Экологически совместимые биоконъюгированные наночастицы золота в качестве эффективных контрастных агентов для визуализации рака, вызванного воспалением

Аннотация

Для многих видов рака раннее выявление является ключом к увеличению выживаемости и снижению заболеваемости, которая связана с радикальными резекциями из-за поздней диагностики. Здесь мы описываем эффективность первичных конъюгированных с антителами наночастиц золота (AuNP) для специфического воздействия на хронические воспалительные процессы, особенно на макрофаги M2, в участках тканей язвенного колита (UC) и стеатогепатита у крыс, которые могут привести к колоректальному раку и карциноме печени. соответственно. В этом исследовании мы демонстрируем, что AuNP, синтезированные простым, недорогим и экологически безопасным методом, могут быть легко конъюгированы с антителами против COX-2, анти-MIF и Alexa Fluor® 488 (ALEXA) для иммунофлуоресцентного окрашивания воспаленных участков. ткани. Более того, мы показали, что первичные антитела, конъюгированные с наночастицами золота (AuNP), могут быть использованы для нацеливания на макрофаги M2 с помощью проточной цитометрии. Мы разработали три протокола иммунофлуоресцентного окрашивания среза ткани с AuNP в течение 30 минут и инкубации в течение ночи, а также один протокол проточной цитометрии для мечения макрофагов M2 с AuNP в течение 30 минут. Результаты иммунофлуоресценции и проточной цитометрии позволяют предположить, что конъюгация была достигнута путем прямой адсорбции антител на поверхности AuNP. По сравнению со стандартным протоколом ALEXA в иммунофлуоресценции (IF) и проточной цитометрии (FC) наш 30-минутный протокол инкубации с использованием AuNP вместо ALEXA снизился примерно с 23 до 5 часов для IF и с 4 до 1 часа для FC, оказался менее трудоемким, что делает этот метод подходящим для диагностики рака, вызванного воспалением.

Введение

В медицинских и биологических исследованиях возрастает интерес к золотым наночастицам (AuNP) для исследований в оптической микроскопии и диагностических процедур, особенно для конфокальной лазерной микроскопии. Использование конъюгатов антитело / AuNP позволяет в реальном времени обнаруживать поглощение золота живыми клетками (например, раковыми клетками) на уровне отдельных частиц, что позволяет оценить внутриклеточные количества NPs [1,2,3].

Физико-химические свойства AuNP позволяют использовать их во многих медицинских исследованиях, таких как геномика, биочувствительность, иммуноанализ, клиническая химия, обнаружение и фототермолиз микроорганизмов и раковых клеток [1]. Фолк и Тейлор [4] описали первый метод конъюгации антител с коллоидным золотом для прямой электронной микроскопической визуализации поверхностных антигенов сальмонелл. С тех пор было разработано множество исследований, направленных на применение наночастиц, конъюгированных с биомакромолекулами, такими как антитела, лектины и ферменты, в различных областях, например, в биохимии, микробиологии, иммунологии и морфологии [1, 4]. В исследованиях рака используются высокоспецифичные и чувствительные контрастные вещества на основе AuNP как для рентгеновских лучей, так и для оптических изображений, поскольку AuNP способны увеличивать интенсивность флуоресценции конъюгированных молекул [5, 6].

В 2014 году мы продемонстрировали, что AuNP можно применять для метода непрямого иммунофлуоресцентного (ПФ) окрашивания в культурах клеток [6]. В настоящем исследовании мы описываем три новых метода иммунофлуоресцентного (IF) окрашивания с использованием AuNP. Здесь мы используем срезы тканей и сравниваем интенсивность флуоресценции каждого из этих методов со стандартным протоколом окрашивания антителом Alexa Fluor® 488 (ALEXA) (A1) с целью оптимизации флуоресцентного метода для клинического применения [7,8,9 ].

Флуоресцентная визуализация (FI) для нацеливания на раковые клетки использует различные технологии оптической визуализации, чтобы улучшить обнаружение ранней неоплазии на основе молекулярных сигнатур, специфичных для рака [10]. С 2013 года наблюдается стремительный рост количества клинических испытаний с использованием FI. Скрининг обычно рассматривается для пациентов из группы высокого риска, который основан на сочетании факторов образа жизни, генетики или личного анамнеза заболевания, в то время как наблюдение предназначено для пациентов с диагнозом дисплазия / хроническое воспаление или пациентов с подозрением на злокачественное новообразование. FI может помочь в выявлении злокачественных новообразований с повышенной специфичностью и чувствительностью по сравнению с доступными в настоящее время методами. Кроме того, скрининг на основе FI может обеспечить менее инвазивный и более экономичный способ обнаружения раковых или предраковых поражений. В частности, способность FI выявлять поражения раньше, чем традиционные методы скрининга, приведет не только к улучшенным результатам лечения, но и к снижению затрат на лечение, поскольку это предотвратит потребность в мультимодальной помощи, которая требуется для тех, кто диагностирован на более позднем этапе [11] . В этом исследовании мы демонстрируем, что конъюгаты антитело / AuNP могут успешно применяться для визуализации хронического воспаления с помощью флуоресцентной микроскопии.

