Термочувствительные поли (N-изопропилакриламид) -пиррольные нанокомпозиты для химиофотермической терапии рака, запускаемые в ближнем инфракрасном диапазоне.

Введение

Система доставки лекарств (DDS) - один из мощных методов введения фармацевтического соединения для достижения терапевтического эффекта в терапии рака [1]. Хотя цель DDS - доставлять активное лекарство и накапливаться в желаемой области, обычный DDS часто сопровождается серьезными побочными эффектами и неэффективной терапевтической эффективностью [2, 3]. Чтобы преодолеть эти препятствия, для продвинутых DDS и используется для стимулирования длительного и контролируемого высвобождения лекарств [4,5,6].

Один из различных стимулов, термочувствительный наноноситель, является мощным подходом к улучшению лечения рака, поскольку лекарства в наночастицах могут выделяться при определенной температуре [7]. Кроме того, преимущество термочувствительных наночастиц можно комбинировать с другими стимулами, чтобы вызвать полное искоренение рака [8, 9]. В качестве термочувствительной наночастицы поли ( N -изопропилакриламид) (ПНИПАМ) получил наибольшее внимание, потому что он демонстрирует фазовый переход при более низкой критической температуре раствора (НКТР) около 32 ° C [10, 11]. Ниже НКТР вся полимерная сеть в PNIPAM существует в набухшем состоянии из-за водородных связей. С другой стороны, PNIPAM переходит в гидрофобное состояние, и водородные связи восстанавливаются, что приводит к коллапсу полимерной сети выше НКТР [12, 13]. По сравнению с другими наночастицами, наноноситель на основе PNIPAM обладает преимуществом высокой эффективности инкапсуляции лекарств, контролируемой способности высвобождения лекарств и хорошей биосовместимости [14]. Однако из-за самопроизвольного высвобождения лекарства при температуре тела наноносителя на основе PNIPAM недостаточно для использования в продвинутом DDS. Чтобы преодолеть это, в предыдущих исследованиях в процесс синтеза PNIPAM добавлялись органические кислоты (например, винилуксусная, акриловая и аллилуксусная), что привело к снижению побочных эффектов за счет непрерывного высвобождения лекарства [15].

В последнее время ряд исследований был сосредоточен на новых терапевтических подходах, в которых интеграция двух или более стимулов запускала наночастицы для повышения терапевтической эффективности рака [16,17,18]. Например, фототермическая терапия (ФТТ) демонстрирует несколько преимуществ, таких как точный контроль света на опухолях, неинвазивное проникновение и низкая токсичность для нормальных клеток [19, 20]. Чтобы объединить наночастицы с PTT, фототермические агенты (например, золотые наностержни, углеродные нанотрубки, полипиррол (ppy) и оксид графена) должны быть равномерно инкапсулированы в наночастицы на основе PNIPAM [21,22,23]. В предыдущем исследовании были изготовлены покрытые мезопористым кремнеземом золотые наностержни с термо- и pH-чувствительной оболочкой PNIPAM, а также были изучены возможности применения терапии рака in vivo [24]. Однако эти нанокомпозиты на основе PNIPAM требуют многоступенчатого процесса синтеза. Кроме того, поскольку нанокомпозиты не имеют целевого компонента против конкретных раковых клеток, они могут вызывать серьезные побочные эффекты для других органов или нормальных тканей. В нашем предыдущем отчете мы разработали двунаправленную систему с контролируемым высвобождением, используя термочувствительные и pH-чувствительные свойства PNIPAM [15]. Наногели PNIPAM сополимеризовали с содержанием акриловой кислоты (AAc) для эффективного контроля НКТР. Чтобы улучшить нацеливание на рак и терапевтическую эффективность, мы разработали комбинированную терапию для нацеливания на рак с использованием химио- и фототермического эффекта (схема 1). При повышении температуры в результате облучения лазером NIR, лекарства из термочувствительных нанокомпозитов PNIPAM высвобождались, и впоследствии активировался фототермический эффект. Благодаря конъюгированной фолиевой кислоте (FA) нанокомпозиты на основе PNIPAM продемонстрировали значительно повышенную терапевтическую эффективность в отношении клеток рака груди MDA-MB-231.

