Целевая антиопухолевая доставка метotreксата через наногели на основе хондроитина сульфата

Аннотация

Самособирающиеся наногели (НГ) были изготовлены ковалентным конъюгированием метotreксата (МТХ) к гликозаминогликану хондроитину сульфату (ХС). МТХ-ХС НГ демонстрируют драматически улучшенную водорастворимость и улучшенную биодистрибуцию, благодаря аффинитету ХС к рецептору CD44, который сверхэкспрессирован на многих опухолевых клетках. In vivo эксперименты подтверждают, что МТХ-ХС НГ доставляют более высокие внутриопухолевые концентрации лекарства при значительном снижении системной токсичности по сравнению с свободным МТХ. Эти результаты устанавливают ХС-основанные конъюгаты как мощную платформу для целевой доставки слаборстворимых антинеопластических агентов.

Предыстория

Метotreксат (МТХ), фолатный аналог, впервые введенный в 1950-х, остается краеугольным камнем химиотерапии для различных злокачественностей. Его клиническая полезность, однако, ограничена низкой водорастворимостью, быстрой клиренсом и доза-зависимыми неблагоприятными эффектами, в частности муковитом и миелосупрессией. Недавние данные указывают, что целевая доставка может преодолеть эти барьеры, улучшая опухолевой захват при щажении нормальных тканей.

Нанотехнологии предлагают универсальный инструментарий для улучшения фармакокинетики лекарств. Самосборка конъюгатов лекарство-полимер в наногели обеспечивает защитную гидрофильную оболочку, удлиненное время циркуляции и контролируемое высвобождение. Хондроитин сульфат (ХС), естественно встречающийся гликозаминогликан, с высокой аффинитетом связывает рецептор CD44, путь, часто эксплуатируемый метастазирующими раками. ХС-основанные наночастицы уже проявили перспективы в опухолевом таргетинге. Строясь на этих достижениях, мы спроектировали ХС-МТХ наногель, направленный на максимизацию терапевтической выгоды при минимизации токсичности.

Методы

Материалы и образцы

Хондроитин сульфат (ММ 100–200 кДа) приобрели у Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. Другие реактивы, включая 4-метилморфолин, тетрагидрофуран (ТГФ) и 2-хлоро-4,6-диметокси-1,3,5-триазин, получили от Sun Chemical Technology. Фетальная телячья сыворотка (ФТС) приобрели у HyClone. Крысы Lewis (Sprague-Dawley, 200 ± 10 г) использовали для in vivo исследований.

Синтез DMT-ММ

DMT-ММ подготавливали реакцией 2-хлоро-4,6-диметокси-1,3,5-триазина (0,769 г) с 4-метилморфолином (18,79 мл) в ТГФ (200 мл) под перемешиванием 30 мин. Полученный белый осадок фильтровали, промывали трижды ТГФ и вакуумно сушили 24 ч.

Синтетический путь для DMT-ММ

Синтез МТХ-ХС

ХС (1,0 г) растворяли в 20 мл ультрачистой воды и активировали DMT-ММ (0,769 г). Через 30 мин при комнатной температуре добавляли МТХ (0,5 г) и перемешивали 24 ч. Конъюгат диализировали (МП 3,5 кДа) против воды 48 ч с частыми обменами, затем лиофилизировали в желтый порошок. ФТИР (400–4000 см⁻¹) и ¹H-NMR (400 МГц) подтвердили успешную конъюгацию.

Синтетический путь для МТХ-ХС

Цитотоксичность МТХ-ХС наногелей

Клетки A549T, HeLa и HUVEC посеяли по 5 × 10³ клеток/колодец в 96-колодчатых пластинках и инкубировали 24 ч (37 °C, 5% CO₂). Затем клетки обрабатывали МТХ-ХС НГ в концентрациях от 0 до 400 мкМ (на основе содержания МТХ) в течение дополнительных 48 ч. Жизнеспособность клеток количественно определяли МТТ-тестом: добавляли 20 мкл буфера CCK-8, выдерживали 4 ч, и абсорбцию измеряли при 490 нм (референс 570 нм) на ридере MULTISKAN GO.

Животные и экспериментальный дизайн

Самцы крыс Sprague-Dawley рандомизировали в три группы (n = 6): (i) солевой контроль, (ii) свободный МТХ (1,25 мкмоль кг⁻¹ сут⁻¹), и (iii) МТХ-ХС НГ (эквивалентно 1,25 мкмоль кг⁻¹ сут⁻¹ МТХ, 25 мг кг⁻¹ сут⁻¹ НГ). Лечение вводили интраперитонеально в течение 14 дней (7 инъекций). Массу тела и выживаемость мониторили; животных эвтаназировали после лечения для сбора органов.

Гистологическое исследование

Селезенки эксцидировали, промывали ПБС, фиксировали в 4% параформальдегиде (pH 7,4) в течение 24 ч, парафинировали, делали срезы и окрашивали гемоксилином и эозином. Препараты изучали под световым микроскопом на предмет признаков тканевого повреждения.

