Целевые NIR-отзывчивые PNIPAM-пирроль нанокомпозиты для синергестической хемо-фототермической терапии рака груди

Аннотация

Комбинированная терапия на основе многофункциональных нанокомпозитов рассматривается как перспективный подход для повышения эффективности лечения рака. В данной работе сообщается о целевых многофункциональных нанокомпозитах на основе поли(N-изопропилакриламида) (PNIPAM) для синергестической хемо-фототермической терапии к клеткам рака груди. Для повышения температуры перехода в синтез PNIPAM добавляли акриловую кислоту (AAc), что изменило внутреннюю нижнюю критическую температуру растворимости (LCST) на 42 °C. Для генерации фототермического эффекта под облучением ближнего инфракрасного (NIR) лазера (808 нм), наночастицы полипиррола (ppy) равномерно декорировали в PNIPAM-AAc. Фолиевая кислота (FA), как лиганд для таргетирования рака, успешно конъюгировалась на избыточных карбоксильных группах в сети PNIPAM. Высвобождение лекарства из нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA эффективно запускалось в ответ на изменение температуры под облучением NIR-лазером. Мы также подтвердили, что PNIPAM-ppy-FA интернализация в клетки рака груди MDA-MB-231 происходит посредством фолиевого рецептора-опосредованной эндоцитозы и значительно повышает терапевтическую эффективность при комбинированном лечении хемо-фототермическими эффектами. Следовательно, наша работа поощряет дальнейшее исследование многофункциональных наноносителей для синергестических терапевтических подходов к разным типам раковых клеток.

Введение

Система доставки лекарств (SDL) — один из мощных методов введения фармацевтического соединения для достижения терапевтического эффекта в лечении рака. Хотя цель SDL — доставить активное лекарство и аккумулировать в желаемой области, традиционная SDL часто сопровождается тяжелыми побочными эффектами и неэффективной терапевтической эффективностью. Для преодоления этих препятств разработано множество наноносов, способных реагировать на специфические внутренние или внешние стимулы, включая температуру, свет, pH, электрическое поле, оксидо-восстановление, ферментативную активность и антигенную концентрацию, для передовых SDL и используемых для индуцирования устойчивого и контролируемого высвобождения лекарства.

Один из различных стимулов, термо-отзывчивый нанонос — мощный подход для улучшения лечения рака, потому что лекарства в наночастицы могут высвобождаться при определенной температуре. Кроме того, преимущество термочувствительных наночастиц может быть объединено с другими стимулами для индуцирования полной эрадикации рака. Как термо-отзывчивая наночастица, поли(N-изопропилакриламид) (PNIPAM) привлекло наибольшее внимание, потому что оно демонстрирует фазовый переход при нижней критической температуре растворимости (LCST) около 32 °C. Ниже LCST вся полимерная сеть в PNIPAM существует в набухшем состоянии из-за водородных связей. С другой стороны, PNIPAM переходит в гидрофобное состояние и водородные связи уменьшаются, что приводит к коллапсу полимерной сети выше LCST. По сравнению с другими наночастицами, PNIPAM-основанный нанонос имеет преимущество высокой эффективности инкапсуляции лекарства, контролируемой способности высвобождения лекарства и хорошей биосовместимости. Однако из-за спонтанного высвобождения лекарства при температуре тела, PNIPAM-основанный нанонос недостаточен для использования в передовых SDL. Для преодоления этого предыдущие исследования добавляли органические кислоты (например, виниловый уксусный, акриловой и аллиловый уксусный кислоты) в синтез PNIPAM, что приводило к снижению побочных эффектов за счет непрерывного высвобождения лекарства.

