Повышение биосовместимости нановолокнистых каркасов полианилин/полилактат за счет контроля поверхностной морфологии через легирование неорганическими кислотами

Аннотация

Проводящие и биоразлагаемые нановолокнистые каркасы обладают большим потенциалом для стимуляции роста, пролиферации и дифференцировки клеток под действием внешнего электрического поля. Хотя проблема сниженной электропроводности в биологических жидкостях сохраняется, нановолокна на базе полианилина (ПАНИ) способствуют адгезии, росту и пролиферации клеток. Для изучения влияния морфологии ПАНИ мы выбрали три неорганические кислоты как допанты в процессе in situ окислительной полимеризации ПАНИ: соляную, серную и хлорную кислоты. Полученные композитные нановолокна полианилин/полилактат (ПАНИ/PLA) характеризовали методами SEM, FTIR и XPS, подтвердив, что PLA-нановолокна успешно покрыты ПАНИ без изменения пористой структуры. In vitro механические свойства и биоразлагаемость показали, что окислительные свойства кислотных допантов следует учитывать, так как они, вероятно, оказывают более высокое окислительно-деградационное воздействие на PLA-нановолокна. Тест на угол смачивания продемонстрировал, что композитные нановолокна ПАНИ/PLA с разной поверхностной морфологией обладают хорошей смачиваемостью, что соответствует требованиям к каркасам для костной тканевой инженерии. Шероховатость поверхности и жизнеспособность клеток показали, что разные морфологии ПАНИ на поверхности способствуют пролиферации клеток. Чем выше шероховатость поверхности ПАНИ, тем лучше биосовместимость. Следовательно, регулируемая поверхностная морфология композитных нановолокон ПАНИ/PLA через легирование разными кислотами положительно влияет на биосовместимость в тканевой инженерии.

Введение

Внеклеточный матрикс (ВКМ) — тип макромолекулярной сети, секретируемой клетками во внеклеточную строму. Он представляет фундамент клеток, тканей и органов, сопровождая органы, и характеризуется сложной решетчатой структурой. Кроме того, он предоставляет подходящее место для выживания и активности клеток, определяя их форму, контролируя дифференцировку, участвуя в миграции и метаболизме и в конечном счете влияя на выживание, рост и смерть. Электропрядение нановолокон может имитировать действие внеклеточного матрикса для регуляции поведения клеток благодаря их высокой удельной поверхности, подходящим механическим свойствам и биоразлагаемости. Кроме того, электропрядные нановолокна могут быть мультифункциональными за счет поверхностной модификации с сохранением пористой структуры. Поэтому электропрядные нановолокна стали перспективным материалом в тканевой инженерии, широко применяемым в доставке лекарств, регенерации костной ткани, нервной регенерации и восстановлении.

Проводящие полимеры (полипиррол [PPy], политиофен [PTH], полианилин [ПАНИ]) обладают хорошей in vitro и in vivo биосовместимостью, могут значительно влиять на адгезию, пролиферацию, дифференцировку клеток и регенерацию тканей. Среди этих полимеров ПАНИ рассматривается как потенциальный материал для тканевой инженерии и регенеративной медицины благодаря хорошей технологичности, отличной проводимости, хорошей редокс-стабильности и биосовместимости. Под электростимуляцией ПАНИ может регулировать адгезию, пролиферацию, миграцию и дифференцировку клеток. Множество отчетов заключают, что проводящие биоразлагаемые композитные нановолокна на базе ПАНИ стимулируют поведение клеток под электрическим полем. Однако это влечет за собой важную проблему: проводимость ПАНИ в физиологической среде (pH = 7,4) ослабевает из-за дедопирования ПАНИ, что, как показано ранее, уменьшает его преимущества электрической активности в стимуляции пролиферации и дифференцировки клеток. Хотя это явно представляет ограничение ПАНИ-основанных проводящих биоразлагаемых нановолокон в костной тканевой инженерии под внешней электростимуляцией, они все равно могут значительно способствовать пролиферации и росту клеток. Здесь мы предположили, что поверхностная морфология ПАНИ увеличивает шероховатость композитных нановолокон, что благоприятствует адгезии, росту и пролиферации клеток.