Методы / экспериментальные

Цель исследования

Цель этого исследования - продемонстрировать, как флуоресцентные свойства наночастиц золота могут быть использованы в методах IF и проточной цитометрии. Кроме того, мы сравнили протоколы, протестированные с AuNP, со стандартным протоколом с использованием ALEXA и доказали, что можно использовать AuNP в протоколе, который быстрее, но столь же надежен, как стандартный протокол.

Химические вещества и реагенты

Трихлорид золота (30 мас.% В HCl), поливинилпирролидон (PVP, MW =10.000), гидроксид натрия, целлюлозная мембрана диализных трубок и глицерин были продуктами Sigma-Aldrich Chemical Co (Сент-Луис, США). Серная кислота и перекись водорода были приобретены у Vetec (Рио-де-Жанейро, Бразилия). Забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) и бычий сывороточный альбумин (BSA, 5%) были приобретены у Life Technologies Corporation © (Калифорния, США). Анти-ЦОГ-2 (циклооксигеназа-2 ) и первичные антитела против MIF (фактор ингибирования миграции макрофагов) были приобретены в Santa Cruz Biotechnology (Сан-Паулу, Бразилия), тогда как вторичные антитела козьих анти-крысиных IgG H&L Alexa Fluor® 488 были приобретены у ABCAM® (Кембридж, Великобритания). Монтажную среду Fluoroshield с DAPI (20 мл) от ABCAM® (Кембридж, Великобритания) использовали для контрастного окрашивания ДНК.

Получение и характеристика AuNP и флуоресцентная спектроскопия

Сферические AuNP (7,1 нм) были получены и охарактеризованы в соответствии с исследованием Gasparotto et al. [12]. Вкратце, вся стеклянная посуда хранилась в КМно ₄ + Раствор NaOH на ночь, промыть деионизированной водой, хранить в H ₂ О ₂ + H ₂ SO ₄ решение (1:1 v / v ) в течение 10 мин, снова промыть деионизированной водой и высушить перед использованием. ПВП (0,20 г) и хлорид золота (6,80 мг) растворяли в 10 мл воды. В отдельном стакане глицерин (0,18 г) и NaOH (0,080 г) растворяли в 10 мл воды. Затем раствор глицерин-NaOH добавляли к AuCl ₃ -PVP до следующих конечных концентраций:1,0 ммоль / л ^-1 Au ³⁺ , 0,10 М NaOH, 0,10 М глицерин и 10 г / л ^-1 PVP. Конечная смесь имела темно-красный цвет из-за образования AuNP. Спектры поглощения AuNP в коллоидном ультрафиолетовом и видимом диапазонах регистрировали на спектрофотометре Evolution 60S UV-visible (Thermo Scientific, MA, США). Флуоресцентную спектроскопию проводили на спектрофлуорофотометре RF-5301 PC (Shimadzu, Kyoto, Japan).

Экспериментальный дизайн

Все три протокола были протестированы на контрольных группах двух моделей хронического воспалительного процесса, язвенного колита, вызванного уксусной кислотой (ЯК) [7], и вызванного алкоголем стеатогепатита [8, 9] у крыс.

ЯК, индуцированный уксусной кислотой, проводили на самках крыс линии Wistar (220 ± 20 г массы тела), полученных из Биотехнологического центра / Федерального университета Параиба. Животные были разделены на две группы ( n =5 на группу):контрольные крысы с уксусной кислотой и неколитические крысы. Животных не кормили в течение ночи и анестезировали кетамином (70 мг / кг, 10%) и ксилазином (10 мг / кг, 2%). ЯК индуцировали в соответствии с методами, первоначально описанными MacPherson и Pfeiffer [13] и модифицированными Millar et al. [14]. Катетер осторожно вводили в толстую кишку. Затем в просвет толстой кишки закапывали 10% уксусную кислоту (0,5 мл) в 0,9% физиологическом растворе. Группа, не страдающая колитами, получала 0,5 мл 0,9% физиологического раствора внутриклеточно. Крыс содержали в положении Тренделенбурга лежа на спине в течение 30 секунд, чтобы предотвратить утечку интра-толстой инстилляции.

Животных не кормили в течение ночи и умерщвляли передозировкой тиопентала через 48 часов после индукции. Затем толстую кишку удалили в асептических условиях, промыли PBS и поместили на ледяную пластину. Толстую кишку очистили от жира и брыжейки. Затем каждый образец взвешивали и измеряли его длину при постоянной нагрузке (2 г). После этого толстую кишку открывали в продольном направлении и оценивали макроскопически видимые повреждения по шкале от 0 до 10 в соответствии с критериями, описанными Bell et al. [15].