Недавно ряд исследований сосредоточились на новых терапевтических подходах, интегрирующих два или более стимуло-отзывчивых наночастиц для усиления терапевтической эффективности при раке. Например, фототермическая терапия (ФТТ) демонстрирует несколько преимуществ, таких как точное световое управление над опухолями, неинвазивное проникновение и низкая токсичность к нормальным клеткам. Для объединения наночастиц с ФТТ, фототермические агенты (например, золотые нанороды, углеродные нанотрубки, полипиррол (ppy) и оксид графена) должны быть равномерно инкапсулированы в PNIPAM-основанные наночастицы. Предыдущее исследование изготовило мезопористый силика-покрытый золотые нанороды с термо- и pH-отзывчивой оболочкой PNIPAM и далее исследовал in vivo применения в терапии рака. Однако эти PNIPAM-основанные нанокомпозиты требуют многоступенчатого синтетического процесса. Кроме того, поскольку нанокомпозиты не имели таргетирующего моети против специфических раковых клеток, это могло вызывать серьезные побочные эффекты на другие органы или нормальные ткани. В нашем предыдущем отчете мы разработали систему двунаправленного контролируемого высвобождения, используя термо- и pH-чувствительные свойства PNIPAM. PNIPAM наногели кополимеризировали с содержанием акриловой кислоты (AAc) для эффективного контроля LCST. Для лучшего усиления таргетирования рака и терапевтической эффективности мы разработали комбинированную терапию таргетирования рака с использованием хемо- и фототермического эффектов (Схема 1). По мере повышения температуры облучением NIR-лазером, лекарства из термо-отзывчивых PNIPAM нанокомпозитов высвобождались и фототермический эффект последовательно активировался. Благодаря конъюгированной фолиевой кислоте (FA), PNIPAM-основанные нанокомпозиты демонстрировали значительно усиленную терапевтическую эффективность к клеткам рака груди MDA-MB-231.

Материалы и методы

Материалы

NIPAM, N,N'-метиленбисакриламид (MBA), персульфат калия (KPS, 99%), N-(3-диметиламинпропиль)-N'-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDC) и N-гидроксисукцинамид (NHS) приобретены у Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, США). Поливинилпирролидон (PVP) и пиррол (98%) получены от Alfa Aesar (Ward Hill, MA, США). AAc приобретен у Dae Jung Chemicals & Materials. Co. Ltd (Корея). FA-PEG-амин (FA-PEG-NH₂, МВ: 5 кДа) предоставлен Nanocs, Inc. (New York, NY, США). Гидрохлорид доксорубицина (Dox) получен от Tokyo Chemical Industry. Co. Ltd (Токио, Япония). Все химикаты и материалы использовались коммерчески без дополнительной очистки.

Синтез ppy-декорированных PNIPAM-AAc наночастиц

Термо-отзывчивые PNIPAM кополимеризированные с AAc наночастицы синтезировались по предыдущему отчету. 1,13 г мономера NIPAM, 0,077 г MBA и 0,136 г AAc растворяли в 100 мл деионизированной воды и добавляли в 250-мм трехшейный круглоедновое колбу. Через 30 мин температуру реакции повышали до 80 °C и интенсивно перемешивали 1 ч. Для индукции полимеризации KPS (1,5 мг) добавляли в смесь, затем перемешивали 4 ч. Смесь диализировали против диалитической мембраны с молекулярным отсечением (MWCO) 12–14 кДа в деионизированной воде в течение 7 дней для удаления нереагировавших мономера, инициатора, диспенсабельных ионов и PNIPAM-AAc наночастица получали лйофилизацией в течение 48 ч. Для функционализации фототермического эффекта, ppy декорировали в PNIPAM-AAc наночастицы. PVP (50 и 100 мг) и мономер пиррола (50 и 100 мкл) быстро добавляли в 10 мг/мл раствор PNIPAM-AAc и перемешивали 12 ч при комнатной температуре. Затем KPS (3,4 мг) вставляли в раствор PNIPAM-AAc и дополнительно перемешивали 14 ч. ppy-декорированные PNIPAM-AAc центрифугировали три раза с дистиллированной водой. PNIPAM-ppy-5 и PNIPAM-ppy-10 получали лйофилизацией в течение 48 ч.