Схематическое изображение а синтез нанокомпозитов Dox @ PNIPAM-ppy-FA и b в ближнем инфракрасном диапазоне света и термоуправляемых нанокомпозитов приложение для усиленной химиофотермической комбинированной терапии клеток рака груди

Материалы и методы

Материалы

НИПАМ, N, N ′ -Метиленбисакриламид (MBA), персульфат калия (KPS, 99%), N- (3-диметиламинопропил) - N '-Этилкарбодиимида гидрохлорид (EDC) и N -Гидроксисукцинимид (NHS) были приобретены у Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, США). Поливинилпирролидон (ПВП) и пиррол (98%) были получены от Alfa Aesar (Уорд Хилл, Массачусетс, США). AAc был приобретен у Dae Jung Chemicals &Materials. Co. Ltd (Корея). FA-PEG-амин (FA-PEG-NH ₂ , MW:5 кДа) предоставлен Nanocs, Inc. (Нью-Йорк, Нью-Йорк, США). Гидрохлорид доксорубицина (Dox) был получен от Tokyo Chemical Industry. Co. Ltd (Токио, Япония). Все химические вещества и материалы использовались в коммерческих целях без дополнительной очистки.

Синтез наночастиц PNIPAM-AAc, украшенных ppy

Термочувствительный PNIPAM, сополимеризованный с наночастицей AAc, был синтезирован согласно предыдущему сообщению [15]. 1,13 г мономера NIPAM, 0,077 г MBA и 0,136 г AAc растворяли в 100 мл деионизированной воды и добавляли в трехгорлую круглодонную колбу на 250 мл. Через 30 мин температуру реакции увеличивали до 80 ° C и интенсивно перемешивали в течение 1 часа. Чтобы вызвать полимеризацию, к смеси добавляли KPS (1,5 мг) с последующим перемешиванием в течение 4 часов. Смесь диализовали против диализной мембраны с отсечкой по молекулярной массе (MWCO) 12–14 кДа в деионизированной воде в течение 7 дней для удаления непрореагировавшего мономера, инициатора, замещаемых ионов и наночастиц PNIPAM-AAc, полученных лиофилизацией в течение 48 часов. Чтобы функционализировать фототермический эффект, ppy был декорирован в наночастицы PNIPAM-AAc [25]. PVP (50 и 100 мг) и мономер пиррола (50 и 100 мкл) быстро добавляли в 10 мг / мл раствора PNIPAM-AAc и перемешивали в течение 12 часов при комнатной температуре. Затем KPS (3,4 мг) вводили в раствор PNIPAM-AAc и дополнительно перемешивали в течение 14 часов. Декорированный ppy PNIPAM-AAc трижды центрифугировали с дистиллированной водой. PNIPAM-ppy-5 и PNIPAM-ppy-10 были получены лиофилизацией в течение 48 часов.

Синтез нанокомпозитов PNIPAM-ppy, нацеленных на рак

Для получения нанокомпозитов PNIPAM-ppy, нацеленных на рак (PNIPAM-ppy-FA), 10 мг PNIPAM-ppy растворяли в фосфатно-солевом буфере (PBS, 10 мл, pH 5,5) и обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин. EDC (15 мг, 0,078 ммоль) и NHS (15 мг, 0,13 ммоль) добавляли в раствор PNIPAM-ppy. Через 1 час FA-PEG-NH ₂ (5 мг) добавляли и дополнительно перемешивали в течение ночи. Непрореагировавший FA-PEG-NH ₂ , EDC и NHS в растворе PNIPAM-ppy удаляли диализной мембраной (MWCO 6–8 кДа), а нанокомпозиты PNIPAM-ppy-FA лиофилизировали в течение 48 часов.

Синтез нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA, содержащих противоопухолевые препараты

10 мг PNIPAM-ppy-FA растворяли в деионизированной воде и обрабатывали ультразвуком в течение 5 мин. 0,5 мг / мл Dox добавляли по каплям к раствору PNIPAM-ppy-FA, энергично перемешивая при комнатной температуре. Ненагруженный Dox удаляли центрифугированием (14000 об / мин, 10 мин) и очищали деионизированной водой. Загруженный Dox PNIPAM-ppy-FA (Dox @ PNIPAM-ppy-FA) получали лиофилизацией в течение 48 часов.