Алкогольный стеатогепатит был индуцирован у самцов крыс линии Wistar (290 ± 10 г МТ), полученных от Департамента биофизики и фармакологии Федерального университета Риу-Гранди-ду-Норти (UFRN). Животные были разделены на две группы ( n =5 на группу):алкогольные и безалкогольные крысы. Раствор этанола (7 г / кг массы тела 30% v / v ) использовалась как постоянная доза для группы алкоголиков. Животные в группе безалкогольных напитков перорально получали через желудочный зонд эквивалентный объем физиологического раствора (0,9% NaCl). Процедуры через желудочный зонд выполнялись один раз в день в обеих группах в течение 28 дней.

На 29 день эвтаназию проводили внутрибрюшинной инъекцией 7,5 мл / кг кетамина (50 мг / мл) и 2,5 мл / кг ксилазина (20 мг / мл). Перед эвтаназией все группы животных не голодали в течение 12 часов. После потери сознания животные подверглись пункции сердца с последующим удалением печени. Фрагменты печени были погружены в 10% забуференный формальдегид для гистопатологического анализа.

Животных с вызванным уксусной кислотой ЯК и вызванным алкоголем стеатогепатитом содержали в стандартных условиях (12-часовой цикл свет / темнота, 22 ± 0,1 ° C и влажность 50–55%) с ad libitum доступ к пище и воде. С животными обращались в соответствии с этическими принципами проведения экспериментов на животных.

Гистология

Для непрямого IF-окрашивания использовали пять блоков парафина из положительных контролей (контроль уксусной кислоты и контроль спирта) каждой модели воспаления. Было обнаружено, что первичные антитела против ЦОГ-2 и анти-MIF являются хорошими маркерами воспаления при ЯК, вызванном уксусной кислотой, и стеатогепатите, вызванном алкоголем, соответственно, обеспечивая надежное окрашивание с точки зрения интенсивности флуоресценции, которое можно использовать для сравнения различных протоколы.

Ткани фиксировали в 10% забуференном формальдегиде, обезвоживали этиловым спиртом (70%, 80%, 90%, 95% и P.A.), осветляли в ксилоле и пропитывали парафином по стандартному протоколу [8]. Перед приготовлением срезов для непрямого окрашивания IF предметные стекла выдерживали в печи при 60 ° C в течение 24 часов.

Дизайн иммунофлуоресценции и протоколов

Три среза ткани (4 мкм) каждого животного депарафинизировали в ксилоле и промывали серией убывающих концентраций этанола, от 99% этанола до 50% этанола. Наконец, срезы тканей дважды промывали dH ₂. O и одна промывка PBS. Извлечение антигена выполняли путем помещения срезов в 10 мМ цитрат натрия с 0,05% Tween 20 при 95 ° C на 30 минут, а затем при комнатной температуре (RT) на 20 минут. Фоновый шум / сигнал снижали путем инкубации срезов в 0,1% суданской сажи в 70% спирте при комнатной температуре в течение 20 минут с последующими тремя промываниями 0,02% PBS-Tween 20. Образцы были проницаемы в 0,2% Triton-X-100 в PBS (три промывки, по 5 минут каждая), промывали PBS, а затем блокировали PBS, 5% BSA, dH ₂ О и Тритон-Х-100. Предметные стекла инкубировали с блочным раствором в камере влажности в течение 2 часов. Как показано в таблице 1 и на фиг. 1, инкубацию первичных антител против COX-2 и против MIF проводили по трем различным протоколам (NP1, NP2 и NP3). Эти протоколы сравнивали с двумя протоколами на основе ALEXA, которые различаются по времени инкубации первичного антитела - стандартным протоколом ALEXA (инкубация в течение ночи), принятым нашей исследовательской группой в качестве стандартного протокола для большинства процедур (A1) и модифицированным протоколом ALEXA (A2; Инкубация 30 мин). NP1 - это метод иммунофлуоресцентного окрашивания, зависимый от наночастиц, с 30-минутной первичной инкубацией. Первичные антитела разводили в 1% BSA в соотношении 1:500 (анти-COX-2) и 1:400 (анти-MIF), и каждый образец инкубировали во влажной камере при комнатной температуре (20 ° C) в течение 30 минут. . Затем к образцам добавляли 100–150 мкл AuNP, которые инкубировали при комнатной температуре (20 ° C) еще на 30 мин. Во втором протоколе, зависимом от наночастиц (NP2), первичные антитела разводили в 1% BSA и наносили непосредственно на предметные стекла, которые оставляли в холодильнике на ночь. Следовательно, A2 и NP1 являются протоколами 30-минутной инкубации, но A2 выполняется с вторичным флуоресцентным антителом (ALEXA), тогда как NP1 имеет AuNP в качестве флуорофоров. Это также относится к протоколам инкубации в течение ночи A1 и NP2. После соответствующего времени инкубации слайды каждого протокола трижды промывали PBS для удаления избытка первичных антител. Затем на каждое предметное стекло в NP2 добавляли 100–150 мкл наночастиц, а в A1 добавляли ALEXA (1:400). После 1 ч инкубации с AuNP (NP2) и ALEXA (A1) все предметные стекла были промыты трижды PBS.

