Fe₃O₄–PNIPAAm нанокомпозиты: метод синтеза определяет антибактериальную эффективность и физикохимические свойства

Аннотация

Магнитные поли(N-изопропилакриламид) (Fe₃O₄-PNIPAAm) нанокомпозиты перспективны для биомедицинских и экологических приложений. Мы сравнили три пути синтеза — эмульсионная полимеризация, in-situ осаждение и физическое добавление — для производства Fe₃O₄-PNIPAAm-1, -2 и -3 соответственно. Растровая электронная микроскопия, дзета-потенциал, термогравиметрический анализ, вибрирующая выборка магнетометрии и динамическое рассеяние света показали, что Fe₃O₄-PNIPAAm-1 и -2 демонстрируют превосходную термическую стабильность, заряд поверхности и намагниченность, указывая на высокостабильные коллоиды. Все композиты, даже при низких концентрациях, индуцировали значительное повреждение ДНК в Escherichia coli и Staphylococcus aureus и снизили жизнеспособность клеток. Fe₃O₄-PNIPAAm-1 проявил сильнейший антимикробный эффект по обоим штаммам, причем S. aureus показал большую чувствительность, чем E. coli. Эти находки подчеркивают эмульсионную полимеризацию как предпочтительный путь для производства Fe₃O₄-PNIPAAm с улучшенными антибактериальными свойствами.

Предыстория

Магнитные термочувствительные полимерные нанокомпозиты, такие как Fe₃O₄-PNIPAAm, сочетают магнитную отзывчивость с температурно-зависимым поведением LCST PNIPAAm (~32 °C). Магнитное ядро обеспечивает быстрое разделение под внешним полем, в то время как полимерная оболочка предлагает коллоидную стабильность и функционализационные сайты для лекарств или биомолекул. Применения охватывают водоочистку, доставку лекарств, контраст для МРТ и гипертермийную раковую терапию. Используют три основные стратегии синтеза: (1) физическое добавление предварительно сформированных Fe₃O₄ и PNIPAAm частиц; (2) in-situ осаждение Fe₃O₄ внутри матрицы PNIPAAm; и (3) эмульсионная полимеризация N-изопропилакриламида вокруг Fe₃O₄. Выбор метода влияет на размер частиц, поверхностную химию, намагниченность и, в конечном счете, биологическую эффективность. Понимание этих эффектов необходимо для проектирования нанокомпозитов с оптимальной стабильностью и антибактериальной эффективностью.

Методы

Химикаты

Все реактивы (FeCl₃·6H₂O, FeCl₂·4H₂O, NH₄OH, N-изопропил-акриламид, BIS, SDS, APS) приобрели у Sigma-Aldrich (Германия) и использовали без дополнительной очистки.

Синтез PNIPAAm (эмульсионная полимеризация)

NiPAM (4 г), BIS (0,2 г) и SDS (0,3 г) растворяли в 350 мл деионизированной воды при 70 °C под N₂. APS (0,0035 г) в 1 мл воды инициировал полимеризацию; реакция шла 4 ч, после чего частицы промывали и собирали центрифугированием (12 000 об/мин, 30 мин).

Подготовка наночастиц Fe₃O₄

FeCl₂·4H₂O (1,9 г) и FeCl₃·6H₂O (5,4 г) (молярное соотношение 1:2) растворяли в 100 мл ДИ воды, нагревали до 70 °C и осаждали NH₄OH (6 мл). Черную суспензию перемешивали 30 мин, многократно промывали и сушили в ротационном испарителе (25 мбар, 40 °C).

Fe₃O₄-PNIPAAm-1 (эмульсионная полимеризация)

NiPAM (0,4 г), Fe₃O₄ (0,2 г), BIS (0,2 г), SDS (0,3 г) смешивали в 350 мл ДИ, нагревали до 70 °C под N₂ и полимеризовывали APS (0,0035 г). Через 4 ч композит промывали, центрифугировали и сушили.

Fe₃O₄-PNIPAAm-2 (In-situ осаждение)

FeCl₂ (0,148 г), FeCl₃ (0,4 г) и 10 мл ДИ добавляли к 1 г PNIPAAm. NH₄OH (3 мл) индуцировало немедленное черное осаждение; смесь перемешивали при 70 °C в течение 30 мин, промывали, центрифугировали и сушили.

Fe₃O₄-PNIPAAm-3 (Физическое добавление)

1 г PNIPAAm, 0,5 г Fe₃O₄ и 5 мл ДИ смешивали и перемешивали при 70 °C в течение 30 мин. Суспензию промывали, центрифугировали и сушили.

Характеризация

Размер и дзета-потенциал измеряли ДРС после соникации. Термогравиметрический анализ (25–900 °C, 10 °C/мин, N₂) количественно определял содержимое покрытия. Насыщенную намагниченность регистрировали вибрирующим выбором магнетометром. РЭМ изображения (1,5 кВ) раскрывали морфологию. Все измерения выполняли в трипликатах.