Характеристика NIR и термочувствительных нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA

Просвечивающая электронная микроскопия (ТЕМ, JEOL-2100F, JEOL, Япония) была использована для характеристики размера, морфологии и распределения нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA. Для измерения ПЭМ образцы готовили, помещая каплю раствора образца в деионизированной воде (концентрация:1 г / л) на медную сетку размером 200 меш, покрытую углеродом. Распределение по размерам и поверхностный заряд нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA, растворенных в деионизированной воде и обработанных ультразвуком в течение 5 мин, измеряли с помощью Zetasizer Nano Z (Malvern Instruments, UK). Модификация поверхности и химическое связывание нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA были подтверждены инфракрасной спектроскопией с преобразованием Фурье (FT-IR). ИК-Фурье-спектры записывали на таблетках KBr с использованием прибора Nicolet iS50 (Thermo Fisher Scientific, Inc., США) в диапазоне 400–4000 см ^-1 при разрешении 4 см ⁻¹ . Оптические свойства и загрузочная способность Dox в нанокомпозитах PNIPAM-ppy-FA наблюдались с помощью УФ-видимой спектроскопии (UV 1800, Shimazu, Япония).

Фототермические свойства и фотостабильность NIR и термочувствительных нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA

Фототермические свойства нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA, нагруженных Dox (Dox @ PNIPAM-ppy-FA), оценивали путем определения изменений температуры в реальном времени. Dox @ PNIPAM-ppy-FA растворяли в водном растворе с различными концентрациями 0,05, 0,1 и 0,2 мг / мл и облучали в течение 20 мин с использованием лазера ближнего инфракрасного диапазона с длиной волны 808 нм (MDL-N-808, CNI Optoelectronics Tech. Co. Ltd., Китай) при удельной мощности 2 Вт / см ² . Влияние плотности мощности лазера в ближнем инфракрасном диапазоне изучалось путем облучения лазером ближнего инфракрасного диапазона в течение 20 мин с плотностью мощности 1, 2 и 3 Вт / см ² . , соответственно. Кроме того, для исследования фототермической стабильности против лазера NIR, раствор Dox @ PNIPAM-ppy-FA (0,1 мг / мл) подвергали воздействию в течение 15 минут и после процесса естественного охлаждения пять раз. Во время облучения лазером NIR температура раствора Dox @ PNIPAM-ppy-FA измерялась термопарой, подключенной к цифровому термометру (DTM-318, Tecpel Co., Тайвань) каждые 60 с в течение 15 мин.

NIR и высвобождение термочувствительного лекарственного средства нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA

Для изучения профилей высвобождения Dox путем термоотклика растворы Dox @ PNIPAM-ppy-FA (1 мг / мл) были приготовлены во флаконе объемом 5 мл и затем перемешаны при 25, 37 и 50 ° C. По истечении определенного времени высвобождения (0–72 ч) супернатант каждого образца собирали центрифугированием и заменяли равным объемом свежей среды. Количество Dox, высвобождаемого из нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA, оценивали путем измерения УФ-видимой спектроскопии при 480 нм. Кроме того, поведение высвобождения Dox с помощью NIR-лазера, отвечающего на стимулы, раствор Dox @ PNIPAM-ppy-FA (1 мг / мл) интенсивно перемешивали при 37 ° C и облучали в течение 10 минут в заранее определенные моменты времени (1, 2, 3 , 4 и 5 ч). В качестве контроля использовали раствор Dox @ PNIPAM-ppy-FA без облучения лазером NIR. Выпущенный Dox определялся вышеупомянутым методом.

Анализ цитотоксичности нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA

Цитотоксичность нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA, включая PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA, была подтверждена с помощью анализа МТТ. Клетки A549 и MDA-MB-231 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 1 × 10 ⁴ . клеток на лунку в 200 мкл среды RPMI 1640, содержащей 10% FBS и 1% пенициллин-стрептомицин, и инкубировали при 37 ° C в увлажненной атмосфере с 5% CO ₂ . Через 1 день каждую клетку обрабатывали 200 мкл нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA с различными концентрациями (20–100 мкл) и инкубировали планшет в течение 24 часов. Клетки промывали DPBS, а затем среду заменяли свежей средой с агентом МТТ (0,5 мг / мл). После еще одной инкубации в течение 4 ч среду осторожно удаляли и в каждую лунку добавляли 200 мкл ДМСО для растворения интернализованных пурпурных кристаллов формазана. Поглощение измеряли при 595 нм с помощью ридера для микропланшетов iMark ™ (Bio-rad, Hercules, CA, USA).

