачественных заболеваний в мире и ведущей причиной смертности человека [1, 2]. Хотя химиотерапия широко применяется в клинике, низкая терапевтическая эффективность и обширные побочные эффекты серьезно ограничивают её применение [3]. Системы доставки лекарств (СДЛ) показывают преимущества в повышении растворимости, биодоступности и накопления препаратов в опухоли, что должно значительно улучшить их антиопухолевую эффективность [4]. В последнее время полые микросферы как СДЛ привлекают внимание благодаря большой площади поверхности и обильной пористой структуре [5–8], и разработано несколько материалов с инновационными технологиями [9–13].

Оксид графена (ОГ) — новый неорганический бесметаллический материал, широко изучаемый для доставки лекарств благодаря уникальным свойствам: хорошей биосовместимости, низкой стоимости и простому получению [14–17]. Особенно важно, что ОГ эффективно преобразует свет в тепло под воздействием БИК-облучения [18–20], что делает его перспективным для усиления фототермической терапии рака. Группа Чена показала, что ОГ может доставлять антиопухолевые препараты за счет нековалентных взаимодействий (π-π-стакирование, водородные связи, электростатическая адсорбция) [21]. Однако 2D-наносисты ОГ склонны к агломерации из-за большой удельной поверхности и сил Ван-дер-Ваальса между слоями [17, 22], что ухудшает растворимость в воде и снижает загрузочную способность. Разрабатывались стратегии преодоления этих недостатков. Группа Цукрука создала полые капсулы из графена методом слоезаслойной сборки [23], показавшие экстремально высокую загрузочность по сравнению с другими материалами на базе ОГ, что обусловлено высокой удельной площадью и пористым объемом, стабилизированными ОГ. Однако мало работ посвящено изучению ОГ с трехмерно-связанной пористой структурой для доставки лекарств.

Хотя многие СДЛ демонстрируют высокую загрузочность и контролируемое освобождение, их доклинические исследования ограничены недостаточной специфичностью к опухолевым тканям [24]. Среди систем таргетированной доставки Fe₃O₄ — магнитный материал, широко используемый в онкологии благодаря высокой магнитной отзывчивости, стабильности и доступности [25–29]. Группа Ни разработала наночастицы сердцевина-оболочка Fe₃O₄@SiO₂ со сверхпарамагнитными свойствами для магнитного таргетирования опухолей [30]. Кроме того, наночастицы Fe₃O₄, закрепленные на ОГ, изучались для комбинации магнитной доставки и фототермической терапии [31–34].

В настоящем исследовании предлагается передовая стратегия создания платформы СДЛ на основе полых микросфер rGO, декорированных оксидом железа (rGO@Fe₃O₄), для магнитно-направленной и БИК-индуцированной фототермической терапии (ФТТ). Как показано на Схеме 1, rGO@Fe₃O₄ получают в три этапа. Сначала методом распыления с использованием SiO₂ как шаблона синтезируют rGO-SiO₂, затем удаляют SiO₂ омыванием в HF, получая полые микросферы rGO. После этого наночастицы Fe₃O₄ осаждают на пористый rGO, формируя rGO@Fe₃O₄. В этой системе rGO служит БИК-агентом ФТТ, а Fe₃O₄ обеспечивает магнитное таргетирование к клеткам HeLa. Доксорубицин (DOX), инкапсулированный в микросферы (rGO@Fe₃O₄/DOX) за счет пористой адсорбции и π-π-стакирования, демонстрирует ультравысокую загрузочность и pH-зависимое освобождение, что значительно усиливает антиопухолевой эффект за счет синергизма фототермической и химиотерапии.