Полианилин, легированный неорганическими кислотами, обычно обладает хорошей электропроводностью. Однако анионы, вносимые различными неорганическими кислотными допантами, влияют на проводимость и структуру полианилина. В данной работе в качестве допантов в in situ окислительной полимеризации ПАНИ выбрали три распространенные неорганические кислоты: соляную (HCl, HA), серную (H₂SO₄, SA) и хлорную (HClO₄, PA). Затем исследовали механические свойства, смачиваемость, поверхностную морфологию, биосовместимость и адгезию клеток нановолокон ПАНИ/полилактат (PLA) при разных кислотных допантах. Результаты показали, что чем выше шероховатость поверхности ПАНИ, тем лучше пролиферация клеток, демонстрируя лучшую биосовместимость.

Методы/Эксперимент

Реактивы

Анилин (AN) приобретен в Sigma, PLA (M_w = 60 000) — в Solarbio, дихлорметан (DCM) — в Tianjin Fuyu Fine Chemical Co., Ltd., N,N-диметилформамид (DMF) — в Macklin. Персульфат аммония (APS) — в Aladdin, HCl и H₂SO₄ — в Guangzhou Chemical Co., Ltd., HClO₄ — в Macklin.

Подготовка нановолокон полианилин/полилактат

Фабрикация электропрядных нановолокон полилактата

Частицы PLA определенной массы добавляли в смешанный раствор DCM и DMF (объемное соотношение 7:3) с перемешиванием до растворения, получая 10% раствор PLA. Раствор наполняли в шприц и соединяли с высоковольтным источником питания. Электропрядная установка (DP-30, Tianjin Yunfan Technology Co., Ltd.) устанавливали на напряжение 15 кВ и расстояние 15 см. Полученные нановолокна PLA вакуумно сушили при 40 °C в течение ночи.

Подготовка нановолокон ПАНИ/PLA, легированных разными неорганическими кислотами

Нановолокна PLA помещали в камеру плазменной очистки (PCE-6, MTI Corporation, USA) и разряжали 2 мин при 30 Вт RF-мощности. В этой работе три неорганические кислоты — HCl, H₂SO₄ и HClO₄ — использовались как допанты для in situ окислительной полимеризации при подготовке нановолокон ПАНИ/PLA, соответствующие нановолокна ПАНИ маркировали как ПАНИ-HA, ПАНИ-SA и ПАНИ-PA, а нанокомпозитные нановолокна ПАНИ/PLA — как ПАНИ/PLA-HA, ПАНИ/PLA-SA и ПАНИ/PLA-PA. Процесс подготовки PLA и композитных нановолокон ПАНИ/PLA показан на Рис. 1.

Рис. 1. Схема процесса подготовки PLA и композитных нановолокон ПАНИ/PLA.

Нанокомпозитные нановолокна ПАНИ/PLA готовили в ледяной бане. APS и AN добавляли в 1 М кислотный раствор в молярном соотношении 1:1. Здесь на примере HCl иллюстрируем процесс подготовки нановолокон ПАНИ/PLA. В ледяной бане AN (930 мг, 0,01 моль) капали в APS (2280 мг, 0,01 моль), растворенный в 50 мл 1 М HCl. Сразу плазмообработанную мембрану нановолокон PLA погружали в раствор и перемешивали 2 ч при 0 °C. После реакции мембру нановолокон PLA несколько раз промывали HCl и этанолом для удаления неприкрепленного ПАНИ, затем сушили при 40 °C в течение ночи, получая нановолокна ПАНИ/PLA-HA, которые откладывали для дальнейшего использования. Нановолокна ПАНИ/PLA-SA и ПАНИ/PLA-PA получали аналогичным подходом.

