Переделка наркотиков

Ингибирование основной протеазы SARS-CoV-2

Разработка нового лекарства - дорогостоящий и длительный процесс. Сегодня, когда мир сталкивается с пандемией, существует острая необходимость в быстром поиске лекарств, которые останавливают распространение вируса. Переназначение лекарств предлагает привлекательную альтернативу этому длительному процессу, пытаясь определить, можно ли использовать лекарство, которое, как известно, безопасно для людей, для лечения новых заболеваний.

Хотя использование таких репозиционированных лекарств по отдельности может в конечном итоге не привести к значительному клиническому эффекту, осторожная комбинация лекарств, нацеленных на несколько белков, имеющих решающее значение для репликации и распространения вируса, может быть очень эффективной, как это было в случае с ВИЧ в 1990-х годах. Актуальный вопрос:какая комбинация будет более эффективной?

Здесь мы пытаемся понять структуру активного сайта протеазы SARS-CoV-2, сравнивая ее с существующими структурами протеазы SARS-CoV в комплексе с микромолярными ингибиторами, чтобы мы могли лучше понять ключевые взаимодействия, необходимые для создания хорошего ингибитора. для протеазы SARS-CoV-2.

Затем мы провели виртуальный скрининговый эксперимент с использованием библиотеки одобренных FDA препаратов, чтобы выяснить, могут ли некоторые из них связываться с протеазой. Мы изучили, как они, по прогнозам, связываются с протеазой SARS-CoV-2 и, таким образом, могут использоваться в комбинированной терапии.

Белки SARS-CoV – 2

Геном SARS-CoV-2 у больных пациентов был быстро выделен и секвенирован, что позволило получить последовательности возможных белков-мишеней. Эти белки имеют высокое сходство последовательностей с белками SARS-CoV, и первоначально исследовательские группы начали создавать модели гомологии. Сейчас мы видим, что становится все больше и больше экспериментально полученных (рентгеновских и крио-ЭМ) структур.

Одной из наиболее охарактеризованных лекарственных мишеней среди коронавирусов является основная протеаза:Mpro, также называемая протеазой 3CL. ¹ Наряду с папаин-подобными протеазами этот фермент необходим для процессинга полипротеинов, транслируемых с вирусной РНК. ² Он расщепляет аминокислотный остов в 11 сайтах расщепления на большом полипротеине 1ab (рис. 1).

Подавление активности этого фермента заблокировало бы репликацию вируса. Поскольку неизвестны человеческие протеазы с подобной специфичностью расщепления, ингибиторы этой мишени гораздо менее токсичны и вызывают побочные эффекты.

Дизайн лекарств на основе структуры для перепрофилирования лекарств:основная протеаза

Эта основная протеаза представляет собой гомодимер (рис. 2), и каждая субъединица содержит каталитическую диаду His41 / Cys145.

SARS-CoV-2 имеет 96,1% идентичности и 99% сходства с протеазой SARS-CoV. (Рис. 3) Существует только одно аминокислотное различие в активном сайте:остаток 46 в SARS-CoV-2 представляет собой серин, а не аланин в SARS-CoV.

Существует множество структур SARS-CoV Mpro в комплексе с лигандами, доступными в PDB, и все лиганды, которые имеют сродство к микромолярному связыванию, являются ковалентными лигандами.

Активные сайты основной протеазы высоко консервативны среди коронавирусов и обычно состоят из четырех сайтов (S1 ', S1, S2 и S4) ³ (Рис. 4).

В случае структур PDB 2ZU4 и 2GX4, для которых лиганды имеют значения Ki соответственно 0,038 мкМ и 0,053 мкМ, тиол цистеина 145 в сайте S1 'связывается с ингибиторами ковалентной связью. По сравнению с другими ингибиторами с более низким сродством, это кажется важным для более высокого сродства.

Тщательное изучение того, как все эти лиганды взаимодействуют с этой протеазой, может предоставить информацию о ключевых взаимодействиях, которые необходимо отслеживать при анализе результатов стыковки.

Виртуальный просмотр

Использование кристаллической структуры димера протеазы SARS-COV-2 с высоким разрешением в комплексе с ковалентно связанным пептидоподобным ингибитором N3, выпущенным в феврале (6LU7) ⁴ , мы использовали эту структуру для проведения виртуального скринингового эксперимента. Сокристаллизованный ингибитор N3 связывается в кармане связывания субстрата в расширенной конформации. (Рис. 5)

Мы начали с библиотеки, содержащей одобренные FDA препараты с 2684 соединениями. Мы сохранили соединения с молекулярной массой ниже 800 кДа и выполнили стыковку с GOLD из CCDC. Позже мы рассчитали энергии свободной связи с неявным растворителем CHARMM и GBMV. Для каждой позы мы сначала выполняли минимизацию лиганда In situ со сферой диаметром 14 Å для гибкости остатка и оценивали энтропию лиганда при расчете свободной энергии связывания. Большинство стыкованных соединений являются известными препаратами протеазы вируса гепатита С и ВИЧ. (Рис. 6)

Многие соединения устанавливают контакты в 4 субсайтах:S1, S’1, S2, S4, а некоторые - как с HIS 41, так и с CYS 145, особенно с ингибиторами протеазы ВИЧ.

Наилучшим показателем является троксерутин, флавоноид.