Материалы и методы

Реактивы

Шестигидрат хлорида железа (FeCl₃·H₂O), гидроксид натрия (NaOH), семигидрат сульфата железа (FeSO₄·7H₂O) приобретены в Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Клетки HeLa получены из Тяньцзиньской онкологической больницы. Фосфатно-буферный раствор (ФБР), гидрохлорид доксорубицина (DOX·HCl), среда DMEM, 4′,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI) и набор CCK-8 — от Solarbio Science and Technology Co., Ltd. SiO₂ (~300 нм) — от Shanghai Yuanjiang Chemical Company. Водный раствор ОГ (2 мг/мл) — коммерческий продукт Nanjing Xianfeng Company.

Подготовка микросфер rGO@Fe₃O₄

Полые микросферы графена получены методом распыления с использованием SiO₂ (300 нм) в качестве шаблона. Кратко: 100 мл суспензии SiO₂ (50 мг/мл) капали в 300 мл водного раствора ОГ (2 мг/мл) при интенсивном перемешивании, смесь распыляли при 200 °C в установке для распыления. Полученный продукт выдерживали при 300 °C в атмосфере аргона 2 ч, получая rGO-SiO₂. Для удаления SiO₂ rGO-SiO₂ помещали в 10% раствор HF на 48 ч при 60 °C. Твердый продукт многократно вымывали и сушили в вакуумной сушилке при 60 °C 12 ч, выход rGO составил 75%.

Наночастицы rGO@Fe₃O₄ получали методом ко précipитации. Типичный процесс: 0,27 г FeCl₃·H₂O, 0,28 г FeSO₄·7H₂O и 0,1 г полых микросфер rGO растворяли в 10 мл деионизированной воды и перемешивали 30 мин при 50 °C. Затем капельно добавляли 60 мл NaOH (0,15 моль/л) при непрерывном перемешивании при 50 °C в течение 12 ч. Продукт магнитно отделяли, многократно вымывали деионизированной водой и этанолом, сушили в вакууме при 60 °C 12 ч.

Структурная характеристика

Размер и морфологию анализировали rasterной электронной микроскопией (FE-SEM, Hitachi S-4800) и проходной электронной микроскопией (TEM, JEM2100F, JEOL). Состав изучали рентгеновской дифракцией (XRD, D8 Focus, Cu Kα, Bruker) со скоростью 12°/мин в диапазоне 10–80°. Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (XPS) выполнялась на ESCALAB 250Xi (Thermo Fisher). ИК-спектры (FT-IR, AVATAR360, Nicolet) регистрировали в диапазоне 500–4000 см⁻¹ с разрешением 4 см⁻¹. Магнитные свойства измеряли сверхпроводящим квантовым интерферометром (SQUID, Quantum Design MPMS) при комнатной температуре (300 К). Рамановские спектры снимали на inVia Reflex (Renishaw) с лазером 532 нм. Содержание rGO определяли термогравиметрическим анализом (TGA, TA Instruments SDTQ-600). Удельную площадь измеряли методом BET. UV-Vis спектры записывали на Beckman DU 800.

Загрузка и освобождение DOX

DOX (модельный химиотерапевтический препарат) инкапсулировали в ядра rGO@Fe₃O₄ для оценки загрузки и освобождения in vitro. rGO@Fe₃O₄/DOX готовили по литературе [ссылка]. Кратко: 10 мл водного раствора DOX (0,2 мг/мл) добавляли к 10 мг rGO@Fe₃O₄, ультразвуковой обработкой обеспечивали отсутствие осадка. Смесь инкубировали на возвратно-поступательном шейкере (SK-O180-Pro) 150 об/мин 24 ч. После центрифугирования (6000 об/мин, 10 мин) необсорбированный DOX удаляли, надnatант анализировали UV-Vis спектрофотометром для определения количества загруженного DOX. Оптическая плотность DOX измеряли при 490 нм. Эффективность загрузки (LE) и загрузочная способность (LC) считали по формулам:

LE = (общее количество DOX – свободный DOX) / общее количество DOX

LC = (общее количество DOX – свободный DOX) / количество rGO@Fe₃O₄/DOX

In vitro освобождение DOX изучали, помещая rGO@Fe₃O₄/DOX (10 мг) в диализационный мешок (MWCO = 1000) с ФБР (30 мл) pH 5,4; 6,5; 7,4, в термостате 37 °C, 80 об/мин. В заданные интервалы забирали 3 мл среды, определяли количество освобожденного DOX по UV-Vis при 480 нм.

