Наноглины: перспективная наноиммунная защита от COVID-19

Аннотация

Несмотря на многочисленные усилия, разработка эффективной вакцины от COVID-19 может занять длительное время. Традиционная и натуральная медицина, уже проверенная на людях, может стать более ранним решением. Опираясь на опыт исследовательской группы в использовании наноглинистых материалов как высокоаффинных носителей для лечения метастазов рака, меланомы и регенерации костной ткани, мы предлагаем применять эти наноглины для профилактики и лечения COVID-19. Благодаря высокой аффинности наноглины способны захватывать вирусы до того, как они свяжутся с человеческим рецептором hACE2. В данном исследовании с помощью молекулярного моделирования изучалось взаимодействие шиповидного белка коронавируса и hACE2 в присутствии и отсутствии наноглин. Результаты показали экстремально высокий уровень аффинности/сцепления между S-белком SARS-CoV-2 и наноглинами по сравнению с их взаимодействием с hACE2. Мы предполагаем, что эти наноглины, уже используемые как носители лекарств, могут вводиться как самостоятельное лекарственное средство («глины в чистом виде»). Также даны рекомендации для будущих ин витро и ин виво исследований.

Введение

Внезапное появление и стремительное распространение нового коронавируса SARS-CoV-2 серьезно повлияли на здоровье и жизни людей, а также критически ударили по мировой экономике. S-белок SARS-CoV-2 с высокой аффинностью связывается с ангиотензин-превращающей ферментой 2 (hACE2) человека, используя её как входной рецептор для проникновения в целевые клетки (Рис. 1a, b) [1]. Поверхностный шиповидный белок вируса медиарует проникновение коронавируса в клетки-хозяева. RBD-домен (рецептор-связывающий домен) S-белка SARS-CoV-2 специфически распознает hACE2 в качестве своего рецептора [2, 3]. Поверхность hACE2 содержит два «горячих пятна» связывания с вирусом, критически важных для взаимодействия с S-белком SARS-CoV-2. Естественные мутации в RBD SARS-CoV-2 окружают эти участки и регуляруют инфекционность, патогенез, межвидовые и межчеловеческие пути передачи вируса [2, 4, 5].

На данный момент не существует клинически одобренных вакцин или препаратов, специально направленных против SARS-CoV-2. Следуя стандартному протоколу разработки вакцины, может потребоваться значительно больше времени для создания эффективного препарата. Существует большой интерес к разработке терапевтических антител против SARS-CoV-2. Однако, несмотря на множество усилий, такие антитела пока не открыты [6], за исключением нескольких испытаний [7]. Одно из испытаний показало мощную нейтрализацию SARS-CoV-2 за счет связывания с RBD его S-гликопротеина [8]. В этом исследовании [8] рекомендовались антителовые коктейли — смеси разных антител — из-за их усиленного нейтрализующего эффекта. Однако использование антител от пациентов, перенесших SARS-CoV, для лечения инфекции SARS-CoV вызывало нежелательные реакции, такие как антителозависимое усиление (ADE), повышающее вирусную инфекционность и другие вредные иммунные ответы [7]. К тому же, основанный на опыте разработки вакцин от SARS-CoV и MERS, вероятность успеха текущих попыток для SARS-CoV-2 кажется невысокой. Поэтому натуральные/традиционные лекарства с историей безопасного приема людьми могут рассматриваться как один из вариантов лечения SARS-CoV-2. Будучи натуральным материалом с историей человеческого потребления, мы предлагаем использовать «высокозарядные наноглины» как блокираторы коронавируса и ингибиторы шипомедиатированного проникновения в человеческие клетки.

Наноглины — наноразмерные натуральные материалы, происходящие от минералов осадочных пород, обладают очень высокой аффинностью к бактериям и вирусам [9]. Из-за изоморфных замещений в своей молекулярной структуре эти наноглины демонстрируют зарядовый дефицит на своих поверхностях. Этот дефицит нейтрализуется молекулами воды и растворенными катионами (Рис. 2). Заряженная структура и большая площадь поверхности нанопчастиц глины придают им аффинность к заряженным сущностям, встречающимся на бактериальных поверхностях и бактериальных токсинах. Их уникальные биомедицинские свойства включают высокую адсорбцию, способность поглощать микробы и отсутствие токсичности. Каждый электрически активный глинистый минерал имеет свою уникальную морфологию, характеристики и поведение при взаимодействии. Наиболее изученное биомедицинское применение наноглин — служение носителями и комплексами для противораковых препаратов, таких как 5-фторурацил и трастузумаб [11–17]. Поэтому они являются потенциальной альтернативной медициной для ряда заболеваний [18–22]. Нанопчастицы глины, благодаря своим адгезивным свойствам, также использовались как носители для препаратов с удлиненным высвобождением [15, 23]. Наноглины успешно применялись для адсорбции и лечения коронавируса крупного рогатого скота и ротавируса [24]. Исследователи [25] интеркалировали метотрексат (MTX), противораковое средство, в анионную глину, создав наногибридный препарат. Они использовали метод копреципитации и последующей гидротермальной обработки для получения химически, структурно и морфологически четко определенного двумерного наногибрида препарат-глина. Другие ученые [26] обнаружили, что бентонитовые наноглины благодаря биосовместимости и высокой загрузочной способности могут использоваться для создания транспортных систем доставки препаратов. В этом исследовании они подготовили комплекс дохсорубицина с бентонитовым наноглином (DOX-Bent) для формирования системы внутриопухолевой химиотерапии меланомы с удлиненным высвобождением. Поскольку монтмориллонитовая глина в последнее время изучается как добавка и материал-носитель препаратов, эти наноглинистые композиты находят применение в различных дозировках, в основном для контролируемого высвобождения лекарства [27]. Исследователи [28] также открыли, что наноглины могут использоваться в современных двухфункциональных системах доставки лекарств (DDS) для повышения эффективности доставки и снижения токсичности дохсорубицина (DOX), применяемого при лечении рака щитовидной железы. Используя библиотеку из 12 однотипных фотощепливающихся амифильных янусовых дендримеров, ученые [29] разработали самоорганизующуюся световосприимчивую дендримерозную везикулярную платформу. Подобно наноглинам, поверхностно-модифицированные биологически активные вирусоподобные органические нановезикулы из (глико)дендримерозомов имеют структурные модификации, способствующие проявлению молекулярных взаимодействий SARS-CoV-2 и хозяина, помогающих вирусу избегать человеческой иммунной системы [30].

В ходе обширных предыдущих исследований мы разработали базовую характеристику и моделирование поведения заряженных глинистых минералов [31–33], их применение для контроля метастазирования рака [10], ин витро и ин виво исследования лечения меланомы [34], а также исследования кальциевого депонирования/регенерации кости [35]. В предыдущем исследовании авторов [35] было показано, что нанопчастицы глины обладают высокой аффинностью к заряженным поверхностям. Высокая аффинность наноглин и усиленное неспецифическое адгезивное притяжение раковых клеток делают наноглины благоприятными кандидатами для контроля метастазирования. В том исследовании мы продемонстрировали возможное использование двух заряженных глинистых минералов для контроля метастазирования раковых клеток: Na-монтмориллонит (SWy-3) и палигорскит (PFl-l). Дополнительно к выводам предыдущего исследования авторов [35] об использовании этих наноглин для контроля метастазирования рака, мы также, через ин витро и ин виво исследования, установили, что эти наноглины имеют ингибирующий эффект на клетки меланомы, в основном на их пролиферацию и жизнеспособность [34]. В этих предыдущих исследованиях, помимо лабораторных экспериментов, также выполнялись молекулярные симуляции взаимодействий наноглин и клеток. Эти симуляции обеспечивали оценку относительного уровня сцепления/аффинности во взаимодействиях с нанопчастицами глины и без них.

Основываясь на всем вышеизложенном опыте авторов по высокому аффинному потенциалу наноглин, мы предполагаем, что наноглины могут имитировать антитела и таким образом привлекать и поглощать коронавирусы до их взаимодействия с человеческим hACE2. Данная работа является первым шагом к установлению этого представления через подход молекулярного моделирования и симуляции. На основе результатов молекулярных симуляций также предоставлен план рекомендаций для следующих этапов ин витро и ин виво исследований. Поскольку эти наноглины также успешно используются как носители лекарств, мы также предполагаем, что они могут вводиться/приниматься внутрь как лекарство «глины в чистом виде», и поэтому предложили предварительную методику введения наноглин.

Материалы — Молекулы

Выбор и формулировка SARS-CoV-2 и hACE2

Молекулы S-шипа SARS-CoV-2 и hACE2 были получены с сайта банка белков RCSB [36–38]. Молекулярные модели S-шипа SARS-CoV-2 и hACE2, сформулированные в программе Materials Studio [39], показаны соответственно на Рис. 3a, b. Перед симуляциями эти молекулы были заряжены методом равновесия зарядов QEq программы.

Выбор и формулировка кристаллита наноглины

Для исследования был выбран Na-монтмориллонит — один из самых активных представителей смектитовой группы глинистых минералов. Na-монтмориллонит — слоистый филосиликатный глинистый смектит (Рис. 2). В коллоидной форме пространство между соседними слоями может содержать свободные натриевые, кальциевые или магниевые катионы, электростатически притяженные к внешним отрицательно заряженным поверхностям [40]. В сухом порошкообразном состоянии Na-монтмориллонит существует в виде эквидистанционных хлопьев/пластин размером примерно 0,5 × 0,5 × 0,001 мкм (Рис. 2a). Эти отрицательные заряды на их интеркалярных поверхностях балансируются катионами. В виде коллоидов интеркалярные катионы диссоциируют от частиц глины и ассоциируют с другими отрицательно заряженными поверхностями. Эти частицы также имеют положительно заряженные края из-за наличия разорванных связей на их концах. Морфология и дальнейшие характеристики этих наноглин приведены в Таблице 1, а формулировка их кристаллитов в программе Materials Studio объясняется ниже.

В программе кристаллиты Na-монтмориллонита формулировались на основе фундаментальных свойств, таких как КОК (катионно-обменная емкость), обменные катионы и интеркалярные заряды (Таблица 1). Размер молекулы/кристаллита выбирался на основе результатов анализа размера частиц методом динамического рассеяния света (DLS) [10]. Итоговая форма глинистого кристаллита, созданная в программе, показана на Рис. 3c. После подготовки этих кристаллитов в режиме проектирования программы с использованием врожденных свойств они заряжались методом равновесия зарядов QEq программы.

Методы — Молекулярные симуляции

Эта часть исследования заключалась в симуляции и оценке взаимодействий S-шипа SARS-CoV-2 с кристаллитами глины и с hACE2. Хотя эти модели могут не полностью воспроизводить реальные ин витро условия, они включены со всеми существенными взаимодействиями и вполне подходят для намеченного относительного и сравнительного исследования.

В программе сорбция и симуляции сформулированных конфигураций S-шипа SARS-CoV-2, кристаллитов Na-монтмориллонита и hACE2 проводились методами Монте-Карло (MC) и молекулярной механики (MM). Усиление аффинности во всех смоделированных конфигурациях оценивалось через вычисленную плотность сцепленной энергии (CED) — CED рассматривалась как мера сцепленности молекулярной системы. Из-за крупномасштабных вычислений, задействованных в симуляциях, эти расчеты выполнялись на высокопроизводительных вычислительных ресурсах (HPC) в KFUPM, КСа. Общая методология и выбор конкретных методов и параметров симуляции основывались на предыдущих исследованиях авторов [41–47], а детально описаны в последующем разделе.

Взаимодействия S-шипа SARS-CoV-2 с hACE2 и кристаллитами глины

Для симуляции взаимодействия S-шипа SARS-CoV-2 с кристаллитами глины различное количество кристаллитов Na-монтмориллонита сорбировалось на модели S-шипа. Для этих сорбционных симуляций в модуле Сорбции программы был выбран метод Метрополиса Монте-Карло. На каждом шаге сорбции кристаллиты глины занимают пространство вокруг модели S-шипа для снижения общей энергии комплекса. Требуемое количество кристаллитов сорбировалось максимум за 25 000 шагов, после чего энергия системы минимизировалась с помощью модуля Forcite программы на основе принципов МД. Аналогичный процесс сорбции повторялся для моделирования взаимодействия молекулы S-шипа SARS-CoV-2 с hACE2. В этом процессе молекулы hACE2 сорбировались вокруг RBD шипа S SARS-CoV-2. После завершения процесса сорбции энергия формулировки минимизировалась с помощью МД-модуля программы.

Модуль Forcite программы, включающий NPT-ансамбль (постоянное число частиц, давление и температура), использовался для МД-симуляций с модифицированным универсальным силовым полем [41]. Симуляции запускались на 5–30 пс с интервалом 0,5 фс или до достижения постоянного объема. Термостат Берендсена с константой затухания 0,1 пс использовался для контроля температуры во время симуляции. Во время МД-симуляций предполагаемая температура поддерживалась постоянной на уровне 310 К (37 °C) при атмосферном давлении (100 кПа). Барostat Берендсена с константой затухания 0,1 пс использовался для контроля давления системы. Методология Берендсена считалась наиболее подходящей для одиночных кристаллитов после нескольких испытаний с другими термостатами и баростатами, доступными в программе. В методе Монте-Карло параметры для соотношений обмена, конформации, вращения, трансляции и регенерации выбирались как 0,39, 0,2, 0,2, 0,2 и 0,2 соответственно с соответствующими вероятностями 0,39, 0,2, 0,2, 0,2 и 0,2. Амплитуды, адаптированные для вращения и трансляции, составляли 5° и 1 Å соответственно.

Измерение плотности сцепленной энергии (CED)

В данном исследовании оценка уровня аффинности/связывания в комплексах SARS-CoV-2-кристаллиты глины и SARS-CoV-2-hACE2 измерялась через изменения в CED. После сорбции кристаллитов глины и последующего выполнения молекулярной динамики для каждой конфигурации CED определялась с помощью опции плотности сцепленной энергии модуля Forcite программы. Авторы выяснили, что концепция CED, состоящая из общей, ван-дер-Ваальсовой и электростатической CED, может довольно точно объяснять различные молекулярные процессы и взаимодействия и моделировать степень аффинности/связывания, возникающую среди смоделированных комплексов [41–47]. Количественно CED определяется как количество энергии, необходимое для перехода 1 моль вещества из жидкой в газообразную фазу. Это также мера взаимной аффинности/притягательности молекул, выражаемая как электростатические и ван-дер-Ваальсовы силы, усредненные по NPT-ансамблю.

В модуле Forcite ван-дер-Ваальсовы энергии вычислялись с использованием атомных отсечений. В этом методе невалентные взаимодействия просто рассчитываются до отсекающего расстояния, а взаимодействия за пределами этого расстояния игнорируются. Для избежания разрывов, вызванных прямыми отсечениями, большинство симуляций используют функцию сглаживания для плавного отключения невалентных взаимодействий над диапазоном расстояний. Эффективный потенциал создается путем умножения фактического потенциала на функцию сглаживания. Выбор функции в промежуточном диапазоне критичен и должен быть непрерывно дифференцируем в этой области для расчета сил. В данном исследовании использовалась кубическая сплайн-функция сглаживания с шириной сплайна 1 Å и отсекающим расстоянием 12,5 Å.

Результаты и обсуждение

Финальная конфигурация комплекса SARS-CoV-2 S-hACE2 показана на Рис. 4a, а комплексы между шипом SARS-CoV-2 и различным числом кристаллитов Na-монтмориллонита — соответственно на Рис. 4b, c. Для целей сравнения общие CED различных пропорций/чисел кристаллитов глины на шипе SARS-CoV-2 и взаимодействие последнего с hACE2 нанесены на Рис. 5.

Основываясь на нашем опыте, мы гипотезировали, что наноглины, благодаря своим высоким адгезивным свойствам, могут также действовать как ингибиторы SARS-CoV-2. Они могут делать это за счет сильного ассоциирования с шипом S, присутствующим на SARS-CoV-2. Результаты, полученные от молекулярно-уровневых симуляций взаимодействий, указывают на то, что из-за очень высокой CED между SARS-CoV-2 и наноглинами по сравнению с первым и hACE2 (Рис. 5), они могут ингибировать взаимодействие SARS-CoV-2 с hACE2. Кроме того, из Рис. 5 можно сделать вывод, что степень ингибирования наноглинами увеличивается дозависимым образом.

Взаимодействия наноглин с S-шипом SARS-CoV-2

Авторы в своих более ранних исследованиях продемонстрировали роль наноглин в продвижении адгезии между раковыми клетками и их микруокружением и, следовательно, контроле метастазирования [10]. Измерения адгесии смеси 75/25 Na-монтмориллонита и палигорскита показали увеличение адгезии на 100% между раковыми клетками и белками внеклеточной матрицы (Рис. 6a). Соответствующее SEM-изображение связывания наноглинами клеток Raji и белков фибronectin показано на Рис. 6b. Выборка изображения выполнялась в режиме SEM на FEI ESEM-FEG XL-30 в Миллеровской школе медицины, Университет Майами, Флорида. Авторы также обнаружили в своих предыдущих исследованиях, что электростатические, ван-дер-Ваальсовы и ZP-притяжения, кажется, доминируют в процессах адгезии [10]. Мы заключаем, что те же механизмы также облегчили бы связывание адгезивных поверхностей наноглин с шипом SARS-CoV-2 (Рис. 7). ZP — мера тенденции к дисперсии или флокуляции в коллоидной форме, включая взаимодействия с другими компонентами, присутствующими в суспензионной среде. Как общее правило, дзета-потенциал более 30 мВ (как положительный, так и отрицательный) указывает на тенденцию к дисперсии, тогда как дзета-потенциал менее 5 мВ обычно приводит к агломерации. Более высокие тенденции к дисперсии ZP нанопчастиц глины, использованных в исследовании (−24 до −32 мВ), ведут к более высокой тенденции к дисперсии и, следовательно, к генерации большей площади поверхности, усиливающей взаимодействия с шипом SARS-CoV-2. Хотя, основанные на их ZP, нанопчастицы Na-монтмориллонита имеют гидрофильную природу, они в присутствии солей также способствуют вторичным механизмам адгезии между гидрофобными и гидрофильными поверхностями [10]. Следует также отметить, что эти нанопчастицы глины имеют высокую тенденцию к дисперсии благодаря своей гидрофильной природе и относительно более высоким отталкивающим кислотно-основным (AB) взаимодействиям (Таблица 1). Высокая дисперсия, в свою очередь, приводит к генерации высокой площади поверхности для увеличения притягательных взаимодействий. Более высокие площади поверхности способствуют более сильному притяжению за счет ван-дер-Ваальсовых сил и электростатических сил между противоположно заряженными поверхностями. Кроме того, хотя и в меньшей степени, положительно заряженные края частиц Na-монтмориллонита также электрически притягиваются к шипу S.

Результаты молекулярно-уровневых симуляций для взаимодействия шипа S SARS-CoV-2 с кристаллитами глины (Рис. 5) также подтверждают описанные выше поведения взаимодействий. Наблюдалось, что сорбция нанопчастиц глины приводит к формированию тесно взаимодействующих сильных полей ван-дер-Ваальсового притяжения. Эти поля ван-дер-Ваальсового притяжения создают более высокую CED конфигурации глина/SARS-CoV-2. Существенное увеличение общей CED после добавления кристаллитов глины (Рис. 5) также свидетельствует о очень высокой аффинности SARS-CoV-2 к этим частицам по сравнению с аффинностью последнего к hACE2.

Наноглины как псевдоантитела

Основываясь на всех текущих и прошлых исследованиях авторов, устанавливающих высокий аффинный потенциал наноглин, мы предполагаем, что наноглины могут имитировать антитела и таким образом привлекать и поглощать коронавирусы до их взаимодействия с человеческим hACE2. Антитела — это гликопротеины, синтезируемые плазматическими клетками как часть адаптивного иммунного ответа для помощи в очищении инфекции из организма. Антитела способствуют очищению инфекции множеством способов, таких как опсонизация патогенов для облегчения фагоцитоза, активация системы комплемента, агглютинация микробов и нейтрализация вирусов и токсинов. Когда они связаны с вирусными поверхностными белками, антитела предотвращают проникновение вирусов в клетку, препятствуя присоединению вирусов к их целевому рецептору на клетке. Связывание антител может происходить в разных местах на поверхностном белке, приводя к различным механизмам, вызывающим один и тот же эффект. В случае SARS-CoV-2 наблюдалось два механизма вирусной нейтрализации антителами [1, 48], показанные на Рис. 1c, d. Один из механизмов включает прямое связывание антител с местом присоединения SARS-CoV-2-RBD, в результате чего антитело конкурирует с целевым рецептором hACE2. Другой механизм включает связывание антител с другими участками RBD без конкуренции с целевым рецептором. Последний показан как вовлеченный в нейтрализацию наиболее мощным моноclonalным антителом (mAb), открытым в исследовании [1, 48]. Аналогично взаимодействию антител с RBD SARS-CoV-2, ингибирующем последнее от взаимодействия с hACE2, подготовлена подобная молекулярно-уровневая модель для наноглин, приводящая к похожему ингибированию коронавирусов и показанная на Рис. 8. Благодаря своей очень высокой аффинности наноглины будут притягиваться к шипам SARS-CoV-2 и таким образом ограничивать взаимодействие RBD этих шипов с hACE2.

Предлагаемая методика введения наноглин

Использование глины как носителей лекарств тестировалось многократно, давая многообещающие результаты малой или нульной цитотоксичности к клеткам человеческого тела. Каолинитовый глинистый минерал тестировался для использования в потенциальной системе доставки лекарств и показывал высокую биосовместимость и очень низкую цитотоксичность [11]. Цитотоксичность ин витро нанопчастиц поли(d,l-лактид-ко-гликолид)/монтмориллонит также демонстрировалась как пренебрежимо малая [14]. Нанокомпозиты палигорскит-полиэтиленимин-флуоресцеин изотиоцианат также показывали практически нулевую цитотоксичность ин витро [13]. Авторы также имели опыт подкожного введения наноглин для лечения меланомы во время ин виво исследований [34]. Основываясь на использовании глины как носителя противораковых препаратов и в других препаратах с удлиненным высвобождением [25–28], мы предлагаем, что наноглины могут вводиться как лекарство «глина в чистом виде» при условии верификации ин виво и клинических испытаний.

Хотя наноглины небиоразлагаемы, всестороннее понимание проектирования подобных неорганических нанопчастиц с их метаболической эффективностью в организме, проведенное в исследовании [49], также может классифицировать эти наноглины как неорганические агенты, выводимые из человеческого организма.

Заключение и рекомендации

Основываясь на всех текущих и прошлых исследованиях авторов, устанавливающих высокий аффинный потенциал наноглин, они могут имитировать антитела и таким образом привлекать и поглощать коронавирусы до их взаимодействия с человеческим hACE2.

Результаты молекулярно-уровневых симуляций для взаимодействия шипа S SARS-CoV-2 с кристаллитами глины приводят к формированию тесно взаимодействующих сильных полей ван-дер-Ваальсового притяжения. Эти поля ван-дер-Ваальсового притяжения создают более высокую CED конфигурации глина/SARS-CoV-2. Существенное увеличение общей CED после добавления кристаллитов глины также свидетельствует о очень высокой аффинности SARS-CoV-2 к этим частицам по сравнению с аффинностью первого к hACE2.

Мы предлагаем продолжить исследования путем проведения ин витро исследований взаимодействий между SARS-CoV-2 и различными процентами наноглин. На основе оптимальной дозы наноглины, разработанной на ин витро этапе, мы предлагаем провести ин виво исследования на животных. Животное исследование должно проводиться как с наноглиной, так и без нее для финализации дозы наноглины и должно заложить основу для клинических испытаний.

Доступность данных и материалов

Все данные, сгенерированные или проанализированные в ходе данного исследования, включены в эту опубликованную статью.