Синтез раковых таргетированных PNIPAM-ppy нанокомпозитов

Для получения раковых таргетированных PNIPAM-ppy нанокомпозитов (PNIPAM-ppy-FA), 10 мг PNIPAM-ppy растворяли в фосфатно-буферном растворе (PBS, 10 мл, pH 5,5) и ультразвуково обрабатывали 5 мин. EDC (15 мг, 0,078 ммоль) и NHS (15 мг, 0,13 ммоль) добавляли в раствор PNIPAM-ppy. Через 1 ч FA-PEG-NH₂ (5 мг) добавляли и дополнительно перемешивали на ночь. Нереагировавшие FA-PEG-NH₂, EDC и NHS в растворе PNIPAM-ppy удаляли диалитической мембраной (MWCO 6–8 кДа) и PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты лйофилизировали 48 ч.

Синтез противораковых лекарств-загруженных PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов

10 мг PNIPAM-ppy-FA растворяли в деионизированной воде и ультразвуково обрабатывали 5 мин. 0,5 мг/мл Dox добавляли каплями в раствор PNIPAM-ppy-FA, интенсивно перемешивая при комнатной температуре. Незагруженный Dox удаляли центрифугированием (14 000 об/мин, 10 мин) и очищали деионизированной водой. Dox-загруженные PNIPAM-ppy-FA (Dox@PNIPAM-ppy-FA) получали лйофилизацией 48 ч.

Характеристика NIR и термо-отзывчивых PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов

Передаточная электронная микроскопия (TEM, JEOL-2100F, JEOL, Япония) использовалась для характеристики размера, морфологии и распределения PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов. Для TEM измерений образцы готовили путем размещения капли раствора образца в деионизированной воде (концентрация: 1 г/л) на 200-ячейчатой медной сетке, покрытой углеродом. Распределение размера и поверхностный заряд PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов, растворенных в деионизированной воде и ультразвуково обработанных 5 мин, измеряли с использованием Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, UK). Поверхностная модификация и химическая связь PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов подтверждали Фурье-преобразованием инфракрасной спектроскопии (FT-IR). FT-IR спектры записывали на KBr таблетках с использованием прибора Nicolet iS50 (Thermo Fisher Scientific, Inc., США) в диапазоне 400–4000 см⁻¹ при разрешении 4 см⁻¹. Оптические свойства и способность загрузки Dox в PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитах наблюдали UV-Vis спектроскопией (UV 1800, Shimazu, Япония).

Фототермическое свойство и фотостабильность NIR и термо-отзывчивых PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов

Фототермическое свойство Dox-загруженных PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов (Dox@PNIPAM-ppy-FA) оценивали путем детектирования изменений температуры в реальном времени. Dox@PNIPAM-ppy-FA растворяли в водном растворе с разными концентрациями 0,05, 0,1 и 0,2 мг/мл и облучали 20 мин с использованием 808 нм NIR лазера (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., Китай) при плотности мощности 2 Вт/см². Влияние плотности мощности NIR лазера изучали облучением NIR лазера 20 мин с плотностью мощности 1, 2 и 3 Вт/см² соответственно. Кроме того, для исследования фототермической стабильности против NIR лазера, раствор Dox@PNIPAM-ppy-FA (0,1 мг/мл) облучали 15 мин и следовал естественный процесс охлаждения пять раз. Во время облучения NIR лазером температуру раствора Dox@PNIPAM-ppy-FA измеряли термопарой, подключенной к цифровому термометру (DTM-318, Tecpel Co., Тайвань) каждые 60 с в течение 15 мин.