Результаты и обсуждение

Характеризация МТХ-ХС наногелей

ФТИР спектры (Рис. 1) демонстрируют характерные пики МТХ (3355, 2951, 1646, 1600, 1540, 1493, 1403, 1207 см⁻¹), сохраняющиеся в конъюгате, подтверждая успешное присоединение. ¹H-NMR (Рис. 2) раскрывает сигналы, соответствующие бензоиловым (δ ≈ 6,9 ppm, 7,8 ppm) и птеридиниловым (δ ≈ 8,7 ppm) моетиям МТХ, в то время как сигналы ХС (δ 3,2–5,4 ppm) остаются неизменными, дополнительно подтверждая конъюгацию. Эффективность конъюгации, определенная УФ-вис при 309 нм, составила 13,65% МТХ на массу наногеля.

Рисунок 1: ФТИР спектры ХС (a), МТХ (b) и МТХ-ХС (c).

Рисунок 2: ¹H-NMR спектры ХС (a), МТХ (b) и ХС-МТХ (c).

Динамическое рассеяние света (ДРС) выявило гидродинамический диаметр ~200 нм (Рис. 3b), в то время как атомно-силовая микроскопия (АСМ) и трансляционная электронная микроскопия (ТЭМ) подтвердили сферическую морфологию с диаметрами 200–240 нм (Рис. 3c-e). Наномасштабный размер оптимален для эффекта усиленного проникновения и удержания (EPR) и CD44-медированной эндоцитоза.

Рисунок 3: (a) Схема МТХ-ХС НГ; (b) ДРС распределение размера; (c) АСМ изображение; (d-e) ТЭМ микрографы.

In vitro цитотоксичность

МТХ-ХС НГ заметно снизили жизнеспособность клеток A549T и HeLa по сравнению со свободным МТХ и смесью МТХ с ХС (Рис. 5). Для HeLa жизнеспособность упала с 73,8% (свободный МТХ) до 60,2% (МТХ-ХС НГ) при 10 мкМ, в то время как для A549T снижение составило 80,2% до 46,0% при 50 мкМ. В то же время свободное лекарство демонстрировало минимальную активность при сопоставимых концентрациях, а смесь МТХ+ХС даже стимулировала рост клеток. Эти находки подчеркивают роль CD44-медированного захвата в улучшении внутриклеточной доставки МТХ. Тесты на HUVEC показали увеличение жизнеспособности на 9,9% при 10 мкМ МТХ-ХС НГ против 63,6% для свободного МТХ, указывая на сниженную off-target токсичность.

Рисунок 5: Жизнеспособность клеток после 48-часового лечения свободным МТХ, МТХ+ХС и МТХ-ХС НГ в A549T (a), HeLa (b) и HUVEC (c).

In vivo токсичность и эффективность

Мониторинг массы тела в течение 14 дней показал, что крысы, получавшие свободный МТХ, теряли значительный вес, тогда как группа МТХ-ХС НГ сохраняла вес близкий к базовому (Рис. 6). Гистологическое исследование селезенок показало тяжелую гиперемию и гемосидеринозное отложение в группе МТХ, но только легкие изменения в группе МТХ-ХС НГ, подтверждая сниженную системную токсичность (Рис. 7).

Рисунок 6: Траектория массы тела для солевого контроля, свободного МТХ и МТХ-ХС НГ групп.

Рисунок 7: H&E-окрашенные срезы селезенки – (a,b) контроль, (c,d) свободный МТХ, (e,f) МТХ-ХС НГ.

Заключение

Мы успешно спроектировали 200-нм МТХ-ХС наногель, сочетающий высокую растворимость, CD44-медированный таргетинг и сниженную системную токсичность. In vitro и in vivo данные демонстрируют превосходную антиопухолевую потенцию относительно свободного МТХ, с заметно более низкими неблагоприятными эффектами. Эти находки валидируют ХС-основанные лекарственные конъюгаты как универсальную стратегию для доставки слаборстворимых антинеопластических агентов с улучшенным терапевтическим индексом.

Аббревиатуры

1H NMR:

1H Ядерно-магнитный резонанс

АСМ:

Атомно-силовой микроскоп

CDMT:

2-хлоро-4,6-диметокси-1,3,5-триазин

ХС:

Хондроитин сульфат

ДРС:

Динамическое рассеяние света

DMT-ММ:

4-(4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил)-4-метилморфолиниев хлорид

ФТИР:

Фурье-трансформационная инфракрасная спектроскопия

МТТ:

3-(4,5-диметил-2-тиазолил)-2,5-дифенил-2H-тетразолиев бромид

МТХ:

Метotreксат

МТХ-ХС НГ:

Метotreксат-хондроитин сульфат наногели

НГ:

Наногели

NMM:

4-Метилморфолин

ТЭМ:

Трансляционный электронный микроскоп

ТГФ:

Тетрагидрофуран

УФ-вис:

Ультрафиолетово-видимая спектроскопия