• Было показано, что флавоноиды ингибируют некоторые протеазы ⁵ а недавно IC ₅₀ значения были рассчитаны из зависимых от дозы кривых ингибирования гербацетина, рифолина и пектолинарина на SARS-CoV. Измеренные значения составили 33,17, 27,45 и 37,78 мкМ соответственно.

Дипиридамол (рис. 7), который занимает пятое место в рейтинге, недавно был упомянут в препринте «Терапевтические эффекты дипиридамола у пациентов с COVID-19 с дисфункцией свертывания крови», и было показано, что он подавляет репликацию HCoV-19 при EC50 100 нМ in vitro.

Рисунок 7 :3D-рендеринг и 2D-карта взаимодействия дипиридамола в основной протеазе. Присутствуют взаимодействия с каталитическими остатками, а также с некоторыми из остатков, упомянутых ранее для ингибиторов SARS-CoV.

В недавнем препринте сообщалось о клеточных анализах нескольких ингибиторов протеазы ВИЧ:«Нелфинавир подавляет репликацию тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 in vitro . . »

Приводим таблицу из препринта (Таблица 1). Это не IC50, а EC50, поэтому он не говорит о том, насколько хорошо эти молекулы связываются с протеазой. Однако это показывает, что все эти соединения ингибируют репликацию SARS-CoV-2, и некоторые из них более активны, чем другие.

Ритонавир и лопинавир взаимодействуют со многими остатками, которые ранее наблюдались в других соединениях, нацеленных на протеазу SARS-CoV (рис. 8 и 9). Хотя в настоящее время проводится несколько клинических испытаний комбинации этих двух молекул, к сожалению, нет доступных данных IC50 для ритонавира или лопинавира для SARS-CoV-2.

Рисунок 8 :Лучшая поза для ритонавира:и двухмерная диаграмма взаимодействия, показывающая, что ритонавир взаимодействует с двумя каталитическими остатками:CYS145 и HIS41, а также с GLU166, PRO168 и GLN189, как это видно с другими известными ингибиторами SARS-CoV.

Рисунок 9 :Лучшая поза для лопинавира:и двухмерная диаграмма взаимодействия, показывающая, что лопинавир взаимодействует с двумя каталитическими остатками:CYS145 и HIS41, но также с GLU166, PRO168 и GLN189, как это видно с другими известными ингибиторами SARS-Co V.

Нелфинавир (рис. 10) имеет высокую прогнозируемую аффинность связывания в наших расчетах, а также был охарактеризован против COVID19 в недавнем препринте:«Нелфинавир активен против SARS-CoV-2 в клетках Vero E6».

Второй препринт показывает, что атазанавир активен в отношении клеток, инфицированных SARS-CoV-2:«Атазанавир ингибирует репликацию SARS-CoV-2 и выработку провоспалительных цитокинов».

Структура PDB 6W63, содержащая новый ингибитор SARS-CoV-2, была опубликована после того, как мы начали эту работу (рис. 11). Нет опубликованной информации о сродстве связывания этого соединения с SARS-CoV-2 Mpro. Боковые цепи в сайте связывания имеют почти такую ​​же ориентацию, как и для 6LU7. Мы состыковали наши соединения и повторно оценили их с помощью подходов MMGBSA, как и раньше, и получили очень похожие результаты.

Рисунок 11 :Структура PDB 6W63:Основная протеаза SARS-CoV-2 в комплексе с ингибитором X77.

Перспективы

Сайт связывания протеазы SARS-CoV-2 очень большой, содержит четыре субсайта и может вмещать множество различных лигандов с умеренным сродством связывания. Как объясняется здесь, виртуальный скрининг является полезным инструментом для выявления возможных ингибиторов и может дать нам некоторое структурное объяснение того, как возможные ингибиторы могут взаимодействовать с протеазой.

Однако все эти гипотезы требуют подтверждения экспериментальными данными, такими как измерение IC50, для построения более надежных моделей.

Здесь мы не выполняли ковалентную стыковку, но поскольку наиболее активные соединения против протеазы SARS-CoV были ковалентными, это может быть требованием сильных ингибиторов. Ковалентные ингибиторы также обладают преимуществами по сравнению с обратимыми ингибиторами, такими как сильная аффинность к мишеням и увеличенная продолжительность жизни пациентов.

Чтобы лекарство было активным у пациента, нам необходимо учитывать другие фармакологические аспекты, такие как фармакокинетика. Необходимо будет оценить способность этих препаратов достигать целевых концентраций в плазме и легких после одобренного дозирования для людей.

В задачу данной работы не входило комментирование других исследований дизайна, основанного на структуре, поскольку это не было бы своевременным для текущей эпидемии. Наша цель состояла в том, чтобы оценить легко применимые терапевтические средства для потенциальных лекарств-кандидатов против COVID19.

Мы хотели бы поблагодарить Кембриджский центр структурных данных (CCDC) за разрешение использовать GOLD для виртуального просмотра в этой работе. GOLD доказал свою успешность в виртуальном скрининге, оптимизации лидов и определении правильного режима связывания активных молекул. Интерфейс для GOLD доступен в Discovery Studio.

ПОДГОТОВКА ПИЛОТОВ ОНЛАЙН-ТРУБОПРОВОДА Моделирование и имитация предлагает новые идеи для SARS-CoV-2