NIR и термо-отзывчивое высвобождение лекарства из PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов

Для изучения профилей высвобождения Dox термо-отзывом, растворы Dox@PNIPAM-ppy-FA (1 мг/мл) готовили в 5 мл флаконах и затем перемешивали при 25, 37 и 50 °C. В определенное время высвобождения (0–72 ч), надстоянку каждого образца собирали центрифугированием и заменяли равным объемом свежей среды. Количество Dox, высвобожденного из PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов, оценивали измерением UV-Vis спектроскопии при 480 нм. Кроме того, поведение высвобождения Dox через NIR лазер-стимулируемый отклик раствора Dox@PNIPAM-ppy-FA (1 мг/мл) интенсивно перемешивали при 37 °C и облучали 10 мин в предопределенные временные точки (1, 2, 3, 4 и 5 ч). В качестве контроля использовали раствор Dox@PNIPAM-ppy-FA без облучения NIR лазером. Высвобожденный Dox определяли упомянутым методом.

Цитотоксичность анализа PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов

Цитотоксичность PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов, включая PNIPAM-ppy-FA и Dox@PNIPAM-ppy-FA, проверяли с использованием MTT-теста. A549 и MDA-MB-231 клетки посевали в 96-колодчатых пластинках при плотности 1 × 10⁴ клеток на колодку в 200 мкл среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин, и инкубировали при 37 °C под увлажненной атмосферой с 5% CO₂. Через 1 день, 200 мкл PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов с различными концентрациями (20–100 мкл) обрабатывали каждую клетку и пластинку инкубировали 24 ч. Клетки промывали DPBS и среду затем заменяли свежей средой с MTT-агентом (0,5 мг/мл). После еще 4 ч инкубации, среду тщательно удаляли и 200 мкл DMSO добавляли в каждую колодку для растворения интернализированных фиолетовых формазановых кристаллов. Абсорбцию измеряли при 595 нм с использованием iMark™ микропластинчатого считывателя (Bio-rad, Hercules, CA, США).

Клеточное поглощение анализа PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов

Для оценки таргетирующей способности к специфическим раковым клеткам PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов, A549 и MDA-MB-231 клетки посевали в 8-колодчатой пластинке (ibidi, Мюнхен, Германия) при плотности 2 × 10⁴ клеток/мл и инкубировали 24 ч. Клетки затем инкубировали с PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитами (60 мкг/мл) 6 ч. Последующе, клетки промывали дважды DPBS для удаления оставшихся нанокомпозитов и фиксировали 4% параформальдегидом 15 мин. После обработки 0,1% Тритон-X 15 мин при комнатной температуре, клетки наконец окрашивали Alexa Fluor 488 фаллоидином (1:200, Invitrogen, США) 1 день при 4 °C и 4,6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI, Thermo Fisher Scientific, США) 10 мин соответственно. Клеточные поглощения изображения наблюдавали с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Германия).

Усиленные противораковые эффекты PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов через NIR лазер облучение

Усиленная терапевтическая эффективность с использованием NIR и термо-отзывчивых PNIPA-ppy-FA на клетках рака груди исследовали MTT-тестом. MDA-MB-231 (1 × 10⁴ клеток/мл) посевали на 96-колодчатых пластинках и инкубировали 24 ч. Клетки затем промывали DPBS и PNIPAM-ppy-FA и Dox@PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты при различных концентрациях (20, 40, 60, 80 и 100 мкг/мл) добавляли в каждую колодку концентрационно-зависимым образом. После инкубации на ночь, среду удаляли, затем добавляли свежую среду. Для групп облучения NIR лазером, клетки обрабатывали 5 Вт/см² в течение 5 мин. Затем MDA-MB-231 промывали DPBS и свежую среду с MTT раствором добавляли. После 4 ч, среду тщательно удаляли и 200 мкл DMSO добавляли в каждую колодку. Наконец, абсорбция при 595 нм измерялась микропластинчатым считывателем iMark™ для определения жизнеспособности клеток. Как другой метод для наблюдения терапевтических эффектов рака, живой/мертвый тест проводили. PNIPAM-ppy-FA и Dox@PNIPAM-ppy-FA (60 мкг/мл) обрабатывали в MDA-MB-231. Через 24 ч, MDA-MB-231 облучали с или без NIR лазер облучения (5 Вт/см², 5 мин) и окрашивали кальцеином AM и этидиумом гомодимером-1. Через 30 мин, клетки промывали несколько раз DPBS. Живые/мертвые изображения получали с использованием инвертированной флуоресцентной микроскопии (Olympus Ix73, Япония).

