Повышение остеоиндуктивности с помощью нановолокнистых каркасов из шелкопряда, загруженных rhBMP-2, для инженерии костной ткани

Аннотация

Существует растущий спрос на формулировки каркасов из шелкопряда (ШП) для биомедицинских приложений. ШП кросслинковали глютаральдегидом с остеоиндуктивным рекомбинантным человеческим костным морфогенным белком-2 (rhBMP2) в разных соотношениях: (i) 3% ШП без rhBMP2 (ШП), (ii) 3% ШП с равным количеством rhBMP2 (ШП+BMP2), и (iii) 12% ШП с 3% rhBMP2 (4ШП+BMP2), и эти растворы использовали в электроспиннинге для изготовления нанокаркасов для оценки повышенного остеоиндуктивного потенциала каркасов из ШП с rhBMP2. Напряжение-деформация показала, что добавление rhBMP2 не снижает механическую прочность волокон, а механическая прочность каркаса улучшалась с увеличением концентрации ШП. Ассоциация rhBMP2 увеличила водоудерживающую способность каркаса, что видно из исследований набухания. Жизнеспособность hMSC была выше в конъюгированных каркасах, и каркасы не проявляли цитотоксичности по отношению к посадным клеткам. Клетки демонстрировали более высокую щелочную фосфатазу активность в конъюгированных каркасах in vitro и in vivo, что устанавливает повышенную остеоиндуктивность новой конструкции. Каркасы также оказались эффективными для in vivo костообразования.

Предыстория

Регенеративная способность кости позволяет восстанавливать небольшие переломы самостоятельно. Кость формируется, за которым следует сращение, и наконец, восстановление исходной формы и структуры кости. Однако эта способность ограничена, что создает потребность в ауто- или аллографтах для лечения. Аллографтинг подразумевает получение кости от отдельного донора, что может вызвать иммунологическую реакцию. Аутотрафтинг, где кость берется из собственного тела пациента, не создает иммунологических проблем, но ограничен достаточным количеством доступной кости.

Тканевая инженерия рассматривается как потенциальная технология для преодоления иммунологических ограничений алло- и аутотрафтинга. Специализированные клетки, такие как человеческие мезенхимальные стволовые клетки или остеосаркомные клетки (MG63), культивируют под подходящими условиями на предварительно изготовленном каркасе, и эта система клеток и каркаса затем используется как графт.

Каркас обеспечивает прикрепление и биохимическую нишу для выживания и пролиферации клеток. Необходимо учитывать такие свойства, как механическая прочность, остеоиндукция, биоресорбция, градинированная пористость и биосовместимость при выборе материала для изготовления каркаса. Остеоиндукция (индукция костообразования) — одно из требуемых свойств материала для каркаса инженерии костной ткани (ИКТ). Каркасы с остеогенными факторами мощны для имитации процесса регенерации костной ткани, связывающего ангиогенез и остеогенез, что может рекрутировать предшественниковые клетки и их дифференциацию. Костные морфогенные белки (BMP) — класс факторов роста, индуцирующих костообразование, предлагаются для применения в ИКТ вместе с деминерализованной костной матрицей (ДКМ) и фосфатами кальция.

Несколько групп сообщали об использовании металлов, керамики, синтетических полимеров и композитов, а также шелкопряда как потенциальных материалов для изготовления каркасов в ИКТ. Шелкопряд (ШП) сообщали как подходящий материал для изготовления каркасов для приложений тканевой инженерии благодаря своим замечательным механическим и биосовместимым свойствам. До настоящего времени не было опубликовано ни одного отчета, оценивающего ассоциативные преимущества BMP с электроспиннированными нанокаркасами из ШП.

Здесь мы сообщаем об изготовлении новых нановолокнистых каркасов из ШП, конъюгированных с рекомбинантным человеческим костным морфогенным белком-2 (rhBMP2). Каркасы сравнивали с чистыми каркасами из ШП для элucidции эффекта конъюгации rhBMP2 на остеоиндукцию. Также измеряли жизнеспособность и пролиферацию клеток для установления потенциала каркаса для новых и лучших приложений ИКТ.