Изображения окрашивания гематоксилином и эозином в контрольных группах, вызванных уксусной кислотой, и стеатогепатите, вызванном алкоголем. а Отрицательный контроль модели UC (× 100; масштабная линейка =100 мкм). б ЯК, индуцированный уксусной кислотой. Красная стрелка указывает на лейкоцитарную инфильтрацию области слизистой оболочки (× 100; масштабная линейка =100 мкм). c Отрицательный контроль стеатогепатита (× 200; масштабная линейка =50 мкм). г Алкогольный стеатогепатит. Черная стрелка указывает на инфильтрацию лейкоцитов (× 200; масштабная линейка =50 мкм)

Третий протокол (NP3) был разработан для изучения усиливающих свойств AuNP в флуоресцентных системах. В NP3 AuNP применяли во время разведения ALEXA в 1% BSA. Были протестированы три разведения вторичных антител (1:200, 1:400 и 1:800) в BSA с AuNP, чтобы сравнить интенсивности флуоресценции каждого разведения с A1. Разведения готовили таким образом, чтобы объем AuNP был пропорционален объему BSA, например, для разведения 1:200 2 мкл ALEXA разбавляли в 199 мкл AuNP + 199 мкл BSA. Время инкубации первичных антител в A1 и NP3 составляло приблизительно 18 часов (ночь), тогда как время инкубации суспензии ALEXA + AuNPs составляло 1 час.

Наконец, образцы были закреплены с использованием монтажной среды Fluoroshield с DAPI. Предметные стекла хранили в защищенном от света ящике и хранили при 4 ° C до микроскопического анализа. Флуоресцентные изображения получали с помощью вертикального микроскопа Zeiss Observer z.1 для флуоресценции и визуализации в светлом поле (объективы × 20 и × 10, Carl Zeiss, Йена, Германия) с AxioCam MRc. Параметр среднего арифметического программного обеспечения Zeiss ZEN lite blue edition (Carl Zeiss) использовался для количественной оценки интенсивности флуоресценции пиксель за пикселем для каждого изображения канала ALEXA. Было проанализировано не менее трех образцов каждого животного (по пять животных в группе) и было сделано пять снимков каждого фрагмента с объективом × 10.

Индукция M2-поляризованных ТАМ In Vitro

Для оценки конъюгированных с первичными антителами наночастиц золота (AuNP) в макрофагах M2 использовали клетки RAW 264.7 (5 × 10 ⁵ клеток / лунку в 12-луночном планшете) культивировали в полной среде с 10% фетальной бычьей сывороткой с добавлением 20 нг / мл IL-4 в течение 24 часов. После обработки IL-4 клетки трижды промывали бессывороточной средой DMEM с последующим культивированием в той же среде в течение 48 часов. Клетки анализировали с помощью светового микроскопа Telaval 31 (ZEISS, Оберкохен, Германия).

Проточная цитометрия

После инкубации с IL-4 в течение 48 часов клетки RAW 264,7 и макрофаги M2 (1,5 × 10 ⁴ клеток / лунку в 12-луночном планшете) собирали скребком и блокировали 0,5 г BSA в 100 мл PBS (PBA) в течение 45 мин с последующей инкубацией с PerCP-конъюгированными антимышиными CD163 (1:1000) и FITC. -конъюгированные антимышиные CD86 (1:1000) при 4 ° C в течение 60 мин. Кроме того, макрофаги M2 были помечены первичными антителами к ЦОГ-2 и MIF и, таким образом, конъюгированы с AuNP. M2-поляризованные ТАМ собирали и фиксировали 2% параформальдегидом в PBS в течение 10 мин с последующей инкубацией с первичными анти-COX-2 и анти-MIF (1:100) в течение 60 мин при 4 ° C и; После этого клетки метили вторичным антителом козы против кролика Alexa® Fluor 488 (Thermo Fisher Scientific) в инкубационном растворе (1:100) при комнатной температуре в течение 60 минут, как описано в стандартном протоколе Alexa [16]. В соответствии с протоколом (N1), где AuNP заменяют козье антикроличье вторичное антитело Alexa® Fluor 488, макрофаги M2 собирают, промывают PBS и инкубируют с первичными анти-COX-2 и анти-MIF первичными антителами (1:100). ) в инкубационном растворе при комнатной температуре в течение 30 мин. Затем клетки инкубировали с AuNP (1:5) при 4 ° C в течение 30 мин (возбуждение AuNP при 520 нм). После заключительной стадии промывки меченые клетки анализировали в программном обеспечении BD FACSCanto II (BD Biosciences, Нидерланды) и FlowJo (версия 10.1; Tree Star Inc., Великобритания). Все анализы проточной цитометрии были выполнены с образцами в трех экземплярах и повторены три раза. Сравнение стандартных протоколов ALEXA и AuNPs показано в таблице 2.

