Иммунофлуоресценция на золотых наночастицах обеспечивает быстрое, чувствительное определение биомаркеров рака, связанных с воспалением

Аннотация

Раннее обнаружение рака опирается на выявление воспалительных сигналов, предшествующих мальignanности. Оценены первичные антитела-сопряженные золотые наночастицы (AuNPs) как таргетированные контрастные агенты для хронического воспаления в моделях язвенного колита (UC) и стеатоэпатита, предрасполагающих к раку толстой кишки и печени. AuNPs (7,1 нм) синтезированы дешевым, эко-дружественным путем и сопряжены с анти-COX-2, анти-MIF и Alexa Fluor® 488 (ALEXA). Три иммунофлуоресцентных (ИФ) протокола — 30-минутный и ночной инкубации, плюс протокол усиления — сравнены со стандартным ALEXA ИФ процессом. Потоковая цитометрия (FC) использовала AuNPs для маркировки M2 макрофагов. Сопряжение достигнуто прямой адсорбцией, подтвержденной сопоставимой флуоресцентной интенсивностью с ALEXA. 30-минутный AuNP протокол сократил общее ИФ время с 23 ч до 5 ч и FC время с 4 ч до 1 ч, предлагая трудоэкономный, клинически применимый альтернативу для диагностики воспаления-опосредованного рака.

Введение

Золотые наночастицы (AuNPs) стали универсальными зондами для оптической визуализации, предлагая размерно-настраиваемые оптические свойства, высокую биосовместимость и простую функционализацию. Антитела-AuNP конъюгаты позволяют детектирование поглощения золота в живых клетках в реальном времени, облегчая точную квантификацию распределения наночастиц в состояниях болезни. Исторически коллоидное золото применяли для электронной микроскопии бактериальных антигенов, позже расширили на разные биомедицинские приложения, включая геномику, биосенсирование и фотокармическую терапию. В онкологии AuNPs усиливают флуоресцентные сигналы и рентгеновское затухание, улучшая чувствительность визуализации опухолей.

Основываясь на нашей предварительной работе, демонстрирующей AuNP-сопряженные антитела для визуализации рака толстой кишки, это исследование вводит три ИФ протокола, заменяющие обычные флуорофоры на AuNPs, тем самым ускоряя окраску и снижая расход реагентов. Также валидируем AuNPs в FC для маркировки M2 макрофагов, ключевых игроков в опухоль-ассоциированном воспалении.

Методы

Цель

Продемонстрировать, что AuNPs могут заменить обычные флуорофоры в ИФ и FC, обеспечивая более быструю, равнонадежную окраску для воспаления-опосредованных онко-биомаркеров.

Реактивы

AuCl₃, PVP (ММ 10 000), NaOH, глицерин, PBS, BSA (5 %), анти-COX-2, анти-MIF, Alexa Fluor® 488 вторичное антитело, Fluoroshield с DAPI.

Синтез и характеристика AuNPs

Сферические AuNPs (7,1 нм) получены восстановлением AuCl₃ в присутствии PVP, глицерина и NaOH, давая темно-красный коллоид. UV-Vis спектры и флуоресцентные измерения подтвердили монодисперсность и поверхностный плазмонный резонанс. Антитела адсорбировали непосредственно на AuNPs, получая стабильные конъюгаты.

Животные модели

Уксуснокислый UC у самок крыс Wistar (n = 5) и спиртоиндуцированный стеатоэпатит у самцов Wistar (n = 5) установлены по стандартным протоколам. Ткани фиксировали, вкладывали в парафин и сечениили (4 мкм) для ИФ.

Иммунофлуоресцентные протоколы

Оценены три AuNP-основанных протокола:

• NP1 (30 мин): Первичное антитело (1:500 COX-2, 1:400 MIF) инкубировали 30 мин, затем 30 мин добавление AuNPs.
• NP2 (ночной): Первичное антитело 18 ч, затем 1 ч инкубация с AuNPs.
• NP3 (усиление): ALEXA разбавлен (1:200–1:800) смешан с AuNPs; 1 ч инкубация.