Характеризация

Униаксиальные испытания на растяжение для нановолокон PLA и композитных нановолокон ПАНИ/PLA проводили на машине для испытаний на деформацию-напряжение (Shimadzu AGX-PLUS, Japan). Образец вырезали в форме «манжетки», скорость растяжения поддерживали постоянной 3 мм/мин. Модуль Юнга рассчитывали из линейной области 0–15% деформации на кривой напряжение-деформация, предел прочности и относительное удлинение при разрыве — из точки разрыва мембраны нановолокон.

Морфологию нановолокнистых каркасов характеризовали методом растерного электронного микроскопа с полевой эмиссией (FE-SEM) (Hitachi-SU8220, Japan) для наблюдения разных морфологий ПАНИ, легированного разными неорганическими кислотами. Перед SEM-наблюдением образцы нановолокон распыляли золотом 60 с для более четкого наблюдения морфологии. Поверхностную шероховатость композитных нановолокон ПАНИ/PLA измеряли атомно-силовой микроскопией (AFM, Bruker Dimension Edge). Для подтверждения полной загрузки ПАНИ на нановолокна PLA использовали Фурье-спектроскопию в ИК-области (FTIR) (Thermo Nicolet iS50) для измерения изменения длины волны 2000 ~ 500 см⁻¹. Рентгеновскую фотоэлектронную спектроскопию (XPS; Thermo ESCALAB 250) и Al-Kα как рентгеновский источник применяли для определения поверхностного состава нановолокон ПАНИ/PLA, а смачиваемость измеряли через угол контакта капель воды при комнатной температуре (OCA 15 plus, Germany). Деградацию нановолокон оценивали методом потери массы. Мембраны нановолокон вырезали в диски 16 мм и помещали в 20 мл фосфатно-буферного раствора (PBS) pH 7,4, инкубировали при 37 °C 7, 14 и 21 день и сушили до постоянной массы.

Биосовместимость композитных нановолокнистых каркасов ПАНИ/PLA

Биосовместимость

В данной работе биосовместимость композитных нановолокнистых каркасов ПАНИ/PLA характеризовали экспериментом на активность клеток человеческого остеосаркомы (HOS). Клетки HOS приобрели в банке клеток Китайской академии наук, Шанхай. Клетки HOS культивировали в низкоглюкозном модифицированном среднем Дюльбекко (DMEM) с 10% фетового бычьего сывороточного белка, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, инкубируя при 37 °C и 5% CO₂. Когда рост клеток достигал степени конфлюэнтности 90%, клетки пассажировали в соотношении 1:3.

Клетки HOS должны были быть посеяны на нановолокна ПАНИ/PLA перед тестом на пролиферацию. Нановолокна помещали в 96-лунку так, чтобы они полностью покрывали дно, затем стерилизовали УФ 30 мин и 75% раствором этанола 30 мин, промывали PBS. Нановолокна инокулировали плотностью 1×10⁴ клеток/лунку, одновременно организуя контрольную и пустую группы. Клетки инкубировали в инкубаторе при 37 °C на 1, 3 и 5 дней, среду обновляли каждые 2 дня.

Жизнеспособность клеток на нановолокнах ПАНИ/PLA оценивали MTT-тестом. После инкубации 1, 3 и 5 дней среду удаляли из 96-лунки, промывали PBS трижды, добавляли 1 мл DMEM с 10% 5 мг/мл MTT. Инкубировали при 37 °C 4 ч, удаляли среду, добавляли DMSO для растворения формазана. Вибрировали 10 мин, затем определяли абсорбцию (BioTek Synergy HTX, USA).

Флуоресцентная иммуноокраска

Клетки HOS инкубировали в инкубаторе с нановолокнами ПАНИ/PLA 24 ч, промывали PBS трижды. Затем фиксировали 4% параформальдегидом 10 мин при комнатной температуре. Фиксированные клетки промывали PBS трижды (по 10 мин), добавляли 10 мкл 100 нМ FITC-маркированного пептида, инкубировали 30 мин при комнатной температуре, промывали PBS трижды (по 5 мин). Внеклеточный актин клеток HOS окрашивали, наблюдали конфокальной микроскопией (Type A1, Nikon, Japan) при 20× увеличении.