Статистический анализ

Дисперсионный анализ (ANOVA) и post hoc Бонферрони Тест проводился для иммунофлуоресцентного анализа. Для анализа проточной цитометрии значимые различия между группами были рассчитаны с использованием ANOVA и теста Данна, как указано. А п <0,05 считалось статистически значимым для всего проведенного анализа.

Результаты

Анализ микроскопии

На срезе на рис. 1а показан срез ткани, окрашенный гематоксилином и эозином (отрицательный контроль). Хронический воспалительный процесс, вызванный уксусной кислотой, изображен на рис. 1b, который показывает потерю структуры ткани с последующим разрушением эпителия, уменьшением бокаловидных клеток, наличием кровоизлияний и лейкоцитов рядом с поврежденными участками. На рисунке показано скопление жировых капель и воспалительный инфильтрат (нейтрофилы и лимфоциты) в печени крыс, подвергшихся хроническому воздействию алкоголя.

По интенсивности флуоресценции AuNP были похожи на ALEXA, который представляет собой обычный флуорофор для окрашивания IF. В образцах как печени, так и толстой кишки различия в интенсивности флуоресценции NP1 и NP2 были минимальными или отсутствовали по сравнению с A1. На рис. 2 показаны множественные сравнения протоколов IF, протестированных с использованием первичных антител против COX-2 и против MIF. Рисунки 2a и d демонстрируют, что интенсивности флуоресценции A2, NP1 и NP2 существенно не отличаются по сравнению с протоколом A1 (^# p > 0,05), предполагая, что протоколы 30-минутной инкубации (с использованием ALEXA или AuNP) могут быть применимы в диагностическом контексте.

Сравнение интенсивности флуоресценции между группами. а Интенсивность флуоресценции AuNPs в A2, NP1 и NP2 по сравнению с UC, индуцированным только уксусной кислотой (антитело против COX-2). б Все разведения NP3 (1:200, 1:400 и 1:800) по сравнению с интенсивностью флуоресценции A1 (1:400) -индуцированного только уксусной кислотой UC (антитела против COX-2). c Сравнение интенсивности флуоресценции животных, индуцированных уксусной кислотой, и отрицательных контролей после кратковременной (A2 и NP1) и ночной инкубации (A1 и NP2). г Интенсивность флуоресценции AuNP в A2, NP1 и NP2 по сравнению со стеатогепатитом, индуцированным только алкоголем (только антитело против MIF) A1. е Все разведения NP3 (1:200, 1:400 и 1:800) по сравнению с интенсивностью флуоресценции стеатогепатита, вызванного только алкоголем A1 (1:400) (антитело против MIF). е Сравнение интенсивности флуоресценции у животных с алкогольным стеатогепатитом и отрицательного контроля после 30-минутной инкубации (A2 и NP1) и инкубации в течение ночи (A1 и NP2). Статистика:ANOVA и апостериорный тест Бонферрони, ^# p ≥ 0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 и **** p <0,0001

Кроме того, протокол NP3 (рис. 2b, e) продемонстрировал, что можно объединить AuNP с ALEXA так, чтобы обнаруженная интенсивность флуоресценции была увеличена (*** p <0,001), что позволяет даже удвоить разведение ALEXA без уменьшения флуоресценции по сравнению с разведением 1:400, первоначально испытанным на A1 (^# p > 0,05).

Наконец, мы сравнили больные группы со здоровыми (рис. 2f), чтобы продемонстрировать, что все протестированные протоколы, либо с ALEXA, либо с AuNP, эффективны в обнаружении начала воспалительных процессов, характеризующихся антигенами COX-2 и MIF. Рисунки 3 и 4 подтверждают данные, представленные графически на рисунке 2. И ALEXA, и AuNP представлены зеленым цветом, распределение которого соответствует участкам повышенной инфильтрации лейкоцитов и повреждения тканей.