Методы

Подготовка водных растворов ШП/BMP2

Сначала ШП изолировали из коконов шелкопряда, Bombyx mori, в виде водного раствора. Следовали установленному протоколу с незначительными модификациями. Коконы варили в 100 мл 0,02 М Na₂CO₃ в течение 20 мин, затем тщательно промывали дистиллированной водой для удаления избытка водорастворимых серицина и воска. Извлеченный фибрин растворяли в 9 М растворе литийбромида при 60 °C в течение 4 ч и далее диализировали против воды в течение 4 дней. Конечная концентрация определяли взвешиванием сухого вещества после сушки и составляла 7% м/об. Этот раствор затем использовали после концентрации до разных уровней диализом против 1 л 25% полиэтиленгликоля (ПЭГ, 10000 г/моль) при комнатной температуре. Разбавленные водные растворы ШП готовили разбавлением дистиллированной водой, и все растворы хранили при 10 °C до дальнейшей обработки. Лиофилизированный порошок рекомбинантного человеческого костного морфогенного белка-2 (rhBMP2) растворяли в ПБС (pH 3,8). Белковый раствор стерилизовали 0,22 мкм шприцевыми фильтрами и добавляли как водный раствор к каждому раствору фибрина с непрерывным перемешиванием. Кросслинкинг, посредствованный глютаральдегидом, использовали для ассоциации BMP с фибрином. Кратко, для 10 мл реакционной смеси 5 мл каждого 6% шелкопряда и 1% rhBMP2 кросслинковали с использованием 200 мкл глютаральдегида и 40 мкл 12 Н HCl как активирующего агента группы. С этой процедурой подготовили три раствора: (i) 3% шелкопряд без rhBMP2 (ШП), (ii) 3% шелкопряд с 0,5% rhBMP2 (ШП+rhBMP2), и (iii) 12% шелкопряд с 0,125% rhBMP2 как в (ii) (4ШП+rhBMP2). Эти растворы использовали в процедурах электроспиннинга для изготовления каркаса.

Изготовление каркаса электроспиннингом

Для изготовления каркаса каждый раствор загружали в 5-мл стеклянный шприц с нержавеющей иглой (25G, ВД 0,26 мм, Sigma Aldrich), подключенной к 5,5 кВ источнику постоянного тока. Для получения волокон скорость подачи поддерживали на уровне 0,4 мл/ч с помощью шприцевого насоса, а электроспиннированные волокна собирали на алюминиевой фольге, размещенной на расстоянии 15 см от кончика капилляра. Образцы собирали по 4 ч каждый.

Растровая электронная микроскопия

Для морфологического исследования изготовленных каркасов выполняли РЭМ на Zeiss EVO40SEM. Образцы напыляли золотом перед сканированием, изображения дальше обрабатывали. Определение диаметра волокна выполняли путем усреднения диаметров 10 случайных волокон в кадре изображения.

Механические свойства каркаса

Компрессионные эксперименты проводили для оценки механических свойств разработанных каркасов с использованием одно-колоночного настольного электромеханического тестера Instron (модель 3345, Instron, Canton, MA). Волокна с диаметром 0,2 мм, полученные электроспиннингом при более длительных длительностях, использовали для определения предельного напряжения и удлинения при разрыве из кривых напряжение-деформация при 25 °C и 50% влажности.

Исследование набухания

Для измерения коэффициента набухания каждую формулировку растворяли в ПБС (pH 7,4) при 37 °C. Образцы извлекали через заданные интервалы времени, и сухой вес измеряли электронными весами. Тест продолжали до достижения равновесного веса. Коэффициент набухания выражали как:

$$ \mathrm{Коэффициент}\ \mathrm{набухания}\left(\%\right)=\frac{W\mathrm{s}-W\mathrm{o}}{W\mathrm{o}} $$

где, W _o = начальный сухой вес нановолокнистых матриц и W _s = вес набухших нановолокнистых матриц в каждый момент времени.