Адгезия клеток

Адгезию клеток HOS на композитных нановолокнистых каркасах ПАНИ/PLA наблюдали SEM. Культурную среду удаляли после 24-часовой культуры HOS на нановолокнах ПАНИ/PLA, промывали PBS трижды, добавляли 4% PFA. Фиксировали на ночь при 4 °C, промывали PBS трижды, дегидратировали градиентным раствором этанола (30%, 50%, 70%, 85%, 90%, 100%; по 20 мин), затем сублимировали 24 ч. Перед SEM-наблюдением нановолокна распыляли платиной 120 с для лучшего наблюдения.

Активность щелочной фосфатазы (ALP)

ALP — один из распространенных ранних маркеров остеогенного дифференцирования, зависящий от экспрессии фермента щелочной фосфатазы. ALP-активность определяли с помощью набора ALP Assay Kit (Beyotime Biotechnology, P0321S). Клетки HOS культивировали на разных композитных каркасах ПАНИ/PLA 7 дней. Клетки лизировали 50 мкл Tris-HCl (0,1 М, pH 8) с 0,1% (v/v) тритон X-100. ALP-активность анализировали путем количественного определения концентрации p-нитрофенола из p-нитрофенилфосфата (PNPP), оцениваемой путем регистрации абсорбции при 405 нм. Процент ALP-активности клеток, культивированных на нановолокнах ПАНИ/PLA, рассчитывали путем сравнения с клетками на pristine PLA нановолокнах.

Статистический анализ

Статистическая значимость результатов оценивали однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) с помощью GraphPad Prism (версия 8.02). Анализировались различия в механических свойствах, in vitro биоразлагаемости и жизнеспособности клеток среди разных композитных нановолокнистых каркасов ПАНИ/PLA. Результаты считались значимыми при p < 0,05 (*) и высоко значимыми при p < 0,005 (**).

Результаты и обсуждение

Механические свойства тканеинженерных каркасов — важные индикаторы оценки их способности выдерживать гидродинамику. Наличие неорганических кислот может влиять на физико-химические свойства матрицы PLA композитных нановолокон ПАНИ/PLA в процессе in situ химической окислительной полимеризации ПАНИ. Поэтому изучение механических свойств композитных нановолокон ПАНИ/PLA, легированных неорганическими кислотами, необходимо. Здесь механические свойства оценивали испытанием на растяжение (Рис. 2), включая кривые напряжение-деформация, модуль Юнга, предел прочности и относительное удлинение при разрыве. Как показано на Рис. 2a, нановолокна PLA демонстрировали линейно-упругое поведение, композитные нановолокна ПАНИ/PLA-HA и ПАНИ/PLA-SA показывали явное текучее поведение, в то время как ПАНИ/PLA-PA ломались сразу после упругой деформации. Модуль Юнга (Рис. 2b) композитных нановолокон ПАНИ/PLA был выше, чем у нановолокон PLA. По сравнению с PLA, увеличение модуля упругости для ПАНИ/PLA-HA, ПАНИ/PLA-SA и ПАНИ/PLA-PA составило 53,5 ± 9,09, 60,00 ± 9,47 и 28,43 ± 8,34 МПа соответственно. Что касается предела прочности (Рис. 2c) и относительного удлинения при разрыве (Рис. 2d), то для ПАНИ/PLA-HA и ПАНИ/PLA-PA они снижались, а для ПАНИ/PLA-SA незначительно увеличивались; предел прочности и удлинение при разрыве ПАНИ/PLA-PA были наименьшими. По сравнению с нановолокнами PLA, предел прочности ПАНИ/PLA-HA и ПАНИ/PLA-PA снизился на 0,15 ± 0,01 и 0,64 ± 0,03 МПа соответственно, а ПАНИ/PLA-SA незначительно увеличился на 0,13 ± 0,05 МПа. Относительное удлинение при разрыве ПАНИ/PLA-HA и ПАНИ/PLA-PA снизилось на 16,93 ± 1,38% и 35,42 ± 3,94% соответственно, а ПАНИ/PLA-SA увеличилось на 3,32 ± 0,13%.