IF-изображения анти-COX-2 IF образцов толстой кишки из физиологического раствора (отрицательный контроль) и индуцированных уксусной кислотой групп UC, окрашенных зелеными флуоресцентными соединениями (ALEXA, AuNP или и тем, и другим) и DAPI (синий) для ядер. а Отрицательный контроль, окрашенный по стандартному протоколу ALEXA (A1) с анти-COX-2 и ALEXA (зеленый). б Отрицательный контроль, окрашенный по модифицированному протоколу ALEXA (A2) с анти-COX-2 и ALEXA. c Отрицательный контроль, окрашенный наночастицами протокола 1 (NP1) с анти-COX-2 и AuNP (зеленый) вместо ALEXA. г Отрицательный контроль, окрашенный наночастицами протокола 2 (NP2) с анти-COX-2 и AuNP вместо ALEXA. е Положительный контроль окрашен А1. е Положительный контроль, окрашенный А2. г Положительный контроль, окрашенный NP1. ч Положительный контроль, окрашенный NP2. я Положительный контроль, окрашенный протоколом наночастиц (NP3) с анти-COX-2 + AuNPs с ALEXA 1:200. j Положительный контроль, окрашенный NP3 (с разведением ALEXA 1:400). к Положительный контроль UC, окрашенный NP3 (с разведением ALEXA 1:800). Увеличение, × 200. Масштаб =50 мкм

ПЧ изображения анти-MIF образцов печени из групп физиологического раствора (отрицательный контроль) и алкогольного стеатогепатита, окрашенных зелеными флуоресцентными соединениями (ALEXA, AuNP или и тем, и другим) и DAPI (синий) для ядер. а Отрицательный контроль, окрашенный по стандартному протоколу ALEXA (A1) с анти-MIF и ALEXA (зеленый). б Отрицательный контроль, окрашенный по модифицированному протоколу ALEXA (A2) с анти-MIF и ALEXA. c Отрицательный контроль, окрашенный наночастицами протокола 1 (NP1) с анти-MIF и AuNP (зеленый) вместо ALEXA. г Отрицательный контроль, окрашенный наночастицами протокола 2 (NP2) с анти-MIF и AuNP вместо ALEXA. е Положительный контроль окрашен А1. е Положительный контроль, окрашенный А2. г Положительный контроль, окрашенный NP1. ч Положительный контроль, окрашенный NP2. я Положительный контроль, окрашенный наночастицами по протоколу 3 (NP3) с анти-MIF + AuNP с ALEXA 1:200. j Положительный контроль, окрашенный NP3 при разведении ALEXA 1:400. к Положительный контроль, окрашенный NP3 при разведении ALEXA 1:800. Увеличение, × 200. Масштаб =50 мкм

С точки зрения клинического применения протокол NP1 оказался наиболее перспективным, поскольку по сравнению со стандартным протоколом A1 он позволяет сэкономить 18 часов.

Проточная цитометрия:конъюгированные с первичными антителами макрофаги M2 с наночастицами золота (AuNP)

Чтобы дополнительно охарактеризовать макрофаги M2, экспрессию M1 (CD86) - и M2 (CD163)-связанных продуцентов в стимулированных IL-4 клетках RAW 264.7 анализировали с помощью проточной цитометрии. Результаты проточной цитометрии показали, что маркеры, связанные с M2, такие как рецептор CD163, были значительно выше, чем в нативных клетках (рис. 5a, c, p <0,001), в то время как экспрессия рецептора CD86 не показала никаких различий между макрофагами M2 и наивными клетками (рис. 5b, c, p > 0,05). Результаты показали, что IL-4 (20 нг / мл) успешно индуцировал изменение классических макрофагов на макрофаги M2. После этого этапа макрофаги M2 инкубировали с первичными антителами COX-2 и MIF, а затем метили AuNP, чтобы сравнить эффективность наночастиц золота, конъюгированных с первичными антителами (AuNP), со стандартным протоколом (ALEXA). Результаты показали, что наночастицы золота, конъюгированные с антителами к ЦОГ-2 и MIF (рис. 5d, f, p <0,001) или ALEXA (рис. 5e, f, p <0,001) показал более высокую интенсивность флуоресценции в макрофагах M2 по сравнению с неокрашенными образцами.

Золотые наночастицы (AuNP), конъюгированные с антителами к СОХ-2 и MIF, обладают высоким сродством на поверхности макрофагов M2. а - c Клетки RAW 264.7 стимулировали IL-4 (20 нг / мл) в течение 24 часов с последующим анализом проточной цитометрии для количественного определения количества CD163, маркера макрофагов M2, и CD86, маркера M1. г , f Либо наночастицы золота, конъюгированные с антителом к ЦОГ-2 и MIF, либо e , f ALEXA 488 показала более высокую интенсивность флуоресценции в макрофагах M2 по сравнению с неокрашенными образцами. Данные выражены как среднее ± стандартное отклонение, ^# p > 0,05, *** p <0,001, p <0,0001. Представленные репрезентативные данные о потоке взяты из экспериментов, независимо проведенных не менее трех раз