БИК-индуцированный фототермический эффект

Для оценки влияния дозы rGO@Fe₃O₄ на фототермический эффект растворы разной концентрации (0,0625; 0,125; 0,25; 0,5; 1 мг/мл) облучали БИК-лазером (2 Вт/см²) 5 мин. Влияние мощности изучали на растворе 0,25 мг/мл при 1; 1,5; 2 Вт/см² 5 мин. Температуру измеряли ИК-камерой FLIR I5.

In vitro поглощение клетками

Клетки HeLa посеяли в конфокальные чашки (35 мм²) плотностью 1×10⁵ клеток/ячейку. После 24 ч инкубации (5% CO₂, 37 °C) среду заменили на свежую с rGO@Fe₃O₄/DOX (0,1 мг/мл) с магнитом и без. Через 5 ч клетки вымывали холодным ФБР (pH 7,4), фиксировали 4% параформальдегидом 20 мин и анализировали конфокальной лазерной сканирующей микроскопией (CLSM, Leica TCSSP5II).

Тесты на живучесть клеток

Цитотоксичность оценивали CCK-8 после БИК-облучения. HeLa посеяли в 96-ямчатые пластинки (5×10³ клеток/ячейка) в 100 мкл среды, 24 ч (5% CO₂, 37 °C). Для биосовместимости: rGO@Fe₃O₄ 0,01–0,2 мг/мл. Для одиночной ФТТ: те же концентрации + БИК 10 мин (2 Вт/см², 808 нм). Для комбинированной терапии: rGO@Fe₃O₄/DOX 0,01–0,2 мг/мл + БИК 10 мин (2 Вт/см², 808 нм). Далее инкубация 24 или 48 ч. После промывки ФБР инкубировали с 10 мкл CCK-8 в 100 мкл DMEM 40 мин. Жизнеспособность измеряли на фототометре при 450 нм. Все эксперименты в триplicates.

Результаты и обсуждение

Синтез и морфологическая характеристика

Получение rGO@Fe₃O₄ проходило в три этапа. Сначала методом распыления с шаблоном SiO₂ получали rGO-SiO₂. SEM и TEM показали (Рис. 1a), что rGO-SiO₂ — равномерные сферы ~3 мкм, состоящие из множества частиц SiO₂ (~300 нм). TEM и динамическое световое рассеяние подтвердили это (Рис. 1d, g). Затем удалением SiO₂ (нагрев 300 °C + HF) получали полый rGO. Наблюдались поры ~300 нм (Рис. 1b, e). Наконец, наночастицы Fe₃O₄ осаждали на пористый rGO методом ко précipитации. SEM и TEM показывают резкое уменьшение размера пор после загрузки Fe₃O₄ (Рис. 1c, f), что обеспечивает возможность доставки лекарства и контролируемое освобождение. Размеры частиц и гидродинамические размеры rGO-SiO₂, rGO, rGO@Fe₃O₄ практически не менялись (Рис. 1g, h, i).

Структурная и составная характеристика

SEM с EDS использовали для подтверждения структуры и состава. EDS-карты (Рис. 2a, b) показывают широкое распределение Fe и O в rGO@Fe₃O₄ с высокой плотностью загрузки. Рис. 2d подтверждает равномерное рассеяние наночастиц Fe₃O₄ (~18 нм) в rGO, что приводит к резкому уменьшению размера пор. SAED (Рис. 2e) верифицирует наличие Fe₃O₄: интерплоскостные расстояния 2,98; 2,53; 2,09; 1,62; 1,49 нм соответствуют плоскостям 220, 311, 400, 511, 440 кубической гранецентрированной фазы Fe₃O₄. XRD (Рис. 2c) показывает те же пики, согласуясь с SAED. Однако XRD не отличает Fe₃O₄ и γ-Fe₂O₃ из-за совпадения пиков [35]. XPS (Рис. 2g, h) показывает пики Fe2p₁/₂ (725,9/724,5 эВ) и Fe2p₃/₂ (714,1/711,0 эВ), указывающие на сосуществование Fe³⁺ и Fe²⁺ в Fe₃O₄ [36]. TGA (Рис. 2f) в воздухе до 800 °C показывает две области потери массы: обезвоживание (40–300 °C) и девольатилизация (300–800 °C) rGO; углеродное содержание — 25,6 масс.%.

