Противоопухолевое исследование наногелей хондроитинсульфат-метотрексат

Фон

Метотрексат (4-амино-10-метилфолевая кислота, метотрексат) представляет собой аналог фолиевой кислоты, принадлежащий к семейству антифолатных антиметаболитов [1]. Метотрексат был первым лекарством, используемым в терапии опухолей с 1950-х годов [2], который представляет собой мутагенный и тератогенный противоопухолевый препарат, действующий путем блокирования активности фермента и препятствующего синтезу ДНК [3]. Предыдущие исследования показали, что одной доставки химиотерапевтических препаратов к клетке-мишени недостаточно для индукции гибели клеток, а высокие дозы метотрексата могут значительно улучшить показатель излечения и прогноз пациентов [4]. Низкая растворимость в воде, низкая проницаемость и короткий период полураспада метотрексата ограничивают его клиническое применение [5, 6]. Эффект химиотерапии метотрексатом во многом зависит от его низкого поглощения опухолевыми клетками, тканевого биораспределения и серьезных побочных эффектов [7]. Однако более высокая концентрация метотрексата может увеличить риск побочных эффектов из-за низкой биодоступности метотрексата [8]. Существует острая необходимость в разработке новой системы доставки лекарств для улучшения биодоступности метотрексата и уменьшения его побочных эффектов.

Нанотехнология имеет преимущества в системах доставки лекарств, включая улучшение стабильности лекарств, расширение кровообращения, уменьшение побочных эффектов и контроль высвобождения лекарств [9,10,11,12,13,14,15]. Технология самосборки широко используется в области доставки лекарств для повышения эффективности и снижения побочных эффектов лекарств [16,17,18,19,20]. Наше исследование направлено на разработку наногелевой системы доставки лекарств для метотрексата, чтобы улучшить его растворимость и биораспределение, а также уменьшить его побочные эффекты. Хондроитинсульфат (ХС) представляет собой кислый гликозаминогликан (ГАГ), который составляет важный компонент хрящей, стенок кровеносных сосудов, кожи, сухожилий и других соединительных тканей [21]. Наногели на основе хондроитинсульфата изучались ранее [22, 23]. Исследования показали, что CD44 связывает протеогликан CS [24,25,26]. CD44 представляет собой трансмембранный гликопротеин с внеклеточными доменами и участвует в опосредовании межклеточных взаимодействий и межклеточных взаимодействий, а также играет роль в миграции клеток [27]. CD44 высоко экспрессируется при метастатическом раке, в отличие от его низких уровней экспрессии в нормальных тканях [28]. Сообщалось о наночастицах на основе CS для нацеливания на опухоли и доставки противоопухолевых лекарств [29, 30]. Здесь мы изготовили новый тип самосборных наногелей CS-MTX, чтобы улучшить адресную доставку молекул лекарственного средства MTX в раковые клетки посредством взаимодействия CS-CD44.

Методы

Материалы и образцы

Хондроитинсульфат был приобретен у Dalian Meilun Biotech Co., Ltd. (Далянь, Ляонин, Китай). 4-Метилморфолин, тетрагидрофуран и 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазин были приобретены у Sun Chemical Technology (Шанхай, Китай) Co., Ltd., а фетальная бычья сыворотка (FBS) была куплена. от HyClone (Юта, США). Все остальные химические вещества были закуплены у Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. (Шанхай, Китай). Крысы Lewis были приобретены у Shanghai Sippr-BK Laboratory Animal Co., Ltd. (Шанхай, Китай).

Синтез DMT-MM

4- (4,6-Диметокси-1,3,5-триазин-2-ил) -4-метилморфолиния хлорид (DMT-MM) используется для реакций конденсации дегидратации с активацией карбоновой кислоты, которая может использоваться в водном или протонном растворителе. системы. Двадцать пять граммов 2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазина (CDMT) растворяли в 200 мл тетрагидрофурана (THF). Затем 18,79 мл 4-метилморфолина (NMM) добавляли по каплям к раствору CDMT при перемешивании. Для обеспечения полного ответа перемешивание следует поддерживать в течение 30 мин. Затем отфильтрованный продукт трижды промывали ТГФ и сушили под вакуумом в течение 24 часов. DMT-MM получали в виде белого порошка (Схема 1).

