Кислотные микросреды в липосомах значительно повышают стабильность куркумина и противоопухолевую эффективность

Аннотация

Липосомы предлагают универсальную платформу для доставки биологически активных соединений, однако внутренняя нестабильность pH-чувствительных препаратов в физиологических условиях остается проблемой. Мы разработали липосомальную формуляцию, создающую кислую микросреду в своем водном ядре, тем самым защищая инкапсулированную полезную нагрузку. Куркумин-загруженные липосомы (Cur-LPs) с внутренними pH 2,5, 5,0 и 7,4 изготовили, все они демонстрировали сопоставимые размеры частиц (~300 нм), узкую полидисперсность (<0,2) и схожие in vitro профили выделения. Особенно, химическая целостность куркумина в 50 % фетальной теленьей сыворотке и его цитотоксичность против клеток HepG2 сильно зависели от внутреннего pH: Cur-LP-2,5 > Cur-LP-5,0 > Cur-LP-7,4. Эти находки демонстрируют, что кислый ядро внутри липосом — практичная и эффективная стратегия стабилизации pH-чувствительных терапевтиков.

Введение

Искусственные липидные везикулы, или липосомы, имитируют клеточные мембраны с фосфолипидным бислоем, окружающим водный интерьер, предлагая высокую загрузку препарата, биоразлагаемость и биосовместимость. Их амфифильная архитектура позволяет растворять гидрофобные препараты, защищая их от агрессивной внеклеточной среды. Поверхностная модификация дополнительно продлевает системное циркулирование или адресует полезную нагрузку к конкретным тканям, и несколько липосомальных формуляций получили клиническое одобрение.

Несмотря на эти преимущества, доставка препаратов, нестабильных при нейтральном pH, остается проблематичной. Конвенциональные липосомы обычно готовят в фосфатно-буферном растворе (ФБР) при pH 7,4, тем самым экспонируя pH-чувствительные грузы неблагоприятной среде. Куркумин, липофильный полифенол с мощными противовоспалительными и противоопухолевыми свойствами, иллюстрирует эту проблему: его плохая водорастворимость и pH-опосредованное деградация ограничивают клиническое применение. Поэтому создание кислой микросреды внутри липосомального ядра может сохранить целостность таких препаратов.

В этом исследовании мы использовали внутренний водный компартмент липосом для генерации настраиваемого градиента кислотности и оценили его влияние на инкапсуляцию, стабильность и противоопухолевую активность куркумина.

Методы

Материалы

Фосфатидилхолин из лецитина сои (инъекционного класса) приобрели в Shanghai Tai-Wei Pharmaceutical Co., Ltd.; холестерин — в Amresco; полоксамер 188 (F68) предоставила BASF (Китай); куркумин (≥ 98 %) — в Sigma; фетальная теленая сыворотка (FBS) — в HyClone. Все реактивы аналитического чистоты.

Подготовка куркумин-загруженных липосом

Cur-LPs производили методом тонкопленочного испарения с модификациями. Фосфолипиды (75 мг) и холестерин (5 мг) растворяли в 0,5 мл этанола, содержащего 2 мг/мл куркумина. Раствор смешивали с 5 мл 0,001 М ФБР (pH 2,5, 5,0 или 7,4), содержащим 1 % (масс.) F68 для сужения распределения размеров. После 1 мин магнитного помешивания при 35 °C смесь испаряли под вакуумом и в темноте 30 мин для удаления этанола. Последующая низкоскоростная центрифугация (3000 об/мин, 5 мин) удаляла свободный куркумин; осадок затем высокоскоростно центрифугировали (16 000 об/мин, 10 мин) и ресуспендировали в ФБР (pH 7,4). Полученные формуляции назвали Cur-LP-2,5, Cur-LP-5,0, Cur-LP-7,4; пустые липосомы готовили аналогично.

Характеризация

Динамическое рассеяние света (DLS) измеряло гидродинамический размер и индекс полидисперсности (PDI); дзета-потенциал оценивали электрофоретным рассеянием света (ELS) на Malvern Zetasizer Nano ZS90 при 25 °C. Эффективность инкапсуляции (EE) рассчитывали флуоресценцией после разделения инкапсулированного и свободного куркумина высокоскоростной центрифугацией.

Сканирующая электронная микроскопия

SEM-изображения (FEI INSPECT F) получали после 100-кратного разбавления дистиллированной водой, капельного наноси на стекло, высушивания на воздухе и золочения.

Физическая стабильность

Коллоидную стабильность оценивали мониторингом изменений размера и пропускания (550 нм) в течение 72 ч при 37 °C. Агрегация (термодинамическая) и седиментация (кинетическая) количественно определяли соответственно.