Магнитные свойства изучали SQUID (±20 000 Э, 300 К). Насыщение Fe₃O₄: Ms = 66,6 эму/г, Hc = 9,3 Э. Для rGO@Fe₃O₄: Ms = 33,9 эму/г, Hc = 7,44 Э. Снижение намагниченности обусловлено диамагнитными свойствами rGO. Магнитная сепарация: суспензии Fe₃O₄ и rGO@Fe₃O₄ в флаконе с магнитом 2 мин концентрируются у стенки, раствор становится прозрачным. При удалении магнита rGO@Fe₃O₄ снова равномерно диспергируются при легком встряхивании, подтверждая хорошую водорастворимость и магнитный отклик — важно для таргетированной доставки.

Анализ фототермического эффекта

Учитывая глубокое проникновение БИК и малый ущерб окружающим тканям, БИК-ФТТ часто применяют для лечения опухолей. Изучали фототермическое поведение водных растворов rGO@Fe₃O₄ при разных концентрациях и мощностях под БИК-лазером (808 нм, 5 мин). Рис. 3a, b: рост температуры сильно зависит от концентрации и плотности мощности. При 1 мг/мл температура выросла с 27,9 до 70,3 °C (PBS: 31,7→36,2 °C). Высокая фототермическая эффективность rGO@Fe₃O₄ перспективна для ФТТ, так как при 50 °C 4–6 мин происходят дентурация белков и повреждение ДНК [21, 37]. ИК-термография (Рис. 3c) наглядно подтверждает быстрый нагрев до 70,3 °C за 5 мин (вода — без изменений). Фототермическая стабильность проверяли 6 циклами лазер вкл/выкл (808 нм, 2 Вт/см²) — идентичный рост температуры (Рис. 3d), что подтверждает отличную стабильность. Таким образом, rGO@Fe₃O₄ — перспективный фототермический агент для онкологии.

Загрузка и освобождение препарата

Удельную площадь и пористость rGO@Fe₃O₄ определили BET и BJH (Рис. 4a, b). Изотерма N₂ типа IV, площадь 120,7 м²/г, пористый объем 1,012 см³/г, поры 2–8 нм (мезопористые каналы) — отлично подходят для загрузки антиопухолевых препаратов. Пористые rGO@Fe₃O₄ загружали DOX простым смешиванием и ультразвуком. ATR-FTIR подтвердил стабильную инкорпорацию DOX: характерные пики –COOH и бензильного цикла DOX при 1726 и 1618 см⁻¹ (Рис. 4c). SEM показал равномерное распределение азота (от DOX) после загрузки (Рис. 4d, e). LE = 92,15%, LC = 18,43% — значительно выше многих носителей благодаря огромной площади и пористости [19]. Высокая LE обусловлена: (1) π-π-стакированием между sp²-группами rGO@Fe₃O₄ и хиноновым фрагментом DOX [21]; (2) водородными связями между –COOH/–OH rGO@Fe₃O₄ и –NH₂/–OH DOX.

Освобождение DOX в ФБР pH 7,4; 6,5; 5,4 (мимикруя внеклеточную среду нормальных и опухолевых тканей) показало pH-зависимость: при pH 5,4 накопленное освобождение ~73% за 98 ч (Рис. 4f). Ускорение в кислой среде связано с протонированием гидроксильных и аминогрупп DOX, повышением растворимости и ослаблением водородных связей с графеном [38]. БИК-стимулируемое освобождение (Рис. 4g) ускоряет высвобождение до 85%. Такое двойное pH/БИК-реагирующее поведение критично для эффективной доставки в опухоль.

