Композит углеродных квантовых точек с платиновым порфирином: двухфункциональный тераностический агент для усиленной фотофинамической терапии рака

Аннотация

Фотосенсибилизаторы (PS) известны своей гидрофобностью, ограничивающей клиническую пользу в фотофинамической терапии (PDT). Для преодоления этого мы спроектировали новый тераностический наноагент CQDs@PtPor, электростатически связав тетраплатинированный порфириновый комплекс (PtPor) с негативно заряженными углеродными квантовыми точками (CQDs). Комплексная характеристика (XRD, TEM, XPS, FTIR) подтвердила успешную сборку CQDs и PtPor в единую наноструктуру. Спектроскопический анализ раскрыл эффективный резонансный перенос энергии от CQDs к PtPor, приводящий к заметно усиленному производству одиночного кислорода (¹O₂). In vitro исследования на клетках HeLa продемонстрировали, что CQDs@PtPor достигает превосходной фотокситочности по сравнению с свободным PtPor, демонстрируя пренебрежимую тёмную цитоксичность, что подчёркивает его потенциал как безопасной и эффективной платформы для лечения рака.

Введение

PDT стала неинвазивной стратегией лечения кожных заболеваний, макулярной дегенерации и различных раков. Терапия опирается на свет-активированные PS, генерирующие реактивные виды кислорода (ROS) при облучении, селективно убивающие опухолевые клетки, щадя здоровые ткани. Хотя активируемые PS, такие как порфириновые и фталоцианиновые производные, могут выполнять двойную роль в визуализации и терапии, их клиническое применение затруднено плохой водной растворимостью, длительной кожной фотосенсибилизацией, ограниченным проникновением в ткани и неоптимальным поглощением за 700 нм. Различные наноносцы — липосомы, полимерные наночастицы, золотые наночастицы, углеродные нанотрубки, графен и углеродные квантовые точки (CQDs) — исследовались для улучшения доставки и производительности PS.

CQDs, универсальный класс углеродных наноматериалов, демонстрируют исключительные оптические свойства, высокую водную растворимость, низкую токсичность, отличную биосовместимость и лёгкую поверхностную функционализацию. Их обильные поверхностные группы позволяют ковалентное или нековалентное присоединение лекарств, белков или таргетирующих лигандов, делая их привлекательными носителями для тераностических приложений. Предыдущие исследования демонстрировали, что CQDs, конъюгированные с PS (например, Ce6, ZnPc, TMPyP), могут улучшать флуоресцентную визуализацию и фотофинамическую эффективность через механизмы переноса энергии.

Недавно тетраплатинированный порфириновый комплекс проявил низкую тёмную цитоксичность, но IC₅₀ значений всего 19 нМ при облучении 420 нм, указывая на мощную антираковую активность. Однако его гидрофобность и ограниченная биосовместимость исключают клиническое использование. Мы поэтому спроектировали CQDs@PtPor для использования растворимости и поверхностной химии CQDs с сохранением терапевтической потенции PtPor. Электростатическая сборка между положительно заряженным PtPor и негативно заряженными CQDs не только улучшает водную диспергируемость, но и способствует переносу энергии, тем самым усиливая генерацию ¹O₂ и фотокситочность.

Методы

Материалы
Транс-платина диаммин дихлорид (транс-платин) (Aladdin®), 1,3-дифенилизобензофуран (DPBF) (Sigma-Aldrich), и все растворители приобретены у Tianjin Fu Chen Chemical Reagents или Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Все реактивы использовались как получены.

Синтез [Trans-PtCl(NH₃)₂]₄-5,10,15,20-Тетра(4-пиридил)-Порфирин Нитрат

Транс-платин (0,193 ммоль, 58 мг) и AgNO₃ (0,193 ммоль, 33 мг) растворяли в 5 мл DMF и помешивали 24 ч. Полученный белый осадок AgCl удаляли центрифугированием, получая прозрачный раствор. Его добавляли к суспензии 5,10,15,20-Тетра(4-пиридил)порфирина (0,487 ммоль, 30 мг) в 3 мл DMF, с последующей перемешивкой при 50 °C в течение 48 ч. После охлаждения добавляли 10 мл диэтилового эфира для выпадения красного продукта, который вымывали метанолом, дихлорметаном и эфиром. Сушка под вакуумом дала 81 мг продукта (86% выход). Структура подтверждена ¹H NMR и ESI-MS.

Подготовка CQDs

Лимонная кислота (0,45 г) и этилендиамин (500 мкл) растворяли в 10 мл DI воды и подвергали гидротермической обработке при 200 °C в течение 5 ч в PTFE-автоклаве. Получившийся коричнево-чёрный раствор очищали центрифугированием и диализом против DI воды для получения CQDs.

Подготовка композита CQDs@PtPor

PtPor (20 мг в 3 мл DMSO) диспергировали в 12 мл воды и медленно добавляли к суспензии CQDs (5 мг в 15 мл H₂O) под ультразвуком. Смесь помешивали при комнатной температуре 24 ч, затем очищали центрифугированием и диализировали 2 дня. Финальный водный раствор лиофилизировали при 4 °C для получения композита.

Измерение квантового выхода

Квантовый выход CQD (Φ) рассчитывали относительно сульфата хинина (Φ_st ≈ 54%) стандартным сравнительным методом. Абсорбция держали ниже 0,1 при 360 нм для избежания эффектов реабсорбции.