Рис. 2. Механические свойства нановолокон PLA и композитных нановолокон ПАНИ/PLA. а репрезентативные кривые напряжение-деформация, б модуль Юнга, в предел прочности при разрыве, г удлинение при разрыве.

Как показано на Рис. 2, выбранные неорганические кислоты могут увеличить модуль упругости нановолокон PLA за счет связи покрытия ПАНИ. В плане предела прочности и удлинения при разрыве, по сравнению с нановолокнами PLA, механические свойства ПАНИ/PLA-HA и ПАНИ/PLA-SA варьировались в разной степени, в то время как ПАНИ/PLA-PA снижались наиболее ясно, и при нагрузке во время испытания разрыв происходил менее чем за 5 с. Эти результаты могут быть связаны с окислительностью HClO₄, приводящей к расщеплению эфирной связи в молекулярной цепи PLA и окислительному разложению карбоксильной группы, что ведет к ухудшению механических свойств. Тем временем, разные механические свойства ПАНИ/PLA-HA и ПАНИ/PLA-SA могут относиться к разной плотности ПАНИ, легированного HCl и H₂SO₄, а внесение APS в процесс реакции также могло незначительно повлиять на нановолокна PLA, совокупный эффект этих факторов проявлял разные механические свойства.

Адгезия, пролиферация и дифференцировка клеток зависят от морфологии, причем шероховатая поверхность общепринято считается благоприятной для адгезии клеток. Гидрофобность нановолокон PLA подразумевает, что равномерная полимеризация ПАНИ представляет барьер, тогда как поверхностная обработка PLA нановолокон плазмой может значительно улучшить смачиваемость. После in situ полимеризации ПАНИ с разными неорганическими кислотными допантами получали композитные нановолокна ПАНИ/PLA с равномерным поверхностным осаждением.

Морфология ПАНИ на поверхности разных нановолокон ПАНИ/PLA наблюдалась FE-SEM (Рис. 3). На рисунке четко видно, что поверхность нановолокон PLA покрыта множеством неправильных наночастиц, и композитные нановолокна ПАНИ/PLA, легированные неорганическими кислотами, способны сохранять хорошую волокнистую морфологию и пористую нановолокнистую структуру. Наблюдения морфологии показали, что композитные нановолокна ПАНИ/PLA успешно загружены ПАНИ, что создало основу для адгезии и пролиферации клеток. Тем временем AFM использовали для измерения поверхностной шероховатости композитных нановолокон ПАНИ/PLA (Рис. 4). Ra, среднее значение шероховатости в трех разных позициях каждого образца, обычно используется для оценки шероховатости поверхности. Кроме того, Ra композитных нановолокон ПАНИ/PLA был выше, чем у нановолокон PLA, и Ra ПАНИ/PLA-PA был наивысшим. Этот рост шероховатости ускорял увеличение поверхностной площади и полярности, потенциально предоставляя больше мест для роста клеток и способствуя адгезии.

Рис. 3. Морфология а нановолокон PLA, б ПАНИ/PLA-HA, в ПАНИ/PLA-SA и г ПАНИ/PLA-PA композитных нановолокон.

Рис. 4. AFM-изображение и поверхностная шероховатость (Ra) а нановолокон PLA, б ПАНИ/PLA-HA, в ПАНИ/PLA-SA и г ПАНИ/PLA-PA композитных нановолокон.