In vitro поглощение клетками

Магнитное таргетирование Fe₃O₄ в rGO@Fe₃O₄ проверяли конфокальной микроскопией (CLSM) с/без магнитного поля. HeLa инкубировали с rGO@Fe₃O₄/DOX 4 ч, ядра окрасили DAPI. Рис. 5: с магнитом наблюдаются черные точки (rGO@Fe₃O₄) и яркая красная флуоресценция DOX внутри клеток. Без магнита — меньше черных точек и слабее флуоресценция. Это подтверждает, что магнитное поле стимулирует интернализацию микросфер. Fe₃O₄ в rGO@Fe₃O₄/DOX эффективно таргетирует клетки HeLa, значительно повышая клеточное поглощение — благоприятное свойство для онкологии.

In vitro цитотоксичность

Биосовместимость rGO@Fe₃O₄ оценивали CCK-8 на HeLa. Рис. 6a: после 24 и 48 ч инкубации при концентрациях до 200 мкг/мл живучесть >90% — высокая биосовместимость, подходит для СДЛ. Фототоксичность rGO@Fe₃O₄ под БИК (808 нм, 10 мин) доза-зависима (Рис. 6b): живучесть снижается с 90,37% до 35,52% (24 ч) и с 93,77% до 31,75% (48 ч) — отличная фототоксичность для ФТТ.

Синергетический эффект фототермио-химиотерапии (Рис. 6c, d): rGO@Fe₃O₄/DOX без БИК убивает ~65% клеток за 24 ч (DOX свободный — ~80%), снижение эффективности из-за задержки освобождения DOX. С БИК (808 нм, 10 мин) rGO@Fe₃O₄/DOX убивает >86% при эквивалентной дозе DOX (30 мкг/мл). Через 48 ч: DOX — 80%, rGO@Fe₃O₄/DOX — 76%, rGO@Fe₃O₄/DOX + БИК — 90% гибели клеток, подтверждая синергизм.

Заключение

Предложена простая стратегия создания платформы СДЛ rGO@Fe₃O₄/DOX для синергетической фототермио-химиотерапии. rGO@Fe₃O₄/DOX демонстрирует отличный БИК-ФТТ эффект и идеальную фототермическую стабильность. Fe₃O₄ обеспечивает отличное таргетирование опухолевых клеток. DOX инкапсулируется с ультравысокой загрузочностью и pH-зависимым освобождением. Комбинация химио- и фототермической терапии дает усиленный антиопухолевой эффект. Эта многофункциональная платформа — перспективный кандидат для таргетированной комбинированной терапии рака.

Доступность данных и материалов

Данные и анализ доступны у корреспондирующих авторов по разумному запросу.

Аббревиатуры

СДЛ:

Система доставки лекарств (Drug delivery system)

БИК:

Ближний инфракрасный (Near-infrared)

ОГ:

Оксид графена (Graphene oxide)

DOX:

Доксорубицин (Doxorubicin)

DMEM:

Среда Дюльбекко (Dulbecco's minimum essential medium)

DAPI:

4′,6-диамидино-2-фенилиндол

CCK-8:

Набор для подсчета клеток-8 (Cell counting kit-8)

SEM:

Растровая электронная микроскопия (Scanning electron microscopy)

TEM:

Проходная электронная микроскопия (Transmission electron microscope)

XRD:

Рентгеновская дифракция (X-ray diffraction system)

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия (X-ray photoelectron spectroscopy)

FTIR:

Фурье-инфракрасная спектроскопия (Fourier transform infrared spectroscopy)

TGA:

Термогравиметрический анализ (Thermogravimetric analyzer)

LE:

Эффективность загрузки (Loading efficiency)

LC:

Загрузочная способность (Loading capacity)