Генерация одиночного кислорода

Образцы (5 мг/мл) смешивали с 10 мМ DPBF в 3-мл кювете и облучали 50 Вт ксеноновой лампой (длинноволновый фильтр 500 нм, 6 мВт/см²) до 30 мин. Уменьшение абсорбции DPBF при 415 нм отслеживали каждые 3 мин для квантификации ¹O₂ производства. DCFH флуоресценция (λ_эм = 525 нм) также использовалась как качественный зонд.

Цитоксичность анализы

Клетки HeLa культивировали в DMEM с 5% FCS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37 °C, 6% CO₂. Для тёмной цитоксичности клетки инкубировали с варьирующими концентрациями CQDs, PtPor или CQDs@PtPor в течение 24 ч, затем оценивали MTT анализом. Для фотокситочности клетки облучали после 24 ч инкубации, и жизнеспособность снова определяли MTT.

Клеточная визуализация

Клетки HeLa (5 × 10⁴ клеток/мл) инкубировали с 0,25 мг/мл CQDs@PtPor в течение 1 ч, вымывали и визуализировали конфокальной микроскопией (Zeiss LSM7 DUO) с 405 нм лазером.

Результаты

Подготовка и характеристика CQDs@PtPor

Трансмиссионная электронная микроскопия (TEM) раскрыла равномерные, монодисперсные частицы: CQDs в среднем 2,5 нм, в то время как CQDs@PtPor в среднем 7,6 нм, отражая адсорбцию PtPor (Рис. 1). XRD паттерны показали широкий пик при ~23°, указывающий на аморфную углеродную структуру. FTIR спектры подтвердили наличие гидроксильных, аминовых и амидных групп (Рис. 2b). Динамическое рассеяние света (DLS) измерило средний гидродинамический диаметр 9,2 нм для CQDs@PtPor, подтверждая данные TEM. Зета-потенциал сместился с -15,6 мВ (свободные CQDs) на +4,5 мВ после конъюгации PtPor, подтверждая электростатическую связь (Рис. 3d).

Композит углеродных квантовых точек с платиновым порфирином: двухфункциональный тераностический агент для усиленной фотофинамической терапии рака — Рисунок 1. TEM изображения (слева) и гистограммы распределения размеров (справа) a) CQDs и b) CQDs@PtPor.

Фотофизические свойства

UV-Vis спектры показали характерную CQD абсорбцию (~360 нм) и порфириновые Соре/Q полосы (~425, 520, 580 нм). CQDs демонстрировали возбуждение-зависимую фоtolюминесценцию (PL) со смещением эмиссии от 460 до 552 нм при возбуждении 280–500 нм, и квантовым выходом 36%. В композите PL интенсивность при 500 нм снижалась, в то время как эмиссия при 660 нм увеличивалась, свидетельствуя об эффективном флуоресцентном резонансном переносе энергии (FRET). Измерения флуоресцентного времени жизни подтвердили сокращение донорского времени жизни в CQDs@PtPor, дополнительно подтверждая перенос энергии (Рис. 4).

Усиленное производство одиночного кислорода

Опыты с деградацией DPBF раскрыли, что CQDs@PtPor производит значительно больше ¹O₂, чем свободный PtPor, в то время как CQDs в одиночку показывали пренебрежимую активность (Рис. 5a). DCFH флуоресценция подтвердила эти находки, с CQDs@PtPor дающим самый сильный сигнал (Рис. 5b).

Фотокситочность в клетках HeLa

Анализы тёмной цитоксичности показали >90% жизнеспособность при 50 мкг/мл для всех образцов (Рис. 6a). Фотокситочность анализы, однако, продемонстрировали дозо-зависимое снижение жизнеспособности: CQDs@PtPor при 50 мкг/мл достигло только 8% выживания, превосходя PtPor (18%) и CQDs (90%) (Рис. 6b). Эта превосходная эффективность атрибутируется усиленному ¹O₂ поколению, посредническому CQDs.

Клеточное поглощение и стабильность

Конфокальная визуализация раскрыла, что CQDs@PtPor локализуется преимущественно в цитоплазме клеток HeLa, с голубой CQD флуоресценцией, перекрывающей красную PtPor эмиссию, указывающей на стабильную форму комплекса после поглощения (Рис. 7).

Обсуждение

Ярко выраженный FRET от CQDs к PtPor, подтверждённый снижением донорской эмиссии и сокращением времени жизни, напрямую переводится в более высокое ¹O₂ производство и усиленную фотокситочность. Малый размер (~10 нм) CQDs@PtPor облегчает накопление в опухоли через эффект усиленного проникновения и удержания (EPR), в то время как улучшенная водная диспергируемость и биосовместимость снижают системную токсичность. Модульная природа электростатической сборки позволяет легкую замену разных PS или таргетирующих лигандов, позиционируя CQDs@PtPor как универсальную платформу для персонализированного PDT.

Заключение

Мы успешно изготовили наноагент CQDs@PtPor, сочетающий превосходные оптические свойства CQDs с мощной антираковой активностью тетраплатинированного порфирина. Композит демонстрирует высокую водную стабильность, низкую тёмную токсичность, эффективный перенос энергии и заметно усиленную фотофинамическую эффективность in vitro. Эти атрибуты делают CQDs@PtPerspective кандидатом для будущей клинической трансляции в лечении рака.