Анализ клеточного поглощения нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA

Для оценки способности нацеливания на специфические раковые клетки нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA клетки A549 и MDA-MB-231 высевали в 8-луночный планшет (там же, Мюнхен, Германия) при плотности 2 × 10 ⁴ клеток / мл и инкубировали в течение 24 ч. Затем клетки инкубировали с нанокомпозитами PNIPAM-ppy-FA (60 мкг / мл) в течение 6 часов. Затем клетки дважды промывали DPBS для удаления оставшихся нанокомпозитов и фиксировали 4% параформальдегидом в течение 15 мин. После обработки 0,1% Triton-X в течение 15 минут при комнатной температуре клетки окончательно окрашивали фаллоидином Alexa Fluor 488 (1:200, Invitrogen, США) в течение 1 дня при 4 ° C и 4,6-диамидино-2- фенилиндол (DAPI, Thermo Fisher Scientific, США) в течение 10 мин соответственно. Изображения клеточного поглощения наблюдались с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM, LSM 710, Carl Zeiss, Германия).

Повышенное противораковое действие нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA с помощью лазерного излучения в ближней инфракрасной области

Повышенная терапевтическая эффективность использования NIR и термочувствительного PNIPA-ppy-FA на клетках рака молочной железы была исследована с помощью анализа MTT. MDA-MB-231 (1 × 10 ⁴ клеток / мл) высевали на 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 24 часов. Затем клетки промывали DPBS и нанокомпозитами PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA в различных концентрациях (20, 40, 60, 80 и 100 мкг / мл) добавляли в каждую лунку в зависимости от концентрации. . После инкубации в течение ночи среду удаляли с последующим добавлением свежей среды. Для групп облучения лазером NIR клетки обрабатывали 5 Вт / см ² на 5 мин. Затем MDA-MB-231 промывали DPBS и добавляли свежую среду, включающую раствор МТТ. Через 4 ч среду осторожно удаляли и в каждую лунку добавляли 200 мкл ДМСО. Наконец, оптическую плотность при 595 нм измеряли с помощью ридера для микропланшетов iMark ™, чтобы определить жизнеспособность клеток. В качестве еще одного метода наблюдения терапевтических эффектов рака был проведен анализ живых и мертвых животных. PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA (60 мкг / мл) были преобразованы в MDA-MB-231. Через 24 часа MDA-MB-231 подвергались облучению лазером NIR или без него (5 Вт / см ² , 5 мин) и окрашивали кальцеином AM и гомодимером этидия-1. Через 30 мин клетки несколько раз промывали DPBS. Живые / мертвые изображения были получены с помощью инвертированной флуоресцентной микроскопии (Olympus Ix73, Япония).

Результаты и обсуждение

Синтез и характеристика нанокомпозитов PNIPAM-ppy, нацеленных на БИК и термореактивный рак

Для создания термочувствительных нанокомпозитов на основе PNIPAM наночастицы PNIPAM-AAc были изготовлены методом радикальной полимеризации [15]. Чтобы контролировать НКТР с помощью облучения лазером в ближнем инфракрасном диапазоне, ppy покрывали реакцией полимеризации в свежеприготовленном PNIAPM-AAc. Нацеленный на рак PNIPAM-ppy-FA был синтезирован путем химического конъюгирования FA-PEG-NH ₂ к карбоксильной группе в PNIPAM-AAc. Согласно изображениям ПЭМ на рис. 1а наблюдались морфология, размер и дисперсность PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA. Приготовленный PNIPAM-AAc имел гомогенную форму со средним диаметром 274,32 ± 11,62 нм. После декорирования ppy PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA показали аналогичные размеры с 275,99 ± 11,41 и 285,77 ± 17,92 нм. Размер загруженного Dox PNIPAM-ppy-FA немного увеличился с 285,77 ± 17,92 до 290,73 ± 12,28 нм, что указывает на то, что противораковые препараты были загружены в нанокомпозиты PNIPAM-ppy-FA [26]. Интересно, что по сравнению с PNIPAM-AAc присутствие ppy в нанокомпозитах PNIPAM-ppy-FA четко проявлялось небольшими черными пятнами. Кроме того, благодаря цепи ПЭГ нанокомпозиты ПНИПАМ-ppy-FA хорошо диспергировались в водном растворе без агрегации [27]. Средние гидродинамические диаметры PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA были измерены с помощью анализа DLS (дополнительный файл 1:рис. S1). Диаметры PNIPAM-AAc, PNIPAM -ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA составляли 432, 450,7, 468,6 и 486,7 нм соответственно. Из-за различных аналитических методов диаметр каждого нанокомпозита был больше, чем у ПЭМ, но размер и распределение частиц нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA демонстрировали аналогичную тенденцию.