Флуоресцентная спектроскопия

Для измерения спектров излучения флуоресценции очищенных AuNP в отсутствие и в присутствии анти-COX-2 (рис. 6a), анти-MIF (рис. 6b) и ALEXA (рис. 6c) длина волны возбуждения была фиксированной. при 320 нм, а эмиссия регистрировалась в диапазоне от 650 до 900 нм. Увеличение длины волны возбуждения не привело к изменению диапазона излучения частиц, что исключило возможность процесса рассеяния. Эмиссия флуоресценции была немного увеличена с поглощением анти-ЦОГ-2 (увеличение на 11,93 ед. Поглощения (а.е.) для максимальной концентрации антител), анти-MIF (увеличение на 12,15 а.е. для максимальной концентрации антител) и ALEXA (увеличение на 3,18 ед. Для самая высокая концентрация антител) в сочетании с AuNP.

Спектры флуоресцентного излучения AuNP, возбужденных на длине волны 320 нм в присутствии анти-COX-2 ( a ), анти-MIF ( b ) и АЛЕКСА ( c ). ПЭМ-изображение сферических наночастиц, использованных в этом исследовании, показывающее их размер и распределение ( d ). Щели возбуждения и испускания составляли 10 нм. Концентрация AuNP поддерживалась постоянной на уровне 29,6 нг / мл ^-1 . . Концентрация антител составляет 100 нг / мл ^-1 . (синяя кривая), 150 нг / мл ⁻¹ (красная кривая) и 200 нг / мл ⁻¹ (зеленая кривая)

Обсуждение

Было показано, что AuNP обладают флуоресцентными свойствами благодаря своей химической структуре и размеру и могут действовать как молекулы, усиливающие флуоресцентные сигналы. Более конкретно, сама флуоресценция AuNP возникает в результате аурофильных взаимодействий на поверхности атомов золота [17, 18]. Данные на рис. 6 аналогичны результатам исследований наночастиц серебра, которые обязаны повышенной эмиссией флуоресценции конкуренции между видами адсорбента и молекулярным кислородом, растворенным в растворе. Следовательно, повышенное флуоресцентное излучение наночастиц золота можно объяснить тем фактом, что БСА адсорбируется на их поверхности [19].

Сигнал флуоресценции является функцией явления поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Следовательно, увеличение количества свободных электронов приводит к более интенсивному сигналу ППР, поскольку ППР - это коллективные колебания свободных электронов. Адсорбированный БСА предотвращает связывание свободных электронов на поверхности с молекулами кислорода, что приводит к увеличению сигнала флуоресценции [20, 21]. Анти-COX-2, анти-MIF и ALEXA могли быть адсорбированы на AuNP, тем самым предотвращая O ₂ от достижения поверхности наночастиц. Это подтверждается рис. 6, где усиление сигнала флуоресценции происходило при очень низких концентрациях различных антител. Однако стоит отметить, что ALEXA требовалась более высокая концентрация, чтобы вызвать O ₂ изоляция поверхности AuNPs.

Хронический воспалительный процесс характеризуется инфильтрацией иммунных клеток, в основном макрофагов, в места повреждения, вызванного уксусной кислотой или этанолом в соответствующей модели. Воспаление также характеризуется лейкоцит-зависимым высвобождением нескольких цитокинов и медиаторов в ответ на патоген или стрессовое состояние. Известно, что среди этих цитокинов ЦОГ-2 и MIF являются маркерами нескольких воспалительных процессов, поскольку они являются провоспалительными цитокинами. The green staining observed in Fig. 3 and Fig. 4 is due to the release of COX-2 and MIF cytokines, respectively.

In chronic UC and liver steatohepatitis, macrophages are the main cells found which can be classified into two major types:M1 macrophages and M2 macrophages. The classically activated macrophages (M1 macrophages) are proinflammatory and play a pivotal role in host defense against infection which is associated with iNOS and IL-23 production and their cell surface-expressed CD86 or HLA-DR that attract killer cells like neutrophils and/or direct Th1 (cytotoxic) responses and stimulate further M1-type responses [22]. Meanwhile, the alternatively activated macrophages (M2 macrophages) are associated with the responses to anti-inflammatory reactions as well as tissue remodeling [23]. In the tumor context, it has been documented that M2-polarized macrophages promote pro-tumor functions by production of a large array of growth factors such as COX-2 and MIF for tumor cells, which are essential for tumor proliferation [24].