Клеточная культура

Человеческие мезенхимальные стволовые клетки (hMSC) использовали в настоящем исследовании для оценки остеоиндуктивного потенциала изготовленных нанокаркасов. hMSC культивировали и поддерживали в DMEM с 10% фетальным теленьим сывороткой и 1% пенициллином, при 37 °C в 5% CO₂ увлажненной атмосфере до достижения 90% конфлюэнтности. Клетки трипсинизировали, центрифугировали и ресуспендировали в среде для квантификации.

Каркасы стерилизовали промыванием этанолом и облучением УФ-светом в течение 30 мин, затем промывали ПБС (pH 7,4). Каркасам давали обработку DMEM перед посевом клеток. 20 мкл клеточной суспензии добавляли капельно на каждый каркас и пластиковую пленку как контроль. Каркасы держали в покое в увлажненной атмосфере (37 °C, 5% CO₂) в течение 30 мин. Затем каркасы инкубировали в DMEM в течение 21 дня с регулярным пополнением среды каждый второй день.

Тест адгезии клеток

Для оценки адгезивной способности клеток с каркасом, количество неадгерированных клеток подсчитывали после 1, 3 и 6 ч начального посева по методу из литературы с незначительными модификациями. Клеточную среду собирали и подсчет клеток производили в гемоцитометре. Разница между начальным посевом и количеством неадгерированных клеток считалась количеством адгерированных клеток. Результаты выражали в процентах адгезии:

$$ \%\mathrm{Адгезия}=\frac{\mathrm{Начальный}\ \mathrm{посев}-\mathrm{число}\ \mathrm{не}\ \mathrm{адгерированных}\kern0.5em \mathrm{клеток}}{\mathrm{Начальный}\ \mathrm{посев}}\times 100 $$

Цитотоксичность тест

Для измерения токсического эффекта нановолокнистых матриц выполняли МТТ-тест. После соответствующего временного интервала конструкции инкубировали в МТТ растворе (1 мг/мл стоковый раствор, разбавлен в ПБС (pH 7,4) в соотношении 1:10) и инкубировали 4 ч. Жизнеспособные клетки конвертируют МТТ в формазановую соль в этот период инкубации. Формазановую соль растворяли добавлением ДМСО и держали 20 мин. Абсорбция, исходящая от формазановой соли, количественно измеряли записью изменений абсорбции при 570 нм с помощью микропластинчатого ридера.

Тест пролиферации клеток

Тест редукции красителя Аламар блу (AB) выполняли для определения пролиферации клеток внутри каркаса. Каркасы инкубировали в разбавленном с DMEM красителе 4 ч, и редукция красителя измеряли спектрофотометрически. Процент редукции AB рассчитывали как:

$$ \%\mathrm{AB}\ \mathrm{редукция}=\left[\left({\varepsilon}_{\mathrm{ox}}{\lambda}_2\right)\left(\mathrm{A}{\lambda}_1\right)-\left({\varepsilon}_{\mathrm{ox}}{\lambda}_1\right)\left(\mathrm{A}{\lambda}_2\right)/\left({\varepsilon}_{\mathrm{red}}{\lambda}_1\right)\left({\mathrm{A}}^{'}{\lambda}_2\right)-\left({\varepsilon}_{\mathrm{red}}{\lambda}_2\right)\left({\mathrm{A}}^{'}{\lambda}_1\right)\right]\times 100 $$

где, ελ ₁ = молярный коэффициент экстинкции аламар блу при 570 нм и ελ ₂ = молярный коэффициент экстинкции аламар блу при 600 нм, в оксидированной (ε _ox) и редуцированной (ε _red) формах. Aλ ₁ и Aλ ₂ обозначали абсорбцию тестовых колодцев.