а ПЭМ-изображения нанокомпозитов PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA. б Анализ LCST Dox @ PNIPAM-ppy-FA с помощью DLS. c Средние диаметры PNIPAM-AAc и Dox @ PNIPAM-ppy-FA в зависимости от различных температурных условий (при 25 ° C, 37,5 ° C и 50 ° C)

Чтобы исследовать влияние полимеризованного ppy на PNIPAM-AAc, значения LCST для PNIPAM-AAc и Dox @ PNIPAM-ppy-FA были измерены при различных температурах (рис. 1b). По сравнению с нашей предыдущей работой [15], НКТР Dox @ PNIPAM-ppy-FA была немного ниже, чем у PNIPAM-AAc (42 ° C). Это различие могло быть вызвано восстановлением карбоксильных групп в PNIPAM-AAc из-за полимеризованного ppy и конъюгированного лиганда, направленного на рак [28]. Впоследствии мы отслеживали изменение размера частиц в зависимости от температуры на рис. 1c. Для этого были измерены диаметры PNIPAM-AAc и Dox @ PNIPAM-ppy-FA в диапазоне температур от 25 до 50 ° C. При повышении температуры PNIPAM-AAc уменьшалась с 436 до 177 нм. Более того, размер Dox @ PNIPAM-ppy-FA был значительно уменьшен с 630 до 420 нм, что указывает на то, что ppy-декорирование в нанокомпозитах PNIPAM не оказывает большого влияния на применение контролируемых и термочувствительных DDS [27].

Значения дзета-потенциала PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA отображают изменение поверхности нанокомпозитов до и после модификации (рис. 2а). Дзета-потенциал PNIPAM-AAc составлял -37,1 ± 1,61 мВ из-за карбоксильных групп в AAc [29]. Значения PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA увеличились до - 29,6 ± 0,96 и - 15,6 ± 0,26 мВ, что указывает на то, что положительно заряженный полипиррол и FA-PEG-NH ₂ были успешно внедрены в нанокомпозиты ПНИПАМ-ппи-ФА [27]. Из-за отрицательно заряженного Dox дзета-потенциал Dox @ PNIPAM-ppy-FA изменился на более отрицательные заряды (-28,6 ± 0,23 мВ). Как показано на фиг. 2b, успешный синтез PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA был подтвержден с помощью ИК-Фурье спектроскопии. Спектр PNIPAM-AAc показал пики валентных колебаний C-N и CH ₂ от 1100 до 1200 см ⁻¹ а пики C =O, N – H и COOH наблюдались при 1545, 1645 и 1750 см ^-1 , который принадлежал PNIPAM-AAc [15]. Полипиррол в PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA продемонстрировал дополнительные пики при 935 и 1050 см ^-1 наблюдались [30]. В спектрах PNIPAM-ppy-FA появились новые пики колебаний при 1107 и 2880 см ⁻¹ . , которые приписываются C – O – C цепи ПЭГ. Этот результат свидетельствует об успешном химическом конъюгации FA-PEG-NH ₂ [31]. Однако целевой лиганд FA не был обнаружен с помощью FT-IR, поскольку его структура была подобна PEG. Чтобы подтвердить присутствие ЖК в нанокомпозитах ПНИПАМ, ПНИПАМ-AAc, ПНИПАМ-ppy и ПНИПАМ-ppy-FA были выполнены с помощью УФ-видимой спектроскопии (рис. 2c). В то время как спектры PNIPAM-AAc и PNIPAM-ppy (без FA) не показали никакого пика поглощения, PNIPAM-ppy-FA показал дополнительный пик при 280 нм, который был характерен для FA [32]. Этот результат подтвердил, что молекулы ЖК были привиты на нанокомпозиты на основе ПНИПАМ.