Адгезия, миграция и пролиферация клеток значительно влияют на смачиваемость каркасов. Обычно смачиваемость оценивают через угол контакта между каркасом и водой. Учитывая гидрофобность PLA, измеряли угол контакта капель воды на мембране нановолокон в течение 1 с (Рис. 5). Углы контакта ПАНИ/PLA нановолокон после обработки значительно снизились. Соответствующие углы контакта PLA, ПАНИ/PLA-HA, ПАНИ/PLA-SA и ПАНИ/PLA-PA составили 112°, 61,6°, 36,7° и 37,2° соответственно. Морфология ПАНИ ПАНИ/PLA увеличила поверхностную энергию системы, площадь контакта увеличилась при первом контакте с водой, что привело к снижению угла контакта и улучшению смачиваемости. Угол контакта композитных нановолокон стал 0° через 5 с контакта с водой, демонстрируя хорошую гидрофильность. Этот гидрофильный каркас также создавал благоприятные условия для адгезии и диффузии клеток, так как кислородсодержащие функциональные группы (–OH и –COOH) на поверхности PLA были сильнее связаны с поверхностью нановолокон после плазменной обработки, и морфология ПАНИ и кислородсодержащие группы действовали вместе, обеспечивая полное смачивание композитных нановолокон ПАНИ/PLA.

Рис. 5. Угол контакта а нановолокон PLA, б ПАНИ/PLA-HA, в ПАНИ/PLA-SA и г ПАНИ/PLA-PA композитных нановолокон.

FTIR-спектры чистого ПАНИ и композитных нановолокон ПАНИ/PLA, легированных разными неорганическими кислотами, показаны на Рис. 6. В спектре чистого легированного ПАНИ (Рис. 6a) сильные характерные пики при 1565, 1485, 1298 и 1125 см⁻¹ соответствуют растяжению C=C хиноидных колец и растяжению C=C, C–N, =C–H бензоидных колец соответственно. В спектре чистого легированного ПАНИ (Рис. 6b), помимо характерного пика ПАНИ, виден пик PLA (растяжение C–O при 1092 и 1184 см⁻¹, растяжение C=O при 1757 см⁻¹). Эти результаты указывают на успешную загрузку ПАНИ на поверхность нановолокон ПАНИ/PLA, легированных неорганическими кислотами. Для дальнейшего исследования химического состава нановолокон ПАНИ/PLA использовали XPS для анализа поверхностного состава. На XPS-спектрах (Рис. 7a) четко видны пики N1s ~ 400 эВ в композитных нановолокнах ПАНИ/PLA. Более того, пики Cl2p ~ 200 эВ видны в ПАНИ/PLA-HA и ПАНИ/PLA-PA, причем интенсивность пика Cl2p в ПАНИ/PLA-PA выше, чем в ПАНИ/PLA-HA. Пик S2p появляется ~ 210 эВ в ПАНИ/PLA-SA. XPS-спектры указали, что Cl⁻, SO₄²⁻ и ClO₄⁻ были залеплены в соответствующие нановолокна ПАНИ/PLA. Кроме того, иминные атомы азота ПАНИ полностью или частично окислялись, образуя ряд окислительных состояний с разной степенью протонирования. Изменения окислительного состояния и уровня протонирования ПАНИ измеряли через ядерные спектры N1s (Рис. 7b–d). Каждый спектр N1s можно деконволюционировать на четыре основных компонента с энергиями связи примерно 398,7, 399,6, 400,4 и 401,8 эВ, атрибутируемыми к хиноидному имину (–N=), бензоидному амину (–NH–), протонированному амину (–N⁺) и протонированному имину (=N⁺) соответственно. Ссылка на исследование Кумара указывает, что подогоняемый пик спектра N1s влияет заряд в анионах, связанных протонированными N-атомами, что приводит к делокализации и незначительному сдвигу.

Рис. 6. FTIR-спектры а ПАНИ, б PLA и композитных нановолокон ПАНИ/PLA.

Рис. 7. XPS-спектры (а) подготовленных композитных нановолокнистых каркасов ПАНИ/PLA и ядерные сигналы N1s для ПАНИ/PLA-HA (б), ПАНИ/PLA-SA (в) и ПАНИ/PLA-PA (г).