A’λ ₁ = абсорбция негативного контрольного колодца при 570 нм.

A’λ ₂ = абсорбция негативного контрольного колодца при 600 нм.

АЛФ тест

Производство щелочной фосфатазы (АЛФ) культивированными hMSC внутри каркаса измеряли по протоколу производителя в наборе. Кратко, стерильный ПБС (pH 7,4) использовали для промывания и инкубации каркасов, за которыми следовала гомогенизация с 1 мл Трис-буфера (1 М, pH 8,0) и соникация 3 мин на льду. 25 мкл лизата затем инкубировали с 1 мл раствора p-нитрофенилфосфата (16 мМ) при 30 °C в течение 5 мин. Спектрофотометрические измерения выполняли при 405 нм для мониторинга производства p-нитрофенола в присутствии АЛФ.

In vivo АЛФ активность

Девять самцов атимических нудистых крыс, весом 100–120 г каждая, билитерально вскрывали брюшные мышцы для создания карманов. Модель нудистой мыши использовали для демонстрации остеоиндуктивного потенциала каркаса in vivo. По одному из каждого из трех типов каркасов (5 мм × 5 мм) резали и укладывали в мышечные карманы отдельно. Карман затем зашивали нерассасывающимся швом. Через 14 дней после операции импланты извлекали эксцизией прямых брюшных мышц и хранили в ПБС. Мышечные створки эксцидировали, и ткань эксплантата получали, которую гомогенизировали в экстракционном буфере для высвобождения щелочной фосфатазы. 50 мкл аликвоты раствора использовали для измерения активности АЛФ.

Статистический анализ

Все эксперименты проводили в трипликатах, и представленные данные отформатированы как среднее ± стандартное отклонение (СД) образцов, если не указано иное. Однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) выполняли с использованием статистического программного обеспечения Origin 6.0, для оценки неопределенных различий и значимых различий. P значение 0,05 или менее означает значимые различия между группами исследования.

Результаты

Морфология каркаса

РЭМ-изображения (Рис. 1) изготовленного каркаса раскрыли тонко сплетенную нановолокнистую структуру. Средние диаметры волокон в каркасах ШП и ШП+BMP2 казались схожими, варьирующимися от 100 до 900 нм при всех концентрациях, так как диаметр является функцией времени электроспиннинга, в то время как ШП нановолокна были однородными, а конъюгация BMP2 привела к неоднородности в диаметре волокна. Размер пор каркасов казался однородным в изготовленных каркасах и независимым от концентрации фибрина. Концентрация ШП не влияла на размер пор значимо.

РЭМ-микрографы подготовленных каркасов. a ШП. b ШП+rhBMP2. c 4ШП+rhBMP2

Механические свойства каркаса

Кривые напряжение-деформация нановолокнистых каркасов представлены на Рис. 2. Наблюдали, что добавление BMP не меняет механические свойства каркаса из ШП, но с увеличением концентрации материала изготовления (ШП) напряженные свойства матриц улучшались. Это может быть связано с формированием межволокнистых связей при кросслинкинге. Низкоконцентрационные волокна ШП таким образом не демонстрировали лучшей механической прочности по сравнению с более высокими.

Напряжение-деформация электроспиннированных нановолокон. Соотношение напряжение-деформация сравнивали между (a) ШП, (b) ШП+rhBMP2, и (c) 4ШП+rhBMP2 каркасом

Исследование набухания

Коэффициенты набухания как функция времени для каркасов представлены на Рис. 3. Каркасы хорошо набухали во времени единообразно изначально и достигали равновесия примерно за 380 мин. RhBMP2-связанные волокна впитывали больше воды по сравнению с каркасами только из ШП, что указывает на увеличение гидрофильных карманов из-за ассоциации BMP2. ШП волокна равновесировались на ~70%, в то время как волокна, содержащие BMP2, равновесировались на ~81% воды.