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика NIR и термо-отзывчивых раковых таргетированных PNIPAM-ppy нанокомпозитов

Для генерации термо-отзывчивых PNIPAM-основанных нанокомпозитов, PNIPAM-AAc наночастицы изготавливались методом радикальной полимеризации. Для контроля LCST через NIR лазер облучение, ppy покрывали полимеризационной реакцией в асинтезированных PNIAPM-AAc. Раковые таргетированные PNIPAM-ppy-FA синтезировали химической конъюгацией FA-PEG-NH₂ к карбоксильной группе в PNIPAM-AAc. Согласно TEM изображениям на рис. 1а, морфология, размер и дисперсия PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA наблюдались. Асинтезированные PNIPAM-AAc демонстрировали однородную форму со средним диаметром 274,32 ± 11,62 нм. После декорации ppy, PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA показывали похожие размеры 275,99 ± 11,41 и 285,77 ± 17,92 нм. Размер Dox-загруженных PNIPAM-ppy-FA слегка увеличивался от 285,77 ± 17,92 до 290,73 ± 12,28 нм, указывая на то, что противораковые лекарства загружались в PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты. Интересно, по сравнению с PNIPAM-AAc, присутствие ppy внутри PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов четко демонстрировалось маленькими черными точками. Кроме того, благодаря ПЭГ цепи, PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты хорошо диспергировались в водном растворе без агрегации. Средние гидродинамические диаметры PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox@PNIPAM-ppy-FA измеряли DLS анализом (Дополнительный файл 1: Рис. S1). Диаметры PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox@PNIPAM-ppy-FA составляли 432, 450,7, 468,6 и 486,7 нм соответственно. Из-за разных аналитических методов диаметр каждого нанокомпозита был больше, чем у TEM, но размер частиц и распределение PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов демонстрировали похожий тренд.

Для исследования влияния полимеризованного ppy в PNIPAM-AAc, значения LCST PNIPAM-AAc и Dox@PNIPAM-ppy-FA измеряли при разных температурах (рис. 1б). По сравнению с нашей предыдущей работой, LCST Dox@PNIPAM-ppy-FA был слегка снижен по сравнению с PNIPAM-AAc (42 °C). Эта разница могла быть вызвана уменьшением карбоксильных групп в PNIPAM-AAc из-за полимеризованного ppy и конъюгированного ракового таргетирующего лиганда. Затем мы отслеживали изменение размера частиц в зависимости от температуры на рис. 1в. Для этого диаметры PNIPAM-AAc и Dox@PNIPAM-ppy-FA измеряли в температурном диапазоне от 25 до 50 °C. По мере повышения температуры, PNIPAM-AAc уменьшался от 436 до 177 нм. Более того, размер Dox@PNIPAM-ppy-FA сильно снижался от 630 до 420 нм, указывая на то, что ppy-декорированные в PNIPAM нанокомпозиты не сильно влияли на применения контролируемых и термо-отзывчивых SDL.