Как шаблон для восстановления и регенерации тканей, биоактивные каркасы деградируют и выводятся из организма после индуцированного клеток и тканей восстановления. В данной работе деградационные свойства нановолокнистых каркасов оценивали методом потери массы (Рис. 8). Потеря массы всех образцов увеличивалась на 7, 14 и 21 день. Скорости потери массы нановолокон PLA составляли 4,34 ± 0,41%, 7,84 ± 1,57% и 12,65 ± 0,83% соответственно. Тем временем потеря массы композитных нановолокон ПАНИ/PLA-PA постепенно увеличивалась после in situ окислительной полимеризации, скорости потери массы на 7, 14 и 21 день составляли 31 ± 2,15%, 34 ± 1,86% и 40 ± 2,54% соответственно, что значительно выше, чем у ПАНИ/PLA-HA и ПАНИ/PLA-SA. В процессе in situ окислительной полимеризации ПАНИ присутствие окислителя APS могло разрушить эфирную связь в PLA и индуцировать реакцию гидролиза, образуя микротрещины в нановолокнах PLA. С увеличением времени иммерсии в PBS микротрещины постепенно накапливались, и матрица PLA начинала постепенно деградировать. Поверхностный ПАНИ также отслаивался, приводя к потере качества нановолокон. Со временем коэффициент потери массы становился более очевидным. Здесь сильное окисление HClO₄ усугубляло деградацию PLA и ускоряло потерю массы нановолокон ПАНИ/PLA-PA, что согласуется с механическими свойствами на Рис. 2.

Рис. 8. Деградационные свойства PLA и нановолокон ПАНИ/PLA.

Биосовместимость биоактивных каркасов — основа для стимуляции адгезии, роста и пролиферации клеток. Здесь изучали пролиферацию HOS на PLA и композитных нановолокнах ПАНИ/PLA для иллюстрации сопутствующей адгезии и биосовместимости. Во время химической обработки и функционализации ряд потенциальных влияющих факторов мог играть роль в подготовке биоактивных каркасов. Поэтому исследование их биосовместимости ключево для оценки практического применения.

Для исследования биосовместимости композитных нановолокон ПАНИ/PLA их жизнеспособность клеток оценивали MTT-методом. Рис. 9 показывает активность клеток, инкубированных на PLA и композитных нановолокнах ПАНИ/PLA после 1, 3 и 5 дней. На рисунке четко видно, что с продлением времени инкубации активность клеток на нановолокнах постепенно возрастала; клетки ПАНИ/PLA-PA демонстрировали наилучшую активность, а активность после 5-дневной культуры была наивысшей.

Рис. 9. Жизнеспособность HOS, культивированных 1, 3 и 5 дней на нановолокнах PLA и композитных нановолокнах ПАНИ/PLA (*p < 0,05; **p < 0,005).

PLA биоразлагаем, но гидрофобен, что не способствует адгезии, росту и пролиферации клеток. После плазменной обработки поверхность композитных нановолокон ПАНИ/PLA была загружена кислородсодержащими группами, функциональная поверхность демонстрировала хорошую гидрофильность. Вышеуказанные результаты морфологии и AFM указывают, что ПАНИ, легированный разными неорганическими кислотами, демонстрировал разные морфологии и уровни шероховатости на поверхности нановолокон PLA. Тем временем композитные нановолокна ПАНИ/PLA проявляли отличную смачиваемость. Поэтому мы считали, что разные морфологии ПАНИ, легированного неорганическими кислотами, привели к повышению поверхностной энергии и полярности композитных нановолокон ПАНИ/PLA, что, в свою очередь, повлияло на рост, миграцию и пролиферацию клеток, улучшая показатели клетковой активности.