Синтетические пути образования ДМТ-ММ

Синтез MTX-CS

Конъюгированный с МТХ CS был активирован DMT-MM. Для активации CS CS (1,0 г) растворяли в 20 мл сверхчистой воды и активировали добавлением DMT-MM (0,769 г). Реакцию проводили в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем активированный CS подвергался дальнейшей реакции с МТХ в течение 24 ч при комнатной температуре. Раствор диализовали в течение 48 ч, меняя воду каждые 4 ч, и лиофилизировали. MTX-CS получали в виде желтого порошка. Желтый порошок исследовали с помощью инфракрасной спектрометрии с преобразованием Фурье (ALPHA, BRUKER, США). Спектры FTIR были записаны в диапазоне от 400 до 4000 см ^-1 . . ¹ H ЯМР использовали для определения того, был ли MTX конъюгирован с CS (схема 2).

Синтетические пути образования MTX-CS

Цитотоксичность наногелей MTX-CS

Цитотоксичность наногелей анализировали с использованием опухолевых клеток A549T и Hela и культуры эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). Клетки A549T и Hela высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 5 × 10 ³ . клеток на лунку в количестве 1640, с добавлением 10% FBS и инкубированием в течение 24 часов при 5% CO ₂ при 37 ° С. За A549T следовала обработка разными концентрациями MTX-CS NG (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 мкМ), а за Hela следовала обработка разными концентрациями MTX- CS NG (0, 5, 10, 30, 40, 60, 80, 100 мкМ) в течение еще 48 часов. Концентрации MTX-CS NG были основаны на содержании MTX в каждом образце. Концентрации CS были основаны на содержании MTX-CS NG в каждом образце. HUVEC засевали в 96-луночные планшеты с плотностью 5 × 10 ³ . клеток на лунку в среде DMEM с добавлением 10% FBS и инкубированием в течение 24 часов при 5% CO ₂ при 37 ° С. Затем в HUVEC добавляли различные концентрации MTX-CS NG (0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 100, 200, 400 мкМ). Концентрации MTX-CS NG были основаны на содержании MTX в каждом образце. Концентрации CS были основаны на содержании MTX-CS NG в каждом образце. Анализ МТТ - это измерение активности клеток. В каждую лунку добавляли двадцать микролитров буфера CCK-8 и инкубировали при 37 ° C в атмосфере 5% CO ₂ . еще 4 ч. Среду удаляли и в каждую лунку добавляли 200 мкл ДМСО. Оптическую плотность измеряли при длине волны 490 нм (570 нм в качестве эталона) на считывающем устройстве для микропланшетов MULTISKAN GO (Thermo Scientific, США).

Животные и экспериментальный дизайн

Для анализа токсичности MTX-CS NG in vivo восемнадцатых самцов крыс Sprague-Dawley были приобретены в Центре экспериментальных животных Чжэцзянской академии медицинских наук (Ханчжоу, Чжэцзян, Китай). Этих крыс содержали при 12-часовом световом и 12-часовом темноте при свободном доступе к воде и пище. Крысы в ​​возрасте 8 недель (200 ± 10 г) были случайным образом разделены на три группы:контрольная группа (вводили тот же объем физиологического раствора), группа метотрексата (вводили 1,25 мкмоль кг ^-1 день ⁻¹ ) и группе MTX-CS NG (вводили 25 мг кг ^-1 день ⁻¹ MTX-CS NGs). Доза метотрексата в группе MTX-CS NG была равна свободной дозе группы метотрексата (1,25 мкмоль кг ^-1 день ⁻¹ ). Лекарства вводили на следующий день путем внутрибрюшинных инъекций соответственно. После 2 недель лечения (всего семь инъекций) всех крыс умерщвляли декапитацией для дальнейших исследований.

Гистологическое исследование

После декапитации все селезенки крыс быстро вырезали и дважды промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали в 4% ( w / v ) параформальдегида (pH =7,4) (Sigma-Aldrich, Миссури, США) в течение 24 часов. Затем ткани были подготовлены для окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) с использованием стандартных процедур и получены под высококачественным световым микроскопом.