Зета-потенциалы PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox@PNIPAM-ppy-FA демонстрировали изменение поверхности нанокомпозитов до и после модификации (рис. 2а). Зета-потенциал PNIPAM-AAc был −37,1 ± 1,61 мВ из-за карбоксильных групп в AAc. Значения PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA увеличивались до −29,6 ± 0,96 и −15,6 ± 0,26 мВ, указывая на то, что положительно заряженные полипиррол и FA-PEG-NH₂ успешно вводились в PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты. Из-за негативно заряженного Dox, зета-потенциал Dox@PNIPAM-ppy-FA менялся на более отрицательные заряды (−28,6 ± 0,23 мВ). Как показано на рис. 2б, успешный синтез PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA подтверждался FT-IR спектроскопией. Спектр PNIPAM-AAc показывал пики растяжения вибраций C-N и CH₂ между 1100 и 1200 см⁻¹ и пики C=O, N–H и COOH наблюдались при 1545, 1645 и 1750 см⁻¹, которые принадлежали PNIPAM-AAc. Полипиррол в PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA демонстрировал дополнительные пики при 935 и 1050 см⁻¹. В спектрах PNIPAM-ppy-FA новые вибрационные пики появлялись при 1107 и 2880 см⁻¹, которые приписывались C–O–C ПЭГ цепи. Этот результат указывал на успешную химическую конъюгацию FA-PEG-NH₂. Однако таргетирующий лиганд FA не детектировался FT-IR, потому что его структура была похожа на ПЭГ. Для подтверждения присутствия FA в PNIPAM нанокомпозитах, PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA выполняли UV-Vis спектроскопией (рис. 2в). В то время как спектры PNIPAM-AAc и PNIPAM-ppy (без FA) не показывали никаких пиков поглощения, PNIPAM-ppy-FA показывал дополнительный пик при 280 нм, который был отличительным для FA. Этот результат подтверждал, что молекулы FA были привиты на PNIPAM-основанных нанокомпозитах.

Фототермическое свойство PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов через NIR лазер облучение

Для использования PNIPAM-основанных нанокомпозитов в фототермической терапии, оптические свойства PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов изучали UV-Vis спектроскопией. Как показано на рис. 2в, PNIPAM-AAc не показывал никакого поглощения в NIR области (λ = 700–1000 нм). Однако спектры PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox@PNIPAM-ppy-FA очевидно показывали сильное поглощение в том же диапазоне из-за полимеризованных ppy наночастиц. Эти результаты поглощения демонстрировали, что PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты могли конвертировать NIR свет в тепло. Далее, мы оценивали фототермическое свойство PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов NIR лазер облучением (рис. 3). Для оптимизации фототермического эффекта, PNIPAM-FA (без пиррола), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy 50 мкл) и PNIPAM-ppy-10-FA (ppy 100 мкл) готовили при той же концентрации (0,1 мг/мл) и затем подвергали 808 нм NIR лазер облучению при плотности 2 Вт/см² в течение 20 мин (рис. 3а). Температура PNIPAM-ppy-10-FA повышалась на 14,5 °C, что было в 2 раза выше, чем у PNIPAM-ppy-5-FA. В качестве контроля, PNIPAM-FA без ppy облучали, но температура незначительно увеличивалась (2,4 °C). Поэтому мы выбрали PNIPAM-ppy-10-FA для исследования дополнительных фототермических экспериментов. Для наблюдения изменений температуры по концентрациям, NIR лазер облучал PNIPAM-ppy-FA при разных концентрациях (0,05, 0,1 и 0,2 мг/мл). На рис. 3б, в зависимости от концентрации, температура повышалась до 10, 14,5 и 18 °C соответственно. Кроме того, раствор PNIPAM-ppy-FA (0,1 мг/мл) облучали различными плотностями мощности лазера (1–3 Вт/см²) на рис. 3в. Как ожидалось, повышение температуры нанокомпозита сильно зависело от мощности лазера. Последующе, мы наблюдали фототермическую стабильность PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов на рис. 3г. Хотя NIR лазер облучение повторялось минимум 5 раз, температура стабильно повышалась до 33 °C, показывая, что PNIPAM-ppy-FA нанокомпозит был подходящим наноносом для фототермической терапии.