Для дальнейшего изучения поведения клеток на композитных нановолокнах ПАНИ/PLA рост и адгезия на нановолокнах наблюдались флуоресцентной иммуноокраской (Рис. 10) и SEM (Рис. 11). Сравнивали актин и морфологию клеток на поверхности разных нановолокон. Когда клетки росли на PLA волокнах и нановолокнах ПАНИ/PLA, актиновые пучки демонстрировали хорошее растянутое состояние. Плотность клеток на композитных нановолокнах ПАНИ/PLA была выше, чем на нановолокнах PLA контрольной группы, причем плотность роста клеток следовала порядку: ПАНИ/PLA-PA > ПАНИ/PLA-SA > ПАНИ/PLA-HA. Клетки HOS росли на нановолокнах ПАНИ/PLA и адгерировали в плоской многополлярной форме. Четко видно, что многие клетки встраивались в поры ПАНИ/PLA волокон, но на PLA нановолокнах были слабо растянуты и не могли полностью раскрыться. Эти результаты указывают, что композитные нановолокна ПАНИ/PLA могут способствовать адгезии и пролиферации клеток HOS.

Рис. 10. Флуоресцентные микрографические изображения на а нановолокнах PLA, б ПАНИ/PLA-HA, в ПАНИ/PLA-SA и г ПАНИ/PLA-PA композитных нановолокнах после 24-часовой инкубации.

Рис. 11. SEM-микрографии HOS, посеянных на а нановолокнах PLA, б ПАНИ/PLA-HA, в ПАНИ/PLA-SA и г ПАНИ/PLA-PA композитных нановолокнах после 24 ч.

Тем временем результаты иммунофлуоресцентной окраски и адгезии клеток указали, что разные морфологии ПАНИ на поверхности композитных нановолокон ПАНИ/PLA влияли на рост, адгезию и пролиферацию клеток HOS, что согласуется с вышеприведенными результатами.

Как ранний остеогенный маркер, ALP-тест проводили на каркасах PLA и композитных нановолокнах ПАНИ/PLA 7 дней. По сравнению с чистыми нановолокнами PLA, результат (Рис. 12) показал, что ALP-активность значительно улучшилась на композитных нановолокнах ПАНИ/PLA. Очевидно, ALP-активность композитных нановолокон ПАНИ/PLA-PA лучшая. Эти результаты доказали, что композитные нановолокна ПАНИ/PLA проявляют лучшую биосовместимость, что согласуется с вышеприведенными результатами адгезии, роста и пролиферации клеток.

Рис. 12. Активность щелочной фосфатазы на каркасах композитных нановолокон ПАНИ/PLA (ns = незначимо).

Заключение

В данной работе композитные нановолокна ПАНИ/PLA с разной поверхностной морфологией были подготовлены тремя типами неорганических кислот как допантом в in situ полимеризации. Мы подтвердили, что ПАНИ может быть успешно загружен на поверхность PLA без изменения пористой структуры нановолокон. Эксперименты по механическим свойствам и in vitro деградации продемонстрировали, что окисляющие кислоты могут значительно ослабить механические свойства и ускорить деградацию полиэфирных нановолокон. Тем временем более шероховатая поверхность приводила к лучшей смачиваемости и способствовала адгезии, росту и пролиферации клеток, что указывало на лучшую биосовместимость. В заключение, регулируемая морфология ПАНИ через легирование разными кислотами положительно влияет на биосовместимость в тканевой инженерии.

Доступность данных и материалов

Авторы заявляют, что материалы и данные доступны читателям без излишних условий для соглашений о передаче материалов. Все данные, полученные или проанализированные в ходе этого исследования, включены в эту статью.

Аббревиатуры

ПАНИ:

Полианилин

PLA:

Полилактат

ВКМ:

Внеклеточный матрикс

PPy:

Полипиррол

PTH:

Политиофен

AN:

Анилин

DCM:

Дихлорметан

DMF:

N,N-диметилформамид

APS:

Персульфат аммония

HOS:

Клетки человеческого остеосаркомы

DMEM:

Модифицированное среднее Дюльбекко

PBS:

Фосфатно-буферный раствор

MTT:

3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2H-тетразолиевый бромид

FITC:

Флуоресцеин изотиоцианат

FTIR:

Фурье-спектроскопия в ИК-области

FE-SEM:

Растровый электронный микроскоп с полевой эмиссией

XPS:

Рентгеновская фотоэлектронная спектроскопия

ALP:

Щелочная фосфатаза