It is well established that UC is an important risk factor for colonic epithelial dysplasia and adenocarcinoma [25, 26]. According to Agoff et al. [25], increased malondialdehyde (MDA) levels and upregulation of Bcl-2 during UC are potential mechanisms to explain the relationship between COX-2 overexpression and neoplastic progression. In UC, the inflammation boosts COX-2 activity, leading to genetic damage through increased production of MDA. MDA is a by-product of COX-mediated prostaglandin synthesis and lipid peroxidation, and it is also constitutively produced by COX-1. Since COX-2 upregulates Bcl-2 expression, it leads to resistance to apoptosis in UC-associated neoplasia [27].

MIF is a multipotent cytokine in the innate immune responses that contributes to hepatic injury driven by alcohol-induced steatohepatitis [28]. When steatohepatitis has developed, the liver morphology rarely goes back to normal, even after cessation. In addition, there is a higher risk of the development of cirrhosis, which is the last stage of alcoholic liver disease (ALD) before hepatocellular carcinoma (HCC) [29].

Studies show MIF presence in the sera after hepatic resection or expression in the course of liver cancer progression [30]. MIF is involved in COX-2 and PGE2 upregulation and directly promotes tumorigenesis by inhibition of p53 accumulation, which is a classic tumor suppressor gene that can promote cell cycle arrest and apoptosis in response to DNA damage [31].

In a previous study [6], we have demonstrated that AuNPs can be easily conjugated with the antibodies anti-β-catenin and anti-E-cadherin to specifically target colorectal carcinoma cells, whose clinical value can be found in an early diagnosis of cancer through non-invasive methods in body fluids such as saliva and urine. In addition, we developed a new protocol to decrease the 27 h that are usually needed for the standard protocol to about 1 h needed for our improved protocol, which makes this method eligible for a clinical colorectal cancer diagnostic.

In this study, we took advantage of the properties of AuNPs conjugated with primary antibodies and applied them for the indirect IF staining method of tissue sections. At this point, we cannot affirm whether the interaction of the antibody with the nanoparticle is purely physical or if there is a chemical bond, since the amount of antibodies used in this method are far too small to produce discernible signals in Fourier-transform infrared spectroscopy. Thus, we rely only on fluorescence data that suggest that conjugation was achieved by direct adsorption of antibodies on the AuNPs surface. Such enhancement has been rationalized in terms of competition between adsorbing species and molecular oxygen dissolved in solution, as explained before by Lima et al. [6]. We found that the replacement of ALEXA by the AuNPs in NP1 saves about 18 h (similar to A2), when compared to standard protocol and NP2 that require about 24 h, each, from the antigenic retrieval to the assembling of the slides for microscopic analysis (Fig. 7 and Table 1). The time for incubation with the primary antibody was 30 min for A2 and NP1, but overnight (18 h) for A1, NP2, and NP3 (Fig. 7a and Table 1).

Comparative schemes illustrating the immunofluorescence (a ) and flow cytometry protocols used in this study (b ). In immunofluorescence, AuNPs may be applied in 30-min incubation protocols as fluorescence-enhancing agents, providing faster results with comparable fluorescence levels to the traditional ALEXA protocol, which makes NP1 a suitable protocol for cancer diagnose. Time was counted from the antigen retrieval to the end of the second incubation. In flow cytometry, although the ALEXA marking was higher than that of the AuNPs, the N1 protocol with AuNPs allowed a greater saving of reagents as well as reduced the time required for the technique from 4 to 1 h

Moreover, we demonstrated MIF and COX-2 primary antibody-conjugated gold nanoparticles can be arranged on the surface of M2 macrophage as a fast alternative to analyze the immune profile of inflammation-induced cancer tissues by flow cytometry. Although the standard protocol is laborious, the intensity of marking to both the primary antibodies was higher than primary antibody-conjugated gold nanoparticles. However, the primary antibody-conjugated gold nanoparticles needed less reagents and the time saving was higher as seen in the standard protocol (4 h) and in primary antibody-conjugated gold nanoparticles N1 protocol (1 h) (Fig. 7b). These results suggest that M2 macrophages can be targeted with primary antibody-conjugated gold nanoparticles either to diagnosis or therapy.

The time saving, the specificity, and the low cost provided by NP1 are especially important in cancer diagnosis, when fast and accurate results are highly required. It is important to highlight that, although the models adopted for this work were based on inflammation diseases, the inflammation markers used in this study are highly cancer-correlated and AuNPs provide multiple possibilities for application in clinical research and diagnosis.

Выводы

All nanoparticle protocols tested showed similar fluorescent intensities to those observed in standard IF, extending the application of AuNPs, not only in research, but also in clinical diagnostics. When diluted with ALEXA, AuNPs allow greater dilutions with acceptable fluorescence intensity. More importantly, AuNPs can be used in faster protocols (e.g., 30-min incubation protocols), completely substituting ALEXA and providing a way to develop further technologies that will improve cancer diagnose and other diseases. We believe that these findings will contribute to advance research and diagnostic procedures that utilize IF methods as well as widen the applications of AuNPs in biotechnology.