NIR и термический отзывчивое высвобождение лекарства из PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов

Для оценки профилей высвобождения лекарства через NIR и термо-отзыв, мы анализировали инкапсуляцию и высвобождение свойств Dox@PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов. Изначально мы измеряли UV-Vis поглощения спектров лекарства-загруженных PNIPAM-ppy-FA и сильный поглощения пик наблюдался около 480 нм (рис. 2в). Этот результат указывал на то, что Dox успешно загрузился в PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты. Эффективность загрузки Dox PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов рассчитывалась 15% используя калибровочную кривую Dox (данные не показаны). На рис. 4а, профиль высвобождения Dox из PNIPAM-ppy-FA изучали при разных температурах. Мы наблюдали поведение высвобождения Dox в течение 72 ч при 25 °C, 37 °C и 50 °C и кумулятивное высвобождение Dox из PNIPAM-ppy-FA составляло 15%, 42% и 67% соответственно. Поскольку LCST PNIPAM-ppy-FA слегка снизился до 42 °C, кумулятивное высвобождение при температуре тела было найдено относительно выше, чем при комнатной температуре. Большое количество Dox высвобождалось, однако высвобожденный Dox не влиял на терапевтическую эффективность, потому что Dox@PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты могли интернализация только в фолиевый-рецептор-позитивные клетки, как описано ранее. При температуре выше LCST (50 °C), количество Dox из PNIAPM-ppy-FA нанокомпозитов высвобождалось в четыре раза выше, чем при комнатной температуре, предполагая, что PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты могли использоваться в контролируемой системе высвобождения лекарства через термический отзыв. Кроме того, мы исследовали поведение высвобождения, запускаемого NIR светом, PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов на рис. 4б. Раствор Dox@PNIAPM-ppy-FA (1 мг/мл) подвергали NIR лазеру (3 Вт/см²) облучению 10 мин и эту операцию повторяли каждый 1 ч. В течение 6 ч, общее количество Dox через NIR лазер облучение достигало 35%, тогда как профиль высвобождения Dox без NIR лазер облучения показывал около 5% и 15% (25 °C и 37 °C). Этот результат показывал, что NIR лазер облучение приводило к более высокой температуре, чем LCST нанокомпозитов, и индуцировало высвобождение Dox из PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов.

Цитотоксичность и клеточное поглощение анализа PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов

Согласно литературе, цитотоксичность PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов исследовали к легочным и грудным раковым клеткам (Дополнительный файл 1: Рис. S2). Независимо от концентраций образца, после инкубации с PNIPAM-ppy-FA 24 ч, обе клетки жизнеспособности наблюдались (> 85%). Следовательно, наши PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты не показывали цитотоксичность как нанонос для применений доставки лекарств. Для исследования, мог ли PNIPAM-ppy-FA селективно доставлять к раковым клеткам, мы изучали флуоресцентные сигналы внутриклеточных PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Дополнительный файл 1: Рис. S3). Клеточное поглощение поведение PNIPAM-ppy-FA и Dox@PNIPAM-ppy-FA оценивали в фолиевый-рецептор-негативных (A549) и позитивных (MDA-MB-231) клеточных линиях. После инкубации MDA-MB-231 клеток рака груди с Dox@PNIPAM-ppy-FA, сильная красная флуоресценция наблюдалась, показывая, что Dox@PNIAPM-ppy-FA интернализация в лизосомы MDA-MB-231 клеток. В противовес, когда PNIPAM-ppy-FA и Dox@PNIPAM-ppy-FA обрабатывали с A549 клетками, Dox сигналы не наблюдались. Эти конфокальные изображения демонстрировали, что PNIAPM-ppy-FA нанокомпозиты могли селективно интернализация в фолиевый-рецептор-экспрессирующие раковые клетки через рецептор-опосредованный эндоцитоз путь, как описано ранее.

Хемо-фототермические противораковые эффекты NIR и термо-отзывчивых PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов

Для подтверждения in vitro комбинированной терапевтической эффективности PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов, PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты оценивали на клетках MDA-MB-231 с или без NIR лазер облучения и клетки жизнеспособности оценивали MTT-тестом на рис. 5а. Для фототермической терапии, клетки рака груди MDA-MB-231 с PNIPAM-ppy-FA инкубировали 12 ч и затем подвергали NIR лазеру (5 Вт/см², 5 мин). Клетки жизнеспособности MDA-MB-231 снижались до 70–90% в зависимости от концентраций PNIPAM-ppy-FA. Для подтверждения только хемотерапевтического эффекта, Dox-загруженные PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты обрабатывали. Мы наблюдали, что жизнеспособности уменьшались до 50% из-за высвобождения Dox из нанокомпозитов, соответствующего профилю высвобождения на рис. 4. Интересно, после NIR лазер облучения в клетках MDA-MB-231 с Dox@PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитами, клетки жизнеспособность драматически снижалась до 24%, что было выше, чем в контрольных группах (PNIPAM-ppy-FA с NIR лазер облучением, Dox@PNIPAM-ppy-FA без NIR лазер облучения). Этот результат указывал на оптимальный синергестический эффект NIR лазер облучения-опосредованной хемо-фототермической комбинированной терапии. Более того, для прямого наблюдения терапевтической эффективности в раковых клетках, живой/мертвый тест выполняли на рис. 5б. В качестве контрольной группы мы наблюдали жизнеспособность только MDA-MB-231 клеток с или без NIR лазер облучения (5 Вт/см², 5 мин) и большинство клеток показывали зеленую флуоресценцию (живые клетки). Это демонстрировало, что NIR лазер облучение не заметно влияло на клетки жизнеспособность. Кроме того, клетки MDA-MB-231 с PNIPAM-ppy-FA под NIR лазер облучением показывали несколько красной флуоресценции (мертвые клетки), указывая на фототермический терапевтический эффект от PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов. Несмотря на отсутствие NIR лазер облучения в клетках MDA-MB-231 с Dox@PNIPAM-ppy-FA, несколько спорадических красной флуоресценции наблюдались, указывая на химиотерапию. Более того, когда клетки MDA-MB-231 обрабатывали нанокомпозитами и NIR лазер облучением, большинство раковых клеток демонстрировали несколько красной флуоресценции. Эти результаты поддерживали синергестические терапевтические эффекты хемо-фототермической терапии через NIR лазер облучение и термо-отзывчивые Dox@PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты.

Заключение

Мы успешно построили раковые таргетированные NIR и термо-отзывчивые PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты для хемо-фототермической комбинированной терапии. Для индукции контролируемого высвобождения и фототермического эффекта через 808 нм NIR лазер облучение, ppy наночастицы равномерно декорировали на PNIPAM-AAc полимеризационным методом. Dox-загруженные PNIPAM-ppy-FA показывали значительный фототермический эффект и фотостабильность. Более того, Dox@PNIPAM-ppy-FA показывали благоприятные свойства термо-чувствительного перехода при разных условиях и высвобождение лекарства из PNIPAM-ppy-FA нанокомпозитов могло контролироваться NIR светом и термо-отзывом. In vitro исследования подтвердили, что PNIPAM-ppy-FA нанокомпозиты демонстрировали отличную биосовместимость и усиленную терапевтическую эффективность к клеткам рака груди. Эта усиленная противораковая эффективность через нанокомпозиты была обусловлена следующими причинами: (1) специфическое клеточное поглощение нанокомпозитов в фолиевый-рецептор-опосредованной эндоцитозе, (2) накопленное высвобождение Dox из PNIPAM-ppy-FA через NIR и термо-отзыв, и (3) синергестический терапевтический эффект хемо-фототермической комбинации. Следовательно, наш PNIPAM-ppy-FA нанокомпозит потенциально может использоваться как многофункциональный нанонос для синергестических терапевтических подходов к разным типам рака с уменьшением побочных эффектов.

Доступность данных и материалов

Данные и анализ в текущей работе доступны у соответствующих авторов по разумному запросу.

Аббревиатуры

PTT:

Фототермическая терапия

NIR:

Ближний инфракрасный

FA:

Фолиевая кислота

FA-PEG-NH₂:

FA-PEG амин

LCST:

Нижняя критическая температура растворимости

PNIPAM:

Поли(N-изопропилакриламид)

ppy:

Полипиррол

TEM:

Передаточная микроскопия

UV-Vis:

Ультрафиолетово-видимая спектроскопия