а Анализ дзета-потенциала PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA. б ИК-Фурье спектры PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy и PNIPAM-ppy-FA. c УФ – видимые спектры PNIPAM-AAc, PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA

Фототермические свойства нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA при облучении лазером в ближней инфракрасной области

Чтобы использовать нанокомпозиты на основе PNIPAM для фототермической терапии, оптические свойства нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA были исследованы с помощью УФ-видимой спектроскопии. Как показано на рис. 2c, PNIPAM-AAc не показал никакого поглощения в ближней инфракрасной области (λ =700–1000 нм). Однако спектры PNIPAM-ppy, PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA, очевидно, показали сильное поглощение в том же диапазоне за счет полимеризованных наночастиц ppy. Эти результаты по поглощению продемонстрировали, что нанокомпозиты PNIPAM-ppy-FA могут преобразовывать БИК-свет в тепло [26]. Затем мы оценили фототермические свойства нанокомпозитов ПНИПАМ-ppy-FA с помощью облучения лазером в ближнем инфракрасном диапазоне (рис. 3). Для оптимизации фототермического эффекта были приготовлены PNIPAM-FA (без пиррола), PNIPAM-ppy-5-FA (ppy-5-FA (ppy 50 мкл) и PNIPAM-ppy-10-FA (ppy-10-FA (ppy 100 мкл)) в той же концентрации (0,1 мг / мл. ), а затем подверглись облучению лазером в ближнем инфракрасном диапазоне с длиной волны 808 нм при плотности 2 Вт / см ² в течение 20 мин (рис. 3а). Температура PNIPAM-ppy-10-FA повысилась до 14,5 ° C, что в 2 раза выше, чем у PNIPAM-ppy-5-FA. В качестве контроля облучали ПНИПАМ-ФА без ppy, но температура была незначительно повышена (2,4 ° C). Поэтому мы выбрали PNIPAM-ppy-10-FA для исследования дополнительных фототермических экспериментов. Чтобы наблюдать изменения температуры по концентрациям, NIR-лазер облучали PNIPAM-ppy-FA в различных концентрациях (0,05, 0,1 и 0,2 мг / мл). На рис. 3б в зависимости от концентрации температура повысилась до 10, 14,5 и 18 ° C соответственно. Кроме того, раствор PNIPAM-ppy-FA (0,1 мг / мл) облучали лазером различной плотности (1–3 Вт / см ² ) на рис. 3в. Как и ожидалось, повышение температуры нанокомпозита сильно зависело от мощности лазера. Впоследствии мы наблюдали фототермическую стабильность нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA на рис. 3d. Хотя облучение лазером NIR повторялось не менее 5 раз, температура постоянно повышалась до 33 ° C, показывая, что нанокомпозит PNIPAM-ppy-FA является подходящим наноносителем для фототермической терапии.

Фототермические характеристики нанокомпозитов ПНИПАМ-ппи-ФА. а Температурный анализ Dox @ PNIPAM-ppy-5-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-10-FA при облучении лазером NIR 808 нм (2 Вт / см ² ). б Температурный анализ различных концентраций Dox @ PNIPAM-ppy-FA при 808 нм NIR-облучении (2 Вт / см ² ). c Фототермический эффект Dox @ PNIPAM-ppy-FA с различной плотностью мощности (1, 2 и 3 Вт / см ² ). (D) Температурная кривая Dox @ PNIPAM-ppy-FA в течение пяти циклов включения / выключения с использованием излучения лазера ближней инфракрасной области (2 Вт / см ² )

Высвобождение лекарственного средства в ближнем инфракрасном диапазоне и термореактивном из нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA

Чтобы оценить профили высвобождения лекарств с помощью NIR и термоотклика, мы проанализировали свойства инкапсуляции и высвобождения нанокомпозитов Dox @ PNIPAM-ppy-FA. Первоначально мы измерили УФ-видимые спектры поглощения загруженного лекарственным средством PNIPAM-ppy-FA, и сильный пик поглощения наблюдался около 480 нм (рис. 2c). Этот результат показал, что Dox успешно загружен в нанокомпозиты PNIPAM-ppy-FA. Эффективность загрузки Dox нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA рассчитывалась как 15% с использованием калибровочной кривой Dox (данные не показаны). На рис. 4а профиль высвобождения докса из PNIPAM-ppy-FA был изучен при различных температурах. Мы наблюдали поведение высвобождения Dox в течение 72 часов при 25 ° C, 37 ° C и 50 ° C, а кумулятивное высвобождение Dox из PNIPAM-ppy-FA составило 15%, 42% и 67% соответственно. Поскольку НКТР PNIPAM-ppy-FA немного снизилась до 42 ° C, совокупное высвобождение при температуре тела было относительно выше, чем при комнатной температуре. Было высвобождено большое количество Dox, однако высвобожденный Dox не повлиял на терапевтическую эффективность, поскольку нанокомпозиты Dox @ PNIPAM-ppy-FA могли быть интернализованы только в клетках, положительных по фолат-рецепторам, как описано ранее [26, 32]. При температуре выше НКТР (50 ° C) количество Dox из нанокомпозитов PNIAPM-ppy-FA высвобождалось в четыре раза выше комнатной температуры, что позволяет предположить, что нанокомпозиты PNIPAM-ppy-FA могут быть использованы в системе с контролируемым высвобождением лекарственного средства за счет теплового отклика. Кроме того, мы исследовали поведение нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA, инициируемое высвобождением света в ближнем инфракрасном диапазоне (рис. 4b). Раствор Dox @ PNIAPM-ppy-FA (1 мг / мл) подвергался воздействию лазера NIR (3 Вт / см ² ) облучение в течение 10 мин, и эту операцию повторяли каждые 1 ч. В течение 6 часов общее количество Dox при облучении лазером NIR достигло 35%, тогда как профиль высвобождения Dox без облучения лазером NIR показал около 5% и 15% (25 ° C и 37 ° C). Этот результат показал, что облучение лазером в ближнем инфракрасном диапазоне приводит к более высокой температуре, чем НКТР нанокомпозитов, и вызывает высвобождение докса из нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA.

а Кумулятивные профили выпуска Dox для Dox @ PNIPAM-ppy-FA через термоответ и b Облучение лазером в ближнем инфракрасном диапазоне с длиной волны 808 нм

Анализ цитотоксичности и клеточного поглощения нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA

Согласно литературным данным, цитотоксичность нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA была исследована в отношении клеток рака легких и молочной железы (дополнительный файл 1:рис. S2) [33, 34]. Независимо от концентрации образца, после инкубации с PNIPAM-ppy-FA в течение 24 часов наблюдалась жизнеспособность обеих клеток (> 85%). Таким образом, наши нанокомпозиты PNIPAM-ppy-FA не проявили цитотоксичности в качестве наноносителя для приложений доставки лекарств [35, 36]. Чтобы исследовать, может ли PNIPAM-ppy-FA избирательно доставляться в раковые клетки, мы исследовали флуоресцентные сигналы внутриклеточных нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (дополнительный файл 1:рис. S3). Поведение клеточного поглощения PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA оценивали в клеточных линиях, отрицательных (A549) и положительных (MDA-MB-231) по рецепторам фолиевой кислоты [37]. После инкубации клеток рака молочной железы MDA-MB-231 с Dox @ PNIPAM-ppy-FA наблюдалась сильная красная флуоресценция, показывающая, что Dox @ PNIAPM-ppy-FA интернализовались в лизосомы клеток MDA-MB-231. Постоянно, когда PNIPAM-ppy-FA и Dox @ PNIPAM-ppy-FA обрабатывали клетками A549, сигналы Dox не наблюдались. Эти конфокальные изображения продемонстрировали, что нанокомпозиты PNIAPM-ppy-FA могут быть селективно интернализованы в раковые клетки со сверхэкспрессией фолатных рецепторов через рецептор-опосредованный путь эндоцитоза, как описано ранее [38, 39].

Хемофотермические противораковые эффекты NIR и термочувствительных нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA

Чтобы подтвердить терапевтическую эффективность комбинации нанокомпозитов PNIPAM-ppy-FA in vitro, нанокомпозиты PNIPAM-ppy-FA оценивали на клетках MDA-MB-231 с или без облучения лазером NIR, а жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа MTT на рис. 5a. . Для фототермической терапии клетки рака груди MDA-MB-231 с PNIPAM-ppy-FA инкубировали в течение 12 часов, а затем подвергали воздействию лазера NIR (5 Вт / см ² , 5 минут). Жизнеспособность клеток рака молочной железы MDA-MB-231 снизилась до 70–90% в зависимости от концентраций PNIPAM-ppy-FA. Чтобы подтвердить единственный химиотерапевтический эффект, были обработаны нанокомпозиты PNIPAM-ppy-FA, нагруженные Dox. Мы наблюдали, что жизнеспособность снизилась до 50% из-за высвобождения Dox из нанокомпозитов, что соответствует профилю высвобождения на рис. 4. Интересно, что после облучения NIR-лазером клеток MDA-MB-231 с нанокомпозитами Dox @ PNIPAM-ppy-FA, жизнеспособность клеток резко снизилась до 24%, что было выше, чем в контрольных группах (PNIPAM-ppy-FA с облучением лазером NIR, Dox @ PNIPAM-ppy-FA без облучения лазером NIR). Этот результат указывает на оптимальный синергетический эффект комбинированной химиофотермической терапии, опосредованной БИК-лазерным излучением. Более того, чтобы непосредственно наблюдать терапевтическую эффективность раковых клеток, был проведен анализ живых / мертвых на фиг. 5b. В качестве контрольной группы мы наблюдали жизнеспособность только клеток MDA-MB-231 с или без облучения лазером NIR (5 Вт / см ² , 5 мин), и у большинства клеток наблюдалась зеленая флуоресценция (живые клетки). Он продемонстрировал, что облучение лазером в ближнем инфракрасном диапазоне не оказывает очевидного влияния на жизнеспособность клеток. In addition, the MDA-MB-231 cells with PNIPAM-ppy-FA under NIR laser irradiation showed a few red fluorescence (dead cells), indicating photothermal therapeutic effect caused from PNIPAM-ppy-FA nanocomposites. Despite no NIR laser irradiation in MDA-MB-231 cells with Dox@PNIPAM-ppy-FA, a few sporadic red fluorescence was observed, indicating chemotherapy. Furthermore, when MDA-MB-231 cells were treated with nanocomposites and NIR laser irradiation, the most cancer cells exhibited a few red fluorescence [39, 40]. These results supported the synergistic therapeutic effects of chemo-photothermal therapy via NIR laser irradiation and thermo-responsive Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposites.

а Quantitative analysis of viability of MDA-MB-231 breast cancer cells treated with PNIPAM-ppy-FA and Dox@PNIPAM-ppy-FA with different concentrations and with or without 808 nm NIR laser irradiation. б Fluorescence images of live/dead assay in MDA-MB-231 cells after treatment of PNIPAM-ppy-FA and Dox@PNIPAM-ppy-FA nanocomposites (60 μg/mL) with or without NIR laser irradiation. The live and dead cells are stained with Calcein AM (green) and Ethidium homodimer-1 (red). Scale bars are 200 μm

Conclusion

We have successfully constructed a cancer targeted NIR and thermo-responsive PNIPAM-ppy-FA nanocomposites for chemo-photothermal combination therapy. To induce the controlled release and photothermal effect via 808 nm NIR laser irradiation, ppy nanoparticles were uniformly decorated on PNIPAM-AAc by polymerization method. Dox-loaded PNIPAM-ppy-FA showed significant photothermal effect and photostability. Furthermore, Dox@PNIPAM-ppy-FA showed favorable properties of thermo-sensitive transition at different conditions and the drug release from PNIPAM-ppy-FA nanocomposites could be controlled by NIR light and thermo-response. In vitro studies verified that PNIPAM-ppy-FA nanocomposites showed excellent biocompatibility and enhanced therapeutic efficacy toward breast cancer cells. This enhanced anticancer efficacy via nanocomposites was contributed to the following reasons:(1) specific cellular uptake of nanocomposites in folate-receptor mediated endocytosis, (2) accumulated Dox release from PNIPAM-ppy-FA via NIR and thermo-response, and (3) synergistic therapeutic effect by chemo-photothermal combination. Therefore, our PNIPAM-ppy-FA nanocomposite could be potentially used as a multi-functional nanocarrier for synergistic therapeutic approaches toward different types of cancers with reduced side effect.

Доступность данных и материалов

The data and the analysis in the current work are available from the corresponding authors on reasonable request.

Сокращения

PTT:

Фототермическая терапия

NIR:

Near-infrared

FA:

Folic acid

FA-PEG-NH₂ :

FA-PEG amine

LCST:

Lower critical solution temperature

PNIPAM:

Поли ( N -изопропилакриламид)

ppy:

Polypyrrole

ТЕМ:

Transmission microscopy

UV–Vis:

Ultraviolet–visible spectroscopy