Стандартные ALEXA протоколы (A1 ночной, A2 30 мин) как контролы. Сечения обрабатывали на Zeiss Observer z.1 с количественным пиксель-по-пикселю флуоресцентным анализом.

Маркировка M2 макрофагов и потоковая цитометрия

Клетки RAW 264.7 поляризовали в M2 с IL-4 (20 нг/мл) 48 ч. Клетки инкубировали с COX-2/MIF первичными антителами и маркировали либо ALEXA, либо AuNPs (протокол N1). После фиксации анализировали на BD FACSCanto II; данные обрабатывали FlowJo.

Статистический анализ

ANOVA с Bonferroni пост-хок (ИФ) и тест Данна (FC) для значимости; p < 0,05 значимо.

Результаты

Микроскопия

H&E изображения подтвердили ожидаемую воспалительную патологию. Флуоресцентная интенсивность NP1 и NP2 совпала с A1, а NP3 усилила сигнал, позволяя двукратное разбавление ALEXA без потери яркости. Короткие протоколы (30 мин) (A2, NP1) дали сопоставимую окраску с ночными стандартами, демонстрируя возможность быстрой диагностики.

Потоковая цитометрия

IL-4-поляризованные RAW клетки показали повышенный CD163 (M2 маркер) и неизменный CD86 (M1). AuNP-маркированные COX-2/MIF дали флуоресцентную интенсивность, сопоставимую с ALEXA, подтверждая эффективное поверхностное связывание и минимальный расход реагентов.

Флуоресцентная спектроскопия

AuNPs демонстрировали эмиссию 650–900 нм при возбуждении 320 нм. Адсорбция антител увеличивала флуоресценцию на ~12 усл. ед., указывая на успешное сопряжение и усиление сигнала за счет снижения кислородного качения поверхностных электронов.

Обсуждение

AuNPs обладают внутренней флуоресценцией и действуют как усилители сигнала, блокируя доступ кислорода к поверхностным электронам, тем самым усиливая поверхностный плазмонный резонанс. Сопряжение прямой адсорбцией дает простой, масштабируемый подход, избегая ковалентной химии и сохраняя активность антител. Протокол NP1 сокращает общий ИФ рабочий процесс на 18 ч, а FC время с 4 ч до 1 ч, давая существенные эффективности. Важно, что AuNPs сохраняют чувствительность к COX-2 и MIF, ключевым биомаркерам UC-ассоциированного рака толстой кишки и спирт-индуцированного стеатоэпатита-гепатоцеллюлярной карциномы. Учитывая высокую превалентность хронического воспаления в онко-риске, быстрые, стоимоэффективные методы детектирования необходимы.

Заключение

AuNP-основанные ИФ и FC протоколы дают флуоресцентную интенсивность на уровне обычных флуорофоров, при этом резко сокращая время инкубации и расход реагентов. Эти результаты открывают пути для клинического внедрения AuNPs в диагностическую патологию и потенциально в терапевтическое таргетирование M2 макрофагов.

Аббревиатуры

A1

ALEXA стандартный протокол

A2

ALEXA модифицированный протокол

ALD

Алкогольное заболевание печени

ALEXA

Alexa Fluor® 488®

AuNP

Золотые наночастицы

BSA

Бovine сывороточный альбумин

COX-2

Циклоксигеназа-2

FC

Потоковая цитометрия

FI

Флуоресцентная визуализация

IF

Иммунофлуоресценция

MDA

Мальондиальдегид

MIF

Фактор миграции макрофагов

NP1

Наночастицы протокол 1

NP2

Наночастицы протокол 2

NP3

Наночастицы протокол 3

SPR

Поверхностный плазмонный резонанс

UC

Язвенный колит