In vitro выделение

Выделение куркумина из Cur-LPs измеряли с использованием 10 кДа диализационного мешка в ФБР (pH 7,4, 0,1 % Tween 80) при 37 °C с 100 об/мин помешиванием. Пробы забирали в заданные интервалы, заменяли свежей средой и анализировали флуоресценцией (Ex 458 нм, Em 548 нм).

Химическая стабильность в сыворотке

Cur-LPs (10-кратно разбавленные) смешивали с 1 мл 50 % FBS и инкубировали при 37 °C, 100 об/мин. В заданные моменты аликвоты извлекали, смешивали с этанолом, центрифугировали и оставшийся куркумин количественно определяли флуоресценцией.

In vitro противоопухолевая эффективность

Клетки HepG2 посеяли 10 000 клеток/колонку в 96-колончатых пластинках, культивировали 24 ч в PRIM-1640 + 10 % FBS, промывали ФБР, затем обрабатывали 4 мкг/мл куркумина (свободного или инкапсулированного) в безсывороточной среде. Жизнеспособность оценивали через 1 и 3 дня CCK-8 тестом. Жизнеспособность выражали в % относительно необработанного контроля.

Статистика

Данные представлены как среднее ± SD (n = 3). Двусторонний t-критерий Стьюдента определял значимость; p < 0,05 считалось значимым.

Результаты и обсуждение

Характеризация липосом

Все Cur-LPs показали похожие размеры частиц (~300 нм) и PDI < 0,2 (рис. 1a). Зета-потенциалы были более отрицательными для Cur-LP-5,0 и Cur-LP-2,5 (~ −18 мВ) по сравнению с Cur-LP-7,4 (−9 мВ), отражая влияние внутренней кислотности на заряд поверхности (рис. 1b). Более высокая EE для Cur-LP-2,5 (74 %) против Cur-LP-5,0 (45 %) и Cur-LP-7,4 (64 %) предполагает, что закисленные интерьеры улучшают загрузку куркумина, возможно, из-за измененной растворимости при низком pH.

SEM визуализация подтвердила сферическую морфологию во всех формуляциях (рис. 2). Небольшая агрегация отмечена для Cur-LP-7,4, в согласии с его более низким дзета-потенциалом, а наблюдаемые SEM диаметры были меньше DLS значений из-за эффектов дегидратации.

Физическая стабильность

В течение 72 ч при 37 °C ни одна формуляция не показывала значительного роста размера или изменения пропускания (< 10 %), указывая на надежную термодинамическую и кинетическую стабильность независимо от внутреннего pH (рис. 3).

In vitro выделение

Куркумин быстро выделялся из свободного раствора (> 80 % за 6 ч), подтверждая, что диализационная мембрана не препятствовала диффузии. Cur-LPs демонстрировали устойчивое, почти нулевого порядка выделение, с ~30 % кумулятивным выделением за 72 ч (рис. 4). Линейная регрессия (R² > 0,99) подчеркивала согласованную кинетику выделения, выгодную для поддержания терапевтических уровней.

Влияние внутреннего pH на химическую стабильность

Инкубация в сыворотке выявила выраженную pH-зависимость: через 6 ч Cur-LP-2,5 удерживал 55 % куркумина, против 43 % (Cur-LP-5,0) и 34 % (Cur-LP-7,4) (рис. 5). Этот тренд зеркалит известную pH-чувствительность свободного куркумина. Кислый ядро, вероятно, подавляет ферментативную активность и защищает куркумин внутри липидного бислоя, который, вопреки ожиданиям, проникаем малой водной фазой, способной влиять на стабильность препарата.

In vitro противоопухолевая эффективность

Пустые липосомы слегка стимулировали пролиферацию HepG2 на 1 день, предполагая нутритивный эффект. Свободный куркумин показывал ограниченную цитотоксичность из-за плохой растворимости. Напротив, Cur-LPs значительно ингибировали рост клеток pH-зависимым образом: через 1 день жизнеспособность 80 % (Cur-LP-2,5 и Cur-LP-5,0) против 90 % (Cur-LP-7,4); через 3 дня жизнеспособность падала до 24 % (Cur-LP-2,5), 21 % (Cur-LP-5,0) и 39 % (Cur-LP-7,4) (рис. 6). Превосходство Cur-LP-2,5 согласуется с его более высокой EE и стабильностью.

Заключение

Модуляция внутренней кислотности липосом предлагает простую, но мощную стратегию усиления химической стабильности и терапевтической эффективности pH-чувствительных препаратов, даже для гидрофобных молекул, резидирующих в липидном бислое. Кислая микросреда, созданная в Cur-LP-2,5, не только сохранила куркумин от сывороточного деградации, но и усилила его противоопухолевую активность в клетках HepG2. Этот подход легко расширим на другие лабильные терапевтики, потенциально улучшая их клиническую производительность.