Свойство набухания изготовленного каркаса. Изменения в свойстве набухания ШП каркаса наблюдались после модификации с ШП+rhBMP2 и 4ШП+rhBMP2

Тест адгезии клеток

Адгезия клеток к каркасу необходима для роста клеток и индукции дифференциации. В этом исследовании мы наблюдали, что hMSC хорошо адгерировали к каркасам, и адгезия hMSC к 4ШП-BMP2, ШП-BMP2 и ШП каркасу представлена на Рис. 4.

Гистограмма, представляющая процент адгезии против времени для трех временных точек. Изменения уровня адгезии в (a) ШП, (b) ШП+rhBMP2, и (c) 4ШП+rhBMP2 каркасе

Была опасение потери адгезии в смешанном каркасе, которое было исключено наблюдаемыми результатами. Смешивание с BMP2 не снижает адгезивную способность каркаса. Как видно из Рис. 3, было хорошо понято, что с увеличением размера пор (уменьшением концентрации ШП) адгезия клетки к каркасу увеличивается. ANOVA среди трех формулировок значительно дифференцирует вариации в 3-й и 6-й часах. Однако значимых различий в 1-м часе не наблюдалось.

Цитотоксичность тест и тест пролиферации клеток

Жизнеспособность клеток была значительно повышена в rhBMP2-конъюгированных каркасах, и построенные каркасы не создавали никаких цитотоксических эффектов для посадных клеток (Рис. 4), и клетки хорошо пролиферировали во всех каркасах сравнительно (Рис. 5). Наблюдалась возрастающая тенденция жизнеспособности с количеством дней, и каркас ШП+BMP2 демонстрировал наименьшую токсичность в каждый временной пункт. ANOVA раскрыл значимые различия среди значений жизнеспособности клеток трех формулировок.

Тест жизнеспособности клеток, представленный как гистограмма для четырех временных точек. Тест жизнеспособности клеток выполняли МТТ-тестом, и результаты представлены как процент относительно контроля

С Рис. 6 можно изучить пролиферацию клеток. Клетки хорошо пролиферировали во всех трех подготовках каркаса с лучшим в ШП+BMP2 в каждый временной пункт. Более крупные поры в ШП + BMP2 каркасе обеспечивали максимальное пространство для роста клеток. Значимость различий среди групп была хорошо установлена из ANOVA.

Представление пролиферации клеток как процента редукции красителя аламар блу в четырех временных точках для ШП, ШП+BMP2, и 4ШП+BMP2

АЛФ тест

Активность АЛФ является стандартным маркером остеоиндуктивного свойства среды вокруг клетки. В нашем эксперименте мы наблюдали более высокую активность АЛФ в конструкциях ШП+BMP2 по сравнению с конструкциями только из ШП (Рис. 7). ШП наноструктурированные каркасы способны проявлять остеоиндукцию сами по себе, но, как видно из Рис. 7 и ANOVA, каркас ШП+BMP2 оказался лучшим среди каркасов. Концентрация АЛФ увеличивалась в ходе эксперимента, и конструкции с более высокой концентрацией ШП, однако, демонстрировали более низкую активность АЛФ по сравнению с конструкциями с более низкой концентрацией ШП.

Представление активности АЛФ среди трех разных стратегий изготовления каркаса в разные временные точки. (a) ШП (b) ШП+rhBMP2 (c) 4ШП+rhBMP2 каркас

In vivo АЛФ активность

Рис. 8 изображает активность АЛФ эксплантатов для (a) ШП, (b) ШП+rhBMP2, и (c) 4ШП+rhBMP2. Как ожидалось, эксплантаты от лечения, содержащего rhBMP2, индуцировали более высокую активность АЛФ, в то время как лечение без rhBMP2 каркасом давало более низкую активность АЛФ.