Бактериальные штаммы и условия роста

E. coli CCM3954 (грамотрицательные) и S. aureus CCM3953 (грамположительные) культивировали овернайт в соево-питательном бульоне перед воздействием нанокомпозитов (0,01–1 г/л).

Оценка повреждения ДНК (кометный тест)

Бактериальные суспензии (10⁷ клеток/мл) инкубировали с 0,1 или 1 г/л каждого композита в течение 30 мин при 37 °C. Следовали стандартному кометному протоколу (лизис, электрофорез, окраска); 50 комет на образец количественно определяли флуоресцентной микроскопией (×400).

Рост, жизнеспособность и морфология

Скорости роста рассчитывали из измерений OD₆₀₀ каждые 2 ч в течение 6 ч. EC₁₀ значения выводили из процентов ингибирования. Жизнеспособность после 24 ч определяли набором live/dead (возбуждение 485 нм, эмиссия 528 нм для живых; 645 нм для мертвых). Длину клетки (E. coli) и площадь кластера (S. aureus) измеряли при ×600.

Статистический анализ

Данные анализировали однофакторным ANOVA с последующим тестом Даннета (GraphPad Prism). Значимость устанавливали при P < 0,05.

Результаты

РЭМ-изображения подтвердили, что Fe₃O₄-PNIPAAm-1, -2 и -3 демонстрируют отличные морфологии, причем Fe₃O₄-PNIPAAm-1 показывает наиболее узкое распределение размеров и минимальную аггломерацию (Рисунок 1). TGA кривые указали, что все композиты термически стабильны выше 400 °C, с Fe₃O₄-PNIPAAm-1, сохраняющим 87% массы, отражая высокую загрузку Fe₃O₄ (Рисунок 2). дзета-потенциалы составляли –15,6 мВ (–1,58 мВ для PNIPAAm), –16,4 мВ (–1,8 мВ для Fe₃O₄-PNIPAAm-3), подтверждая коллоидную стабильность (Рисунок 3). Значения насыщенной намагниченности были 50,4 эму/г (Fe₃O₄-PNIPAAm-1), 53,7 эму/г (Fe₃O₄-PNIPAAm-2) и 21,0 эму/г (Fe₃O₄-PNIPAAm-3). ДРС измерения при 25 °C и 45 °C раскрыли температурно-зависимые изменения размеров, согласованные с поведением LCST (Рисунок 4).
Кометные тесты показали значительные разрывы цепей ДНК в E. coli и S. aureus после 30-минутного воздействия всех композитов (P < 0,001) (Рисунок 5). Тесты скорости роста продемонстрировали, что Fe₃O₄-PNIPAAm-1 и -2 сильно ингибировали бактериальную пролиферацию, тогда как Fe₃O₄-PNIPAAm-3 имел умеренный эффект (Рисунок 6). EC₁₀ значения были наименьшими для Fe₃O₄-PNIPAAm-1, указывая на наивысшую антибактериальную потенцию. Тесты жизнеспособности раскрыли доза-зависимое увеличение мертвых клеток, с Fe₃O₄-PNIPAAm-1 достигающим до 32% мертвых E. coli и 50% мертвых S. aureus при 1 г/л (Рисунок 7). Морфологический анализ показал удлинение E. coli и кластеризацию S. aureus при более высоких концентрациях, отражая стрессовые ответы.

Обсуждение

Путь синтеза существенно влияет на физикохимические атрибуты Fe₃O₄-PNIPAAm нанокомпозитов. Эмульсионная полимеризация дает частицы с оптимальной однородностью размера, зарядом поверхности и намагниченностью, способствуя быстрой дисперсии и сильному антибактериальному действию. In-situ осаждение предлагает сопоставимую термическую стабильность, но слегка более высокую аггломерацию, в то время как физическое добавление приводит к наименее желательным свойствам и слабейшему антимикробному эффекту. Наблюдаемое повреждение ДНК, вероятно, возникает из-за оксидативного стресса и разрушения мембраны, индуцируемого Fe₃O₄ ядрами, подтверждаемого предыдущими отчетами о генотоксичности Fe-основанных наночастиц. Превосходная активность Fe₃O₄-PNIPAAm-1 подчеркивает важность контролируемого синтеза для биомедицинских приложений, таких как антимикробные покрытия, раневые перевязки и целевая доставка лекарств.

Заключение

Fe₃O₄-PNIPAAm нанокомпозиты, приготовленные эмульсионной полимеризацией (Fe₃O₄-PNIPAAm-1), демонстрируют наиболее благоприятное сочетание термической стабильности, заряда поверхности, намагниченности и антибактериальной эффективности против E. coli и S. aureus. In-situ осаждение (Fe₃O₄-PNIPAAm-2) и физическое добавление (Fe₃O₄-PNIPAAm-3) производят менее стабильные и менее мощные композиты. Эти находки поддерживают использование эмульсионной полимеризации для генерации Fe₃O₄-PNIPAAm материалов, подходящих для клинических и экологических антимикробных приложений.

Аббревиатуры

Fe₃O₄-PNIPAAm

Магнитный поли(N-изопропилакриламид)

MNPs

Магнетитовые наночастицы