Результаты и обсуждение

Синтез MTX-CS

Чтобы определить, был ли MTX конъюгирован с CS, мы использовали FTIR и ¹ H ЯМР для анализа образцов биоконъюгатов MTX, CS и MTX-CS. На рис. 1 показаны ИК-Фурье-спектры биоконъюгатов CS (рис. 1a), MTX (рис. 1b) и MTX-CS (рис. 1c). Как показано на рис. 1b, MTX имел характеристический коэффициент пропускания на 3355, 2951, 1646, 1600, 1540, 1493, 1403 и 1207 см ⁻¹ . Пики ИК-Фурье при 1600 и 1540 см ⁻¹ может быть отнесен к растяжению пара-бензола, которое может быть обнаружено в FTIR-спектре биоконъюгатов MTX (рис. 1b) и MTX-CS (рис. 1c). Результаты FTIR показали, что МТХ успешно конъюгирован с CS.

а ИК-Фурье спектр CS. б FTIR-спектр MTX. c FTIR-спектр MTX-CS

На рисунке 2 показан ¹ Спектры ЯМР 1Н биоконъюгатов CS, MTX и MTX-CS. Пики при 6.93 (2H, d, J =10,1 Гц) и 7,84 (2H, d, J =10,1 Гц) может быть отнесен к бензоильной группе метотрексата. Пики при 4,90 (2H, s) могут быть отнесены к метилену рядом с 2,4-диамино-6-птеридинильной группой, а пики при 8,69 (1H, s) могут быть отнесены к 2,4-диамино- 6-птеридинильная группа MTX, как показано на рис. 2b. ¹ H ЯМР CS-MTX (рис. 2c) позволил предположить, что CS (дисахаридная часть δ _H сигналы были между 3,20 и 5,40, с 5,39, назначенным как аномерный углерод) был успешно присоединен к МТХ (химический сдвиг бензоильной группы составлял 8,00 и 6,88, а метильная группа была при 3,20). ЯМР также доказал, что МТХ был конъюгирован с CS.

¹ Спектры ЯМР 1Н CS, MTX и CS-MTX. а ¹ Спектры ЯМР 1Н CS; CS растворяли в D ₂ О. б ¹ Спектр ЯМР 1Н метотрексата; МТХ растворяли в диметилсульфоксиде-d6. c ¹ H ЯМР спектр CS-MTX; CS-MTX растворяли в D ₂ O

Для расчета количества МТХ, конъюгированного с CS, образцы растворяли в сверхчистой воде и встряхивали в течение 48 часов при комнатной температуре. Количество МТХ определяли с использованием спектрофотометра УФ-видимой области при 309 нм. Количество МТХ измеряли с помощью УФ-видимой спектроскопии. Наконец, рассчитанное количество метотрексата на MTX-CS NG составило 13,65%. Наногели образованы инкапсуляцией гидрофобных молекул МТХ внешним слоем гидрофильных боковых цепей CS (рис. 3а). Наногели охарактеризованы методами динамического рассеяния света (DLS), атомно-силового микроскопа (AFM) и просвечивающего электронного микроскопа (TEM). Как показано, данные DLS измеряли размер всех наногелей в диапазоне 100–400 нм (рис. 3б). Размер частиц наночастиц составляет в основном около 200 нм. АСМ-изображение наногелей подтвердило, что наночастицы были хорошо распределены с аналогичным размером около 200 нм и морфологией (рис. 3c). На ПЭМ-изображениях также показано, что наногели представляют собой наносферы размером в диапазоне 200–240 нм. Размер частиц наночастиц в основном составляет около 200 нм (рис. 3d, e).

Схематическое изображение MTX-CS NG. Динамическое рассеяние света (DLS), атомно-силовой микроскоп (AFM) и просвечивающая электронная микроскопия (TEM) характеризация MTX-CS NG. а Схематическое изображение MTX-CS NG. б Размер MTX-CS NG, измеренный с помощью DLS в репрезентативных экспериментах. c АСМ изображения НГ MTX-CS. г , e ПЭМ-изображения MTX-CS NG

Для расчета количества МТХ, конъюгированного с CS, образцы растворяли в сверхчистой воде и встряхивали в течение 48 часов при комнатной температуре. Количество метотрексата определяли с помощью спектрофотометра УФ-видимой области при 313 нм.

Количество МТХ измеряли с помощью УФ-видимой спектроскопии. Во-первых, строили стандартную кривую УФ-поглощения свободного метотрексата (рис. 4). Связь между абсорбцией и концентрацией свободного метотрексата:

Стандартная кривая УФ-поглощения метотрексата

Затем 28,8 мг МТХ-CS растворяли в 1000 мл сверхчистой воды, и УФ-поглощение составляло 0,2055. Наконец, рассчитанное количество метотрексата на MTX-CS NG составило 13,65%.

Цитотоксичность наногелей MTX-CS

Противоопухолевую активность MTX-CS NG, свободного MTX и MTX, смешанного с CS, in vitro анализировали с использованием культуры опухолевых клеток A549T и Hela. Как показал анализ MTT (рис. 5), MTX-CS NG могут значительно снизить жизнеспособность обеих раковых клеток, в то время как свободный MTX не проявляет каких-либо эффектов при высоких концентрациях. Метотрексат, смешанный с CS в высокой концентрации, даже способствует росту раковых клеток. Жизнеспособность Hela снизилась с 73,81% для свободного MTX до 60,16% для MTX-CS NG (снижение жизнеспособности клеток на 13,65%) при концентрации лекарственного средства 10 мкМ (рис. 5a). Аналогичным образом, жизнеспособность клеток A549T снизилась с 80,23% для свободного MTX до 46,04% для NG MTX-CS (снижение жизнеспособности клеток на 34,09%) при концентрации лекарственного средства 50 мкМ (фиг. 5b). Полисахариды, такие как гиалуроновая кислота, используются в качестве нацеливающего фрагмента конъюгатов лекарственных средств или наночастиц для лечения рака, поскольку они специфически связываются с рецептором CD44 [31]. Хондроитинсульфат также может действовать как лиганд для рецептора CD44 [25, 27], что означает, что CS может способствовать поглощению MTX-CS NG раковыми клетками и повышать лекарственную эффективность метотрексата. Кроме того, наночастицы могут повышать стабильность лекарственного средства и контролировать высвобождение лекарств [32, 33]. Все результаты доказали, что противоопухолевая активность MTX-CS NG была лучше, чем у свободного MTX, а также у MTX, смешанного с CS. С повышением эффективности внутриклеточной доставки молекул лекарственного средства MTX, селективность нацеливания MTX-CS NG также улучшилась по сравнению с такой же концентрацией свободного MTX. Эти результаты демонстрируют, что MTX-CS NG обладают лучшим противоопухолевым действием, чем свободный MTX.

а Жизнеспособность клеток A549 T в присутствии свободных MTX, свободных MTX и CS и MTX-CS NG в течение 48 часов. б Жизнеспособность клеток Hela в присутствии свободных MTX, свободных MTX и CS и MTX-CS NG в течение 48 часов. c Жизнеспособность клеток HUVEC в присутствии свободных MTX, CS и MTX-CS NG через 48 ч

Неблагоприятный эффект MTX-CS NG, свободный MTX и CS анализировали с использованием культуры HUVEC. Как показал анализ MTT (рис. 5c), MTX-CS NG могут значительно снизить побочный эффект, в то время как свободный MTX может значительно снизить жизнеспособность HUVEC. Жизнеспособность HUVEC была увеличена с 63,6% для свободного MTX до 73,5% для MTX-CS NG (9,9% увеличение жизнеспособности клеток) при концентрации лекарственного средства 10 мкМ (рис. 5c). Жизнеспособность клеток HUVEC при 400 мкМ все еще составляла 69,95%. Результат показал, что MTX-CS NG могут уменьшить побочный эффект на нормальную соту.

Животные и экспериментальный дизайн

Одним из основных вторичных токсических побочных эффектов метотрексата, применяемого для лечения онкологических больных, является кишечный мукозит, который вызывает быстрое снижение массы тела [34]. Затем мы протестировали защитные эффекты MTX-CS NG от потери веса, вызванной химиотерапией, у самцов крыс Sprague-Dawley. Выживаемость и вес отслеживали в течение 14 дней после инъекции физиологического раствора, свободного MTX и MTX-CS NG. Ни в одной из трех групп не было обнаружено смертей. Резкое снижение массы тела наблюдалось во всех группах метотрексата (1,25 мкмоль кг ^-1 день ⁻¹ в течение 14 дней), что ясно указывает на то, что крысы испытали химиотерапевтический синдром и повреждения, вызванные химиотерапией, что привело к болезни и потере массы тела, в то время как масса тела крыс, получавших MTX-CS NG (4,25 мг / кг ^-1 день ⁻¹ в течение 14 дней) было небольшое увеличение (рис. 6). Результаты показывают, что MTX-CS NG не вызывают побочных эффектов. Эти данные подтверждают целевую доставку метотрексата в опухолевую ткань посредством взаимодействия CD44-CS и снижают цитотоксичность препарата метотрексата.

Влияние MTX и MTX-CS NG на массу тела крысы. День первой инъекции считался днем ​​0. Физиологический раствор, метотрексат (1,25 мкмоль кг ^-1 день ⁻¹ ) и MTX-CS NG (4,25 мг кг ^-1 день ⁻¹ ) назначили другой день внутрибрюшинными инъекциями, соответственно, соответствующей группе. Результаты выражаются как среднее значение ± стандартная ошибка среднего и анализируются с использованием t контрольная работа. * P <0,05 по сравнению с датой в день 0

Для дальнейшего изучения токсичности in vivo NG MTX-CS был проведен гистологический анализ селезенки крыс, чтобы определить, вызывают ли NG MTX-CS повреждение ткани (фиг. 7). Срезы контрольной группы показали структуру нормальной селезенки, состоящей из белой пульпы (формы) и красной пульпы (RP) с фиброзными трабекулами (T), простирающимися в пульпу селезенки. Белая пульпа содержит периартериальные лимфоидные оболочки и фолликулы селезенки и окружена краевыми зонами, в то время как красная пульпа состоит из селезеночных канатиков и разделена синусоидами селезенки (рис. 7a и 7b). Группа, получавшая метотрексат, показала серьезное сужение как белой пульпы (черный ящик), так и RP. Отложения гемосидерина также можно обнаружить в группе, получавшей метотрексат (рис. 7c и 7d). В группе, получавшей MTX-CS NG, наблюдалось легкое сужение как белой пульпы (формы), так и RP без отложения гемосидерина. Как белая пульпа, так и красная пульпа показали небольшое сужение по сравнению с группой метотрексата (рис. 7e и ​​7f). Приведенные выше результаты показали, что НГ MTX-CS оказывают незначительное побочное действие на нормальные ткани [35, 36].

Влияние токсичности MTX и MTX-CS NG на селезенку крыс. Окрашенную H&E селезенку иссекали у мышей после 14 дней лечения после семи внутрибрюшинных инъекций. а , b Разделы контрольной группы. c , d Группа, получавшая метотрексат. е , f Группа, получавшая MTX-CS NG

Выводы

Таким образом, мы успешно изготовили самособирающиеся наногели для высокоэффективной доставки противоопухолевых лекарств. Наногели, конъюгированные с MTX-CS, имели размер около 200 нм, что показало хорошую стабильность и растворимость. MTX-CS NG показали более сильную и специфическую цитотоксичность, чем MTX. Эксперименты in vivo показали, что MTX-CS NG проявляют меньшую токсичность, чем MTX. MTX-CS NG могут улучшить противоопухолевый эффект при одновременном уменьшении побочных эффектов MTX. Благодаря свойству связывания CD44, конъюгаты хондроитинсульфат-лекарство могут быть многообещающей и эффективной платформой для улучшения растворимости труднорастворимых молекул лекарств, а также для активной и селективной адресной доставки в раковые клетки и опухолевые ткани.

Сокращения

¹ H ЯМР:

1H Ядерный магнитный резонанс

AFM:

Атомно-силовой микроскоп

CDMT:

2-хлор-4,6-диметокси-1,3,5-триазин

CS:

Хондроитинсульфат

DLS:

Динамическое рассеяние света

DMT-MM:

4- (4,6-диметокси-1,3,5-триазин-2-ил) -4-метилморфолиния хлорид

FTIR:

Инфракрасное преобразование Фурье

MTT:

3- (4,5-Диметил-2-тиазолил) -2,5-дифенил-2-H-тетразолий бромид

MTX:

Метотрексат

MTX-CS NGs:

Наногели метотрексат-хондроитинсульфат

НГ:

Наногели

NMM:

4-метилморфолин

ТЕМ:

Просвечивающий электронный микроскоп

THF:

Тетрагидрофуран

UV-vis:

Ультрафиолетовая и видимая спектроскопия