In vivo активность АЛФ эксплантатов, полученных после лечения. Модель нудистой мыши использовалась для демонстрации остеоиндуктивного потенциала каркаса in vivo

Обсуждение

Каркасная тканевая инженерия доказала свой потенциал в регенеративной медицине и пережила впечатляющий прогресс как инструмент для ИКТ. Предыдущие исследования установили решающую роль микроархитектуры и физических свойств структур в переводе in vitro спроектированных клеточно-каркасных конструкций в костную ткань.

Оптимальные механические свойства (размер пор, напряженная прочность и т.д.) и биосовместимость конструкций являются потенциальными характеристиками для колонизации и организации клеток. Представленная работа описывает изготовление и характеристику каркаса для инженерии костной ткани, используя комбинацию полезных свойств материалов, предлагаемых для этого. В то время как ШП обеспечивает подходящую прочную и биосовместимую платформу, встроенный rhBMP2 индуцирует формирование новых остеоцитов. ШП изучают обширно несколькими группами в разных формулировках для остеوبلastic клеток пролиферации и регенерации тканей, включая связки, сухожилия, хрящи, кость, печень, кожу, трахею, роговицу, нерв, барабанную перепонку и мочевой пузырь.

Мы использовали водные растворы ШП и ШП+rBMP2 для нашего исследования, так как водные растворы предпочтительнее органических растворителей для приготовления растворов ШП, поскольку деградация ШП неблагоприятна в органических растворителях. Электроспиннированные волокна ШП ранее сообщали как имеющие однородную структуру волокон с равномерным диаметром, и сетка высокая пористая с взаимосвязанными и перекрестно соединенными порами, что в близком соответствии с нашим исследованием. Не наблюдалось формирования бусиноподобных структур в волокнах ШП в наших каркасах и в ранее сообщенных. Диаметр чистого волокна ШП ранее сообщали как уменьшающийся с увеличением смеси; однако мы не наблюдали потери диаметра из-за смешивания. Но однородность волокна нарушалась в смешанных волокнах, возможно, из-за неравномерной ассоциации rBMP2 на волокнах ШП.

Достаточная механическая прочность — свойство, необходимое для тканевого каркаса. Смешивание чистого ШП увеличивало гибкость нановолокна в нашем эксперименте, и предыдущие отчеты также раскрывали схожую тенденцию в улучшении механических свойств при смешивании ШП с другими материалами для получения пригодных смешанных биоматериалов. Таким образом, наш изготовленный каркас обладает необходимой механической прочностью и гибкостью, требуемой в приложениях тканевой инженерии.

Каркасы для тканевой инженерии должны уметь прикреплять клетки, способствовать пролиферации клеток и остеоиндукции и быть наименее цитотоксичными для лучшей приемлемости. Ранние отчеты о каркасах из ШП установили их нецитотоксичность и клеткопролиферативную активность, и наши исследования были в близком соответствии с ранее сообщенными результатами.

Благодаря своим остеоиндуктивным свойствам, rhBMP2 используется в инженерии костной ткани несколькими группами. Эти исследования раскрыли, что клетки, культивированные на каркасах, содержащих BMP2, обладали более высокой активностью АЛФ, биомаркером остеоиндукции. Эффект ассоциации BMP2 лучше контрастировал по мере прогрессии времени инкубации. Kim et al. использовали BMP2-ассоциированные пористые микросферы и наблюдали похожее усиление остеоиндукции.

Заключение

Мы успешно изготовили волокнистые каркасы на основе ШП, содержащие rhBMP2. Эти каркасы были однородными и обладали адекватными механическими свойствами и биосовместимостью. Дальнейшая ассоциация rhBMP2 придавала остеоиндуктивный потенциал изготовленным каркасам. Каркасы дополнительно оценивали для in vivo применения и нашли пригодными для применения, вовлеченного в инженерию костной ткани.

Аббревиатуры

АЛФ:

Щелочная фосфатаза

ИКТ:

Инженерия костной ткани

hMSC:

Человеческие мезенхимальные стволовые клетки

rhBMP2:

Рекомбинантный человеческий костной морфогенный белок-2